A cura del Prof. Giuseppe Criseo

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1 Corso di Laurea in Scienze Biologiche LABORATORIO DI BIOLOGIA SPERIMENTALE Anno accademico Programma svolto presso il Dipartimento di Scienze della Vita Sezione di Scienze Microbiologiche Genetiche e Molecolare Università di Messina A cura del Prof. Giuseppe Criseo Protocollo Tests di sensibilità dei microrganismi ai chemio-antibiotici: a) Concentrazione minima inibente (CMI o MIC), b) Antibiogramma. a) Determinazione della concentrazione minima inibente mediante tecnica della diluizione in brodo nutritivo. Materiale necessario: - Provette da batteriologia sterili (7-10 o più). - Portaprovette a più posti. - Pipette sterili da 1 ml. - Puntali sterili da 10 l e 1000 l - Soluzione fisiologica sterile - Terreno colturale Mueller-Hinton-Broth(MHB)* - Standard di Mc Farland 0,5 ^. - Soluzione madre del chemio-antibiotico (orientativamente g/ml o U/ml) o di altro biocida da saggiare.

2 - Brodocoltura di 16-18h del microrganismo in esame, standardizzata a circa 5-7,5x105 batteri/ml, ottenuta per confronto con uno standard di Mc Farland 0.5 e successiva diluizione 1:200 in soluzione fisiologica sterile. Strumenti: -Becco Bunsen. -Agitatore Vortex. -Termostato regolato a C. - Pipette a volume variabile - Micropipetta automatica a volume fisso P10. Allestimento delle diluizioni del chemio-antibiotico o di altro biocida da saggiare: distribuire sterilmente tramite pipetta, 1 ml di terreno MHB nelle provette. Aggiungere alla prima provetta altri 0,6 ml di MHB e 0,4 ml di soluzione madre del prodotto da saggiare. Dopo opportuna agitazione mediante Vortex trasferire 1 ml nella seconda provetta (diluizione a raddoppio). Continuare allo stesso modo con le altre provette scartando alla fine 1 ml dell ultima diluizione. Una provetta servirà come controllo della vitalità del microrganismo in esame. Esecuzione della prova: -Inoculare in ogni provetta, compresa quella destinata al controllo della crescita, 0,01 ml di brodocoltura standardizzata del microrganismo in esame; -omogenizzare le sospensioni mediante vortex -incubare a 37 C per 16-18h. Lettura dei risultati: a) Brodo nutritivo torbido = crescita microbica, b)brodo nutritivo limpido = inibizione della crescita. La concentrazione minima inibente o MIC o CMI, sarà data dalla piu alta diluizione di chemio-antibiotico o altro biocida in grado di inibire la crescita del microrganismo in esame (brodo nutritivo limpido).

3 Uno dei metodi attualmente più in uso per la determinazione delle MIC

4 b) Antibiogramma mediante metodo della diffusione in agar. Metodo di Kirby-Bauer: Materiale necessario: -Piastre Petri da 90 mm diam. contenenti 25 ml circa di Mueller-Hinton Agar MHA* (spessore 4 mm). -Tamponi sterili. -Pinzette sterilizzabili -Ansa di platino. -Provette da batteriologia contenenti 4 ml di Triptic Soy Broth-TSB o altro brodo nutritivo idoneo. -Isolamento in piastra Petri del microrganismo in esame (coltura di 16-18h). -Dischetti di antibiotici (Multodisk). -Standard di Mc Farland 0,5 ^. Strumenti: -Becco Bunsen. -Termostato regolato a 37 C. -Calibro o decimetro. -Agitatore Vortex. Preparazione dell'inoculo: Prelevare il microrganismo in esame da 4-5 colonie ben isolate, provenienti da una coltura di 16-18h e inocularlo in 4 ml di TSB. Incubare 4-6 h a 37 C. Standardizzare l inoculo fino al punto 0,5 di Mc Farland(1-1,5x10 8 batteri/ml circa). Esecuzione della prova: -Immergere nell inoculo standardizzato un tampone sterile, -eliminare l eccesso di liquido premendo leggermente il tampone contro le pareti interne della provetta,

