Utilizzo degli oli essenziali per l'inibizione della crescita dei microorganismi indicatori di igiene in prodotti a base di carne

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1 Ricerca Fondazione CRT Richieste Ordinarie (anno 2017) Utilizzo degli oli essenziali per l'inibizione della crescita dei microorganismi indicatori di igiene in prodotti a base di carne Tramuta Clara Savigliano, 7 giugno 2019

2 UNITA' OPERATIVE COINVOLTE IZS PLV S.C. Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni Decastelli Lucia Terre dei Savoia - Mùses dell'accademia Europea delle Essenze di Savigliano Cerutti Elena Durata progetto: 16 mesi Inizio: 28/03/2017 Rendicontazione finale: 28/07/2019

3 Obiettivi del progetto Valutare l effetto antimicrobico di oli essenziali Verificare il possibile utilizzo in prodotti a base di carne Valorizzare le produzioni locali di erbe/piante aromatiche ricche di oli essenziali

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5 Fasi progettuali 1. Selezione delle erbe 2. Fornitura degli oli 3. Valutazione in vitro dell'attività antibatterica 4. Valutazione in vivo dell'attività antibatterica 5. Divulgazione e disseminazione dei risultati

6 ATTIVITA' - S.C. Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni (IZS PLV) - Valutazione dell'attività antimicrobica in vitro (metodo di diffusione in agar e microdiluizione in brodo) - Valutazione dell'attività antimicrobica in vivo

7 ATTIVITA'- Terre dei Savoia, Mùses dell'accademia Europea delle Essenze di Savigliano - Selezione delle erbe aromatiche Regione Piemonte - Fornitura degli oli estratti da assenzio, finocchio, maggiorana, menta piperita, rosmarino, salvia e timo rosso

8 Negli ultimi anni si è preso sempre più in considerazione l aspetto della sicurezza e della qualità dei prodotti alimentari I consumatori manifestano un marcato interesse verso prodotti alimentari privi di conservanti I produttori sono orientati alla ricerca di metodi naturali per migliorare la stabilità e la sicurezza degli alimenti La ricerca è sempre più concentrata sullo studio di metodi alternativi (es. impiego di componenti naturali)

9 Erbe aromatiche e oli essenziali Le erbe aromatiche ricche di oli essenziali con proprietà officinali sono una fonte di molecole bioattive usate per aumentare la durabilità e la sicurezza dei prodotti alimentari Gli oli essenziali sono ottenuti per distillazione o per spremitura da semi, foglie, steli, fiori, etc oli essenziali (300 commercialmente importati)

10 Gli oli essenziali In particolare studiati effetti antibatterici oli essenziali ottenuti da piante aromatiche L' idrofobicità degli oli permette la penetrazione nella membrana cellulare incrementandone la permeabilità Fuoriuscita di ioni e di molecole dalle cellule apoptosi

11 Tra i possibili meccansmi d'azione: - degradazione parete cellulare - danni membrana citoplasmatica - danni proteine di membrana - coagulazione del citoplasma Gli oli essenziali Potenziale applicazione oli essenziali come conservanti di origine vegetale Possibile impiego sui prodotti a base di carne

12 Produzioni in Piemonte Piemonte tra le regioni maggiormente prodruttrici di erbe aromatiche E' la prima regione per aree di coltivazioni con circa 750 ettari di terreni coltivati con piante aromatiche In particolare la lavanda, basilico, prezzemolo, menta, salvia, rosmarino, timo, alloro, finocchio, maggiorana, mirto, ginepro, dragoncello, cumino usate per insaporire i cibi, prolungare la conservabilità di pietanze, in erboristeria, nelle industrie alimentari, cosmetiche e farmaceutiche

13 IZSTO Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta Il Mùses ha selezionato le erbe aromatiche che maggiormente vengono coltivate nella Regione Piemonte Fornitura degli oli estrazione distillazione a corrente di vapore (Menta estrazione ad ultrasuoni) Assenzio (Artemisia absinthium L.) - foglie e steli Finocchio (Foeniculum vulgare Mill.) - semi Maggiorana (Origanum majorana L.) - steli Menta piperita (Mentha piperita L.) - foglie e steli Rosmarino (Rosmarinum officinalis L.) - steli Salvia (Salvia officinalis) - foglie Timo (Thymus vulgaris L.) - steli

