C.d.L. Scienze Biosanitarie e Farmaceutiche Corso di Microbiologia e Biotecnologie dei Microrganismi

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1 C.d.L. Scienze Biosanitarie e Farmaceutiche Corso di Microbiologia e Biotecnologie dei Microrganismi AA ANTIBIOTICI 1 AGENTI IMPIEGATI PER IL CONTROLLO 1

2 Metodologie di valutazione dell attività dei farmaci antimicrobici Agar diffusione (metodo qualitativo - CLSI m2a7) Microdiluizione e macrodiluizione (quantitativo - CLSI m7a6) Agar diluizione (quantitativo - CLSI m7a6) E test (quantitativo) Bioautografia (qualitativo) Metodo colorimetrico (quantitativo) Metodo spettrofotometrico (quantitativo)

3 Documento del NCCLS (dicembre 1993) relativo alle procedure di valutazione quantitativa della sensibilità agli antimicrobici di batteri aerobi

4 La collezione internazionale ATCC garantisce l uso di ceppi geneticamente stabilizzati nelle procedure valutative

5 Agar diffusione

6 Agar diffusione

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10 Piastra antibiogramma

11 Mic schema 1

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13 Mic

14 MBC

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17 Tecnica di MICRODILUIZIONE su piastra di microtitolazione (microtiter) INGRANDIMENTO POZZETTI Inibizione della crescita

18 Sistema di valutazione Microscan per l identificazione e la valutazione della concentrazione minima inibente

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22 Valori di sensibilità

23 Valori di sensibilità

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26 Metodologie di valutazione : agar diffusione Apparecchiatura automatica della valutazione del diametro dell alone di inibizione.

27 Le Labiatae : attività antimicrobica Rosmarino Salvia Basilico Timo Origano Maggiorana Verbena odorosa Basilico Maggiorana Origano Salvia Verbena Rosmarino Timo odorosa

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29 Visualizzazione e determinazione della MIC nella tecnica dell Agar diluizione Ceppo in crescita normale rispetto al controllo: si può notare l omogeneità di crescita delle colonie e la regolarità della patina batterica. La sostanza non è attiva. La presenza di un numero di colonie maggiore di 5 indica che la sostanza è poco attiva su questo ceppo. La presenza di una singola colonia indica l inibizione completa del ceppo: la sostanza risulta attiva.

30 AGAR DILUIZIONE Geraniolo 1 ml Diluizioni seriali in fase solida (a caldo) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 210 µl di Geraniolo 877 mg/ml 1 ml MHA (YMA) + 0.5% Tween 20 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Ogni piastra contiene 19 ml MHA (YMA) 4.60 mg/ml 2.30 mg/ml 1.15 mg/ml 0.57 mg/ml 0.29 mg/ml 0.14 mg/ml Controllo di crescita positivo

31 Sostanza Tecnica Gram + Gram - Funghi Eucaliptolo Micd + +/- +/- Eucaliptolo Adm + +/- +/- Basilico Aboca Adm +/- +/- +/- Bornilacetato Adm na na na Canfene Adm na na na Canfora Micd na na na Carvacrolo Micd Citronellolo Adm Geranio Ftm Adm Geraniolo Adm Maggiorana Aboca Micr +/- +/- + Melaleuca Named Adm Menta Piperita Aboca Adm Mentolo Adm Mentone Adm Mirto Nce Adm + + +/- Origano Aboca Micd Rosmarino Aboca Micd +/- +/- +/- Rosmarino Campus Micd + + +/- Rosmarino Puglia Micd +/- +/- Salvia Aboca Micd +/- +/- +/- Timo Aboca Micd Timolo Micd Triacetina Adm +/- +/- +/- Attività antimicrobica (Adm/Micd) Attività antimicrobica : : inferiore a 1 mg/ml. + + : compresa tra 1 mg/ml e 5 mg/ml. + : compresa tra 5 mg/ml e 10 mg/ml. +/- : compresa tra 10 mg/ml e 45 mg/ml. na : nessuna attività