5 -seminare con il tampone tutta la superficie di una piastra Petri contenente il terreno colturale agarizzato MHA secondo tre piani almeno (ad es. partendo da un estremità della piastra, procedere con movimenti a zig-zag molto stretti fino a completare tutta la superficie, ruotare la piastra di 60 e rifare la stessa operazione, ruotare nuovamente la piastra di 60 e ripetere ancora). -lasciare asciugare la superficie del terreno per 15' circa. -prelevare sterilmente mediante pinzetta i dischetti dei chemio-antibiotici ed applicarli sulla superficie agarizzata avendo cura che ogni dischetto aderisca perfettamente (premere leggermente sulla superficie di ogni dischetto con la punta della pinzetta sterile). -lasciare le piastre a temperatura ambiente per circa 15' per far avvenire la diffusione degli antimicrobici e quindi incubarle, capovolte, a C per una notte (16-18h circa). -misurare il diametro degli aloni di inibizione con un decimetro o meglio con un calibro servendosi, per facilitare la lettura, della luce incidente di una sorgente luminosa. Interpretazione dei risultati: Il microrganismo in esame verrà considerato resistente, moderatamente sensibile (intermedio) o sensibile ad un determinato chemio-antibiotico, in base al diametro dell'alone di inibizione prodotto (vedi tab. I). ^ Standard di Mc Farland 0.5 (0,5 ml di BaCl2 0,048 M (1,175%) + 99,5 di H2SO4 0,36 N (1%) corrispondente a circa 1-1,5x10 8 batteri/ml. *Mueller-Hinton Broth (MHB) Mueller-Hinton Agar (MHA) Infuso di carne di manzo 300,0 g Aggiungere al MHB: Idrolisato di caseina 17,5 g Agar 17 g Amido solubile 1,5 g H2O distillata 1000 ml Sciogliere i componenti distribuire nei recipienti d uso e sterilizzare a 121 C per 15.

6 Corso di Laurea in Scienze Biologiche LABORATORIO DI BIOLOGIA SPERIMENTALE Anno accademico 2007/2008 Esperienze di Microbiologia Concetti generali sullo studio dell attività antimicrobica di chemioantibiotici e altri biocidi. A cura del Prof. Giuseppe Criseo Scopo dei tests di valutazione dell attività antimicrobica dei chemioantibiotici o di altri biocidi è quello di stabilire se un dato microrganismo è sensibile o meno ad un determinato agente chimico, quale è la concentrazione adatta a controllare la sua crescita, e quale delle sostanze chimiche disponibili è da preferire in una specifica occasione. Esiste in commercio un gran numero di sostanze chimiche ad azione antimicrobica. I loro possibili siti di azione sono rappresentati dalle molecole biologiche e dalle strutture costituenti la stessa cellula microbica. Per quanto concerne il meccanismo d azione occorre ricordare che essi possono causare: il danneggiamento delle pareti cellulari, l alterazione della permeabilità delle membrane cellulari, l alterazione delle proteine strutturali e degli acidi nucleici, l inibizione degli enzimi cellulari, della sintesi proteica e degli acidi nucleici. Risulta utile una divisione fra gli agenti chimici il cui effetto sugli equilibri interni cellulari è reversibile, e quelli il cui effetto è irreversibile. Se la loro azione provoca inibizione della crescita dei microrganismi senza provocare danni irreversibili viene definita microbiostatica, se l azione causa danni irreversibili viene definita microbicida. E comunque da evidenziare che non esiste una netta distinzione fra azione microbiostatica e microbicida poichè spesso la differenza è di tipo