14 Tecniche per la determinazione in vitro dell'attività antibatterica L'aromatogramma è un test che permette la valutazione del profilo di sensibilità batterica in vitro ad oli essenziali Si esegue esponendo concentrazioni standard del microrganismo in esame ad una serie di concentrazioni di olio essenziale Diffusione in agar: metodica qualitativa Brodo/agar diluizione - determinazione della Minima Concentrazione Inibente (MIC): metodiche quantitative

15 Tecniche per la determinazione in vitro dell'attività antibatterica diffusione in agar Principio L'olio diffonde nell agar in direzione centrifuga Formazione di un alone di inibizione dovuto all'inibizione della crescita batterica indotta dall'olio Misurazione in millimetri dei diametri degli aloni di inibizione che si creano intorno ai dischi contenenti l'olio

16 Tecniche per la determinazione in vitro dell attività antibatterica diffusione in agar Allestimento di una sospensione batterica (1,5 x 10 8 CFU/ml) Semina della sospensione sulla superficie di un terreno standardizzato Misurazione degli aloni di inibizione ed interpretazione dei risultati Posizionamento dei dischetti e incubazione

17 Valutazione in vitro dell'attività antibatterica - diffusione in agar Sospensione batterica E. coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 33862) Semina su piastre di MH agar Dischetti imbibiti con ciascun olio essenziale -superficie del terreno -coperchio della piastra petri (componenti volatili) Incubazione a 35 C per ore Misurazione dei inibizione diametri degli aloni di

18 Tecniche per la determinazione in vitro dell'attività antibatterica microdiluizione in brodo Determinazione Minima Concentrazione Inibente (MIC) Misura quantitativa dell attività di un agente antimicrobico (olio) verso un determinato batterio Definita come la più bassa concentrazione di agente antimicrobico (olio) capace di inibire la crescita batterica visibile

19 Valutazione in vitro dell'attività antibatterica microdiluizione in brodo Solubilizzazione dell'olio (Tween 80 1%) e diluizioni (scalari 1:2) in brodo di coltura (MHB) Semina dell inoculo standardizzato (1.5x10 6 UFC/ml) Incubazione a 37 C per 24h Lettura MIC = primo pozzetto senza crescita visibile

20 Tecniche per la determinazione in vitro dell'attività antibatterica Minima Concentrazione Battericida - (MBC) La più bassa concentrazione di agente antimicrobico capace di uccidere il 99.9% dell'inoculo Semina del contenuto dei pozzetti, senza crescita visibile, su AS Incubazione a 37 C per 24h Lettura MBC: diluizione più bassa alla quale non si osserva crescita batterica Minima concentrazione dell olio essenziale in grado di esercitare un azione battericida

21 Risultati attività antibatterica in vitro Aloni di inibizione

22 Risultati attività antibatterica in vitro Aloni di inibizione Attività antibatterica delle componenti volatili degli oli essenziali Olio Diametro aloni (mm) E. coli S. aureus Assenzio 0 > 50 Finocchio 0 0 Maggiorana 30 > 50 Menta piperita 0 > 50 Rosmarino 0 0 Salvia 12 > 50 Timo 31 > 50

23 Risultati attività antibatterica in vitro - MIC e MBC Olio MIC (% olio) MBC (% olio) E. coli S. aureus E. coli S. aureus Assenzio 1,56 0,78 1,56 0,78 Finocchio 25 12, Maggiorana 0,195 0,097 0,39 0,097 Menta piperita 0,78 0,097 1,56 0,097 Rosmarino 1,56 0,39 1,56 1,56 Salvia 0,39 0,195 0,39 0,39 Timo 0,048 0,048 0,097 0,048 MIC=MBC olio ha azione sia batteriostatica che battericida

24 Valutazione dell'attività antibatterica in vivo Campioni di carne macinata (10 g) inoculati con i ceppi ATCC e 10 3 UFC/g 10 5 UFC/g Timo e maggiorana testati alle concentrazioni 1% e 2% Omogeneizzazione in Stomacher Incubazione a 4 C per 0h, 5h, 24h, 48h Diluizione della carne (10 g) in BPW (90 ml) Diluizioni seriali 1:10 in acqua peptonata Semina in terreni agarizzati TBX (E. coli) e RPF (S. aureus) Incubazione a 44 C/37 C per 24h-48h, conta batterica (UFC\g)