32 Valutazione quantitativa : microdiluizione e agardiluizione Valutazione dell attività antimicrobica degli oli essenziali Valutazione qualitativa: agardiffusione

33 Microdiluizione La microdiluizione viene impiegata quando il prodotto da valutare presenta caratteristiche fisiche di polarità. E sempre presente tuttavia il rischio, di valutare inattivi (falsi negativi) prodotti che pur avendo una forte capacità antimicrobica, a causa delle loro caratteristiche chimico fisiche non sono ben solubilizzati e quindi non agiscono. I problemi nell allestimento del metodo per le sostanze oleose sono difficili da superare anche ricorrendo a tecniche di sonicazione, aggiunta di tensioattivi o riscaldamento. Possibilità che alcuni componenti presenti negli oli essenziali siano legati dal polistirene del microtiter (Hammer, 2003), con conseguente inattivazione della loro eventuale capacità antimicrobica.

34 Agardiluizione Gli aerobi eventualmente contaminanti non riescono a svilupparsi in agar solido. La presenza di una contaminazione è subito riconosciuta. L uso del calore facilità l omogeneizzazione del prodotto all interno del terreno agarizzato. Al terreno agarizzato può essere aggiunto in fase di preparazione un tensioattivo (tween 20) in bassa percentuale, per migliorare la solubilità dell olio essenziale. L assoluta impossibilità nel distinguere un azione microbicida da un azione microbistatica. Costi elevati nella gestione del materiale impiegato per ogni singolo esperimento. Difficoltà nella gestione di spazi sufficienti all utilizzo del metodo.

35 Agardiluizione Per le caratteristiche illustrate, la tecnica di Agardiluizione è decisamente più idonea alla valutazione quantitativa dell attività antimicrobica di sostanze oleose rispetto alla microdiluizione. Per ottenere una migliore solubilità del prodotto sottoposto ad indagine, abbiamo modificato la tecnica rispetto al protocollo originale (CLSI, M7A6, 2003), introducendo all occorrenza: la sonicazione, la diluizione a caldo in terreno agarizzato allo stato liquido (44-50 C), e l uso di un tensioattivo a concentrazioni ottimali.

36 Sostanza Tecnica Gram + Gram - Funghi Eucaliptolo Micd + +/- +/- Eucaliptolo Adm + +/- +/- Basilico Aboca Adm +/- +/- +/- Bornilacetato Adm na na na Canfene Adm na na na Canfora Micd na na na Carvacrolo Micd Citronellolo Adm Geranio Ftm Adm Geraniolo Adm Maggiorana Aboca Micr +/- +/- + Melaleuca Named Adm Menta Piperita Aboca Adm Mentolo Adm Mentone Adm Mirto Nce Adm + + +/- Origano Aboca Micd Rosmarino Aboca Micd +/- +/- +/- Rosmarino Campus Micd + + +/- Rosmarino Puglia Micd +/- +/- Salvia Aboca Micd +/- +/- +/- Timo Aboca Micd Timolo Micd Triacetina Adm +/- +/- +/- Attività antimicrobica (Adm/Micd) Attività antimicrobica : : inferiore a 1 mg/ml. + + : compresa tra 1 mg/ml e 5 mg/ml. + : compresa tra 5 mg/ml e 10 mg/ml. +/- : compresa tra 10 mg/ml e 45 mg/ml. na : nessuna attività

37 conclusioni Il metodo dell agardiluizione appare ottimale nella valutazione dell attività antimicrobica di sostanze di origine vegetale di natura lipofila come gli oli essenziali. Il risultato dell integrazione tra le acquisizioni provenienti dal nostro laboratorio e i dati forniti da vari gruppi di ricerca ci consente una valutazione più accurata dell attività antimicrobica del prodotto vegetale e dei suoi principali componenti sottoposti ad indagine.