7 quantitativo e non qualitativo (dipende cioè dalla concentrazione dell antimicrobico). Il tipo di azione svolto dall' agente antimicrobico viene indicato precisando quale sia il microrganismo o i microrganismi sensibili ed aggiungendo il suffisso -statico o -cida (batteriostatico / battericida, fungistatico / fungicida, virustatico /virucida,sporastatico / sporicida). L' enorme varietà e la variabilità dei microrganismi e il loro diverso grado di sensibilità ai vari prodotti antibiomicrobici ci obbliga ad utilizzare delle metodiche "in vitro" che consentono di orientarci nella scelta dell' antimicrobico più adatto alle varie situazioni verificando se i microrganismi sono più o meno sensibili ad uno o più prodotti antimicrobici e qual'è la concentrazione di antimicrobico necessaria per ottenere l' azione inibente o biocida. Il metodo ideale per la determinazione "in vitro" della sensibilità microbica ai vari biocidi dovrebbe possedere i seguenti requisiti: - essere applicabile allo studio di tutti i microrganismi - essere di semplice esecuzione - essere riproducibile in ogni situazione - dare risultati in tempi brevi - permettere contestualmente di verificare la presenza di eventuali microrganismi contaminanti - indicare se l' attività del prodotto è batteriostatica o battericida Tra i metodi esistenti nessuno risulta soddisfacente per tutte le sostanze chimiche o per le diverse condizioni d'impiego. Ciò è dovuto al fatto che vi sono vari fattori di cui bisogna tenere conto quando si devono eseguire i tests di sensibilità. I fattori di cui bisogna tenere conto sono relativi a : - agente chimico: natura chimica, concentrazione, solubilità - microrganismo: specie microbica, numero dei microrganismi, stato fisiologico - ambiente: la presenza di materia organica può ridurre o annullare l' efficacia del prodotto combinandosi con esso o impedendo il contatto col microrganismo; il ph del mezzo influenza notevolmente l' azione dell' antimicrobico - temperatura: un' aumento della temperatura favorisce l'azione dell' agente antimicrobico accelerando la morte dei microrganismi

8 - tempo di contatto: entro certi limiti, maggiore è il tempo di contatto più efficace è l'azione dell' antimicrobico. Tra i tanti metodi (classici, moderni, automatizzati), utilizzati per la determinazione dell' attività dei vari biocidi sui microrganismi, abbiamo scelto per gli studenti del laboratorio biologico II, i due metodi che meglio si prestano allo scopo didattico: Il metodo delle diluizioni (M.I.C- Minimum Inhibitory Concentration o C.M.I- Concentrazione Minima Inibente) e il metodo di diffusione in agar (Antibiogramma). Metodo delle diluizioni (M.I.C- Minimum Inhibitory Concentration o C.M.I- Concentrazione Minima Inibente). Storicamente la diluizione in brodo è stata la prima tecnica impiegata per saggiare la sensibilità batterica agli antimicrobici. Questa tecnica, estremamente precisa e riproducibile è oggi da riservare, nella sua versione in provetta, soltanto a scopi di ricerca per la sua indaginosità; risultano infatti fastidiosi la preparazione e la conservazione in laboratorio delle diluizioni "madre" dei vari antibiotici specialmente di quelli a breve conservazione, inoltre comporta una notevole perdita di tempo l allestimento delle numerose diluizioni. Le modifiche della versione originale riguardano : - utilizzazione di piastre da microtitolazioni a 96 pozzetti a posto delle classiche provette da batteriologia e micropipette automatizzate per le varie operazioni di distribuzione degli antimicrobici e degli inoculi. - utilizzazione di sistemi miniaturizzati che impiegano microtubi o piastre per microtitolazioni contenenti, in forma secca, concentrazioni variabili di antimicrobici. Riempiti opportunamente con l inoculo standardizzato preparato in un brodo nutritivo contenente glucosio e rosso fenolo, i microtubi vengono incubati una notte ed osservati per il viraggio (crescita) o meno (inibizione della crescita) dell indicatore. - utilizzazione di apparecchiature automatizzate che impiegano tecniche miniaturizzate e permettono di ottenere in poche ore i risultati mediante controllo computerizzato dell aumento nel tempo della densità ottica della brodocoltura (indice di crescita batterica).