25 Risultati - Attività antibatterica in vivo Escherichia coli (Log UFC/g) 0 5 h 24 h 48 h Controllo negativo Controllo positivo Maggiorana 5 4,9 4,86 4,83 Timo 5 4,9 4,87 4, UFC/g UFC/g UFC/g 5,05 Escherichia coli Maggiorana / Timo 1% Conc. batt 10 5 UFC/g LOG UFC/g 5 4,95 4,9 4,85 4,8 4,75 4,7 Controllo positivo Maggiorana Timo 4,65 0h 5h 24h 48h

26 Risultati - Attività antibatterica in vivo Escherichia coli (Log UFC/g) 0 5 h 24 h 48 h Controllo negativo Controllo positivo Maggiorana 5 4,9 4,6 4,5 Timo 5 4,9 4,5 4, UFC/g UFC/g UFC/g 5,2 Escherichia coli Maggiorana / Timo 2% Conc. batt 10 5 UFC/g LOG UFC/g 5 4,8 4,6 4,4 4,2 Controllo positivo Maggiorana Timo 4 3,8 0h 5h 24h 48h

27 Risultati - Attività antibatterica in vivo Escherichia coli (Log UFC/g) 0 5 h 24 h 48 h Controllo negativo Controllo positivo Maggiorana 3 2,9 2,7 2,6 Timo 3 2,8 2,6 2, UFC/g 400 UFC/g 200 UFC/g 3,5 Escherichia coli Maggiorana / Timo 2% Conc. batt 10 3 UFC/g LOG UFC/g 3 2,5 2 1,5 1 Controllo positivo Maggiorana Timo 0,5 0 0h 5h 24h 48h

28 Risultati - Attività antibatterica in vivo Staphylococcus aureus (Log UFC/g) 0 5 h 24 h 48 h Controllo negativo Controllo positivo Maggiorana 3 2,9 2,7 2,5 Timo 3 2,8 2,6 2, UFC/g 300 UFC/g 150 UFC/g 3,5 Staphylococcus aureus Maggiorana / Timo 2% Conc. batt 10 3 UFC/g LOG UFC/g 3 2,5 2 1,5 1 Controllo positivo Maggiorana Timo 0,5 0 0h 5h 24h 48h

29 Conclusioni Prove in vitro Timo e maggiorana maggiore attività antibatterica elevate % di composti fenolici In generale, osservata maggiore efficacia oli verso lo Staphylococcus aureus rispetto E. coli (carattere riconducibile alle differenze inerenti la struttura della parete cellulare) Le componenti volatili degli oli (timo, maggiorana, menta, assenzio e salvia) mostrano eccellente azione soprattutto nei confronti di S. aureus

30 Conclusioni Prove in vivo Osservata attività antibatterica nelle 48h a basse conc. di olio (2%) Più complessa la valutazione nell'alimento: necessaria una quantità superiore di olio (> ) per avere l'effetto ottenuto in vitro Concentrazioni spesso inconciliabili con le caratteristiche sensoriali della carne

31 Conclusioni Più complessa la valutazione nell'alimento...perchè? - La maggiore disponibilità di nutrienti negli alimenti rispetto ai terreni di coltura permette ai batteri di riparare più velocemente i danni subiti delle cellule - La sensibilità dei batteri influenzata dalle proprietà intrinseche dell'alimento (grasso, proteine, contenuto di acqua, etc) Può proteggere i batteri dall'azione dell'olio Diminuisce dispersione dell'olio nell'alimento la

32 Conclusioni Ulteriori prove su matrici alimentari relativamente più semplici e possibili azioni sinergiche tra gli oli Timo e maggiorana Rappresentano una buona alternativa all utilizzo di sale e additivi sintetici in campo alimentare a vantaggio della salute dei consumatori Ridurre il rischio microbiologico e migliorare la qualità dei prodotti

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34 Grazie per l'attenzione Gruppo