9 In ogni caso la minima concentrazione inibente (M.I.C.) è data dalla più alta diluizione di antimicrobico (assenza di crescita nel brodo) che inibisce lo sviluppo del microrganismo. La M.C.I. spesso non coincide con la morte di tutte le cellule microbiche. Per verificare se la M.C.I. ha avuto anche attività biocida è necessario inoculare, in terreno colturale liquido o solido privo di antimicrobici, una quantità del brodo in cui è stata ottenuta la M.C.I.. In caso di assenza di crescita la M.C.I. è anche la Minima Concentrazione Battericida (M.C.B.). Il più delle volte la M.C.B. va ricercata nelle provette con concentrazione di antimicrobico più elevata della M.I.C (vedi fig. 1). La M.C.I. puo essere eseguita anche in terreno solido e presenta il vantaggio di consentire il saggio contemporaneo di numerosi ceppi batterici (in una sola piastra Petri di 10cm di diametro possono essere saggiati 21 ceppi); essa non consente però di determinare la M.C.B.. Per la standardizzazione dei vari parametri e l esecuzione del saggio in provetta vedi protocollo allegato! Metodo della diffusione in terreno agarizzato (ANTIBIOGRAMMA) L antibiogramma, ossia la determinazione della sensibilità in vitro dei microrganismi agli antibiotici e/o ai chemioterapici costituisce un valido aiuto nell indicare la terapia di scelta di molte malattie infettive umane ed animali. Ogni antibiotico o chemioterapico possiede uno spettro di azione antimicrobica in base al quale è possibile conoscere quando il suo impiego può essere efficace. Ciò è particolarmente utile quando ci troviamo in presenza di specie batteriche che sappiamo costituiti da stipiti con sensibilità diverse ai vari chemio-antibiotici o che possono dare luogo facilmente alla comparsa di mutanti resistenti. Questa tecnica, oltre al vantaggio di una notevole rapidità abbinata ad una grande semplicità di esecuzione, permette di saggiare contemporaneamente più antibiotici in un unica soluzione. Ha però lo svantaggio rispetto alla M.I.C. di dare solo valutazioni di tipo qualitativo. Il metodo è basato sul principio che un chemio-antibiotico, deposto sulla superficie di un terreno agarizzato seminato con il microrganismo da saggiare, diffonde in senso centrifugo in maniera tridimensionale creando un gradiente di concentrazione. Se il microrganismo è sensibile, nell area circolare in cui il chemio-antibiotico raggiunge una concentrazione

10 sufficiente (uguale o maggiore della M.I.C.), non si avrà crescita microbica e si definirà una zona chiara (alone d inibizione), il cui diametro sarà tanto maggiore quanto più diffusibile sarà l antimicrobico e più sensibile risulterà il microrganismo in esame. In base alla grandezza del diametro d inibizione il ceppo microbico può essere indicato come sensibile, moderatamente sensibile o resistente ad un determinato antimicrobico. Il chemio-antibiotico può essere posto, in soluzione, in pozzetti scavati nello spessore dell agar nutritivo o in cilindri di porcellana sterili posti sulla superficie del terreno agarizzato in piastre Petri, oppure può essere veicolato in soluzione o allo stato secco su dischetti di carta bibula (6,35 mm diam.) singoli o multipli. Il metodo dei dischetti multipli (vedi fig. protocollo) è quello più utilizzato. I dischetti, reperibili in commercio, possono essere preparati in laboratorio imbibendoli con 0,02 ml di soluzione di antibiotico o chemioterapico, lasciandoli asciugare e ponendoli in essiccatore a 4 C per periodi non superiori a 7gg o a - 20 Cper periodi più lunghi. E però preferibile acquistare i dischetti presso Ditte specializzate che offrono maggiori garanzie di standardizzazione specie se le forniture sono garantite da specifici organi di controllo come la FDA-Food and Drug Administration, il NCCLS- National Committee for Clinical Laboratory Standard. Per ottenere risultati attendibili e riproducibili con questa tecnica è necessario tenere conto dell influenza determinante di alcuni fattori sia sull azione dell antimicrobico che sulla crescita del microrganismo. Bisogna perciò prendere in considerazione: le caratteristiche dell antimicrobico, lo stato fisiologico e la densità delle cellule costituenti l inoculo microbico, la composizione e il ph del terreno colturale, lo spessore del agar nutritivo, la secchezza della superficie del terreno colturale, il tempo intercorrente tra la semina e l applicazione dei dischetti, l adesione dei dischetti alla superficie dell agar, la temperatura ed il tempo di incubazione. Caratteristiche del chemio-antibiotico: l antimicrobico puo essere più o meno diffusibile a causa del suo P.M. o per la presenza di carica elettrica; può interagire con alcuni componenti del terreno colturale. Per es. la polimixina e la colistina possono, a causa della loro molecola cationica, legarsi elettrostaticamente al solfato presente nell agar dando aloni di inibizione molto ridotti.

11 Densità dell inoculo: questo parametro può influenzare fortemente il diametro dell alone d inibizione. Un inoculo scarso darà aloni d inibizione erroneamente ampi a causa del maggior periodo di tempo impiegato dalla popolazione microbica a raggiungere il livello critico necessario ad impedire che l antibiotico diffonda ulteriormente. Al contrario un inoculo troppo abbondante determinerà un alone erroneamente piccolo: facendo un esempio di tipo militare si può immaginare che "il numero dei bersagli da colpire (microrganismi) è troppo elevato in relazione alla quantita di munizioni disponibili (molecole di antimicrobico)" ndr). Il problema inoculo risulta amplificato nel caso di ceppi microbici produttori di enzimi inattivanti un determinato antibiotico: nel caso di ceppi produttori di penicillinasi come alcuni stipiti di Staphylococcus aureus, con inoculi scarsi si ottengono aloni di inibizione nolto ampi rispetto alla norma. Basta però un modesto incremento dell inoculo per ottenere aloni di inibizione enormemente inferiori se paragonati a quelli ottenuti con ceppi non produttori di penicillinasi. Il motivo di un tale comportamento è da riferirsi al fatto che sebbene gli S. aureus produttori di penicillinasi siano sensibili alla penicillina, l enzima da essi prodotto li protegge. Tale protezione non avviene quando l inoculo è troppo scarso poichè la quantità di enzima risulta insufficiente ad inibire l azione dell antibiotico. Diventa sufficiente, rendendo il ceppo resistente, con un inoculo più denso. Si rende necessaria, quindi, la standardizzazione dell inoculo, che ha come scopo la formazione, dopo semina ed incubazione su MHA, di una patina derivante da colonie confluenti ma non sovrapposte. Per la preparazione di un inoculo standard vedi protocollo allegato! Composizione e ph del terreno colturale: il terreno colturale può ostacolare o favorire la diffusione dell antimicrobico. La presenza di timina e/o timidina nel terreno colturale, anche a bassa concentrazione(> 0,4/ l), inibisce l azione del trimethoprim. Alcuni tipi di peptoni, a volte contenuti anche in alcune preparazioni commerciali di MHA, hanno un effetto inibitore sui sulfamidici. Un'elevata concentrazione di cationi (Ca 2 +, Mg 2 +, Fe 3 + ) inibisce l azione delle tetracicline e degli aminoglicosidi (tobramicina, gentamicina, sisomicina, amikacina), determinando aloni troppo piccoli. Il ph può modificare l attività di alcuni antibiotici ed anche influenzare la crescita dei microrganismi ed alterare quindi le dimensioni degli aloni di inibizione. Salvo i casi in cui non risulti indispensabile, il terreno colturale non deve contenere carboidrati fermentabili. Per microrganismi particolarmente esigenti (Haemophylus,

12 Streptococcus, Neisseria) è necessario aggiungere al MHA sangue animale. Il ph del terreno deve essere aggiustato a 7,2-7,4. Bisogna evitare che le piastre vengano conservate od incubate in presenza di CO 2 per evitare l'abbassamento del ph. Spessore e superficie del terreno colturale: è necessario che lo spessore dell agar sia standardizzato a 4 mm (il risultato può essere ottenuto versando 25ml di terreno colturale agarizzato fuso in una piastra Petri da 9 cm di diam. o 60 ml in una da 15 cm, e lasciando solidificare). Con spessore inferiore il chemio-antibiotico invece di diffondere omogeneamente nelle tre dimensioni diffonderà in gran parte superficialmente determinando aloni di inibizione erroneamente più grandi. Risultato inverso verrà ottenuto con spessori > di 4mm. Dopo l'inoculo, la superficie del terreno colturale deve essere perfettamente asciutta per evitare che l'antimicrobico si diluisca e formi aloni di inibizione irregolari. Temperatura e tempo di incubazione : le piastre per l antibiogramma devono essere incubate a C. Sebbene con alcuni microrganismi a rapida crescita gli aloni di inibizione compaiono gia dopo 4 h di incubazione è necessario effettuare le letture finali dopo 18h d incubazione. E stato infatti sperimentato che dopo tale periodo la reattività tra microrganismi seminati e l effetto inibitore dell antimicrobico risulta ottimale e gli aloni di inibizione sono più distinti. Una incubazione che viene protratta troppo al di la delle 18 h può portare ad un errata interpretazione nella lettura degli aloni di inibizione o per eccessivo essiccamento dell agar, o per decadimento dell attività del chemioantibiotico o ancora, per eccessiva crescita microbica. Misura degli aloni di inibizione ed interpretazione dei risultati: le misurazioni del diametro degli aloni di inibizione vengono effettuate sul retro della piastra con un decimetro o meglio con un calibro, approssimate al millimetro, includendo il diametro del dischetto. Per agevolare la misurazione può essere utile una fonte di luce riflessa ed uno sfondo scuroopaco. Le piastre devono essere tenute perpendicolari alla linea di osservazione. Se per qualche necessità invece del terreno MHA sono state utilizzate piastre contenenti agar-sangue (microrganismi particolarmente esigenti), gli aloni dovranno essere misurati dalla parte superiore della piastra dopo aver rimosso il coperchio. Alcuni microrganismi che provocano il fenomeno dello sciamaggio (Proteus vulgaris, P.

13 mirabilis), formano un leggero alone di crescita che penetra all interno dell alone di inibizione. Questo alone, dovuto allo sciamaggio deve essere ignorato e la misurazione dovrà essere eseguita misurando il margine di inibizione più esterno che in genere è ben delineato. Anche con i dischetti di sulfonamide è possibile ottenere dei doppi aloni. La misurazione anche in questo caso deve essere fatta partendo dal margine più esterno. I risultati dovranno essere interpretati in base a valori prefissati relativi ad ogni specifico chemio-antibiotico (vedi tabella allegata al protocollo).

14 Antibiotico Nalidixic acid Ampicillina Cephalotin Ceftazidime Co-trimoxazole Gentamicin Nitrofurantoin Norfloxacin Pipemidic acid Cephoxitin Cefoperazone Cefuroxime Colistin SO4-- Netilmicin Piperacillin Tobramicin ANTIBIOGRAMMA Abbreviazione NA AMP KF CAZ SXT CN F NOR PI FOX CFP CXM CT NET PRL TOB

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17 Etest Il test epsilometrico, detto anche etest (a volte anche e-test), è una variante oggi molto usata del metodo per diffusione. Il test si allestisce inserendo nel Mueller Hinton Agar una o più strisce di carta bibula rettangolari (circa 0.4 cm x 8 cm), contenenti concentrazioni scalari dell'antibiotico di cui si vuole saggiare l'attività. Dopo l'incubazione, si viene ad evidenziare un alone di inibizione a goccia (immagine a fianco) intorno alla parte superiore della striscetta; in particolare, la base della goccia sarà rivolta verso la parte superiore della striscia (quella con maggior concentrazione di antibiotico), mentre la punta della goccia sarà rivolta verso la parte inferiore della striscia (contenente una minor concentrazione di antibiotico). Il confronto dell'ampiezza delle gocce di inibizione tra striscette contenenti diversi antibiotici, associato alla valutazione dei valori standard, permette la rapida identificazione del farmaco più efficace verso il batterio. Inoltre, questo metodo permette la valutazione rapida della concentrazione minima inibente; infatti, il punto in cui la punta della goccia incontra la striscetta, corrisponde alla più piccola concentrazione di antibiotico ancora in grado di inibire la crescita batterica.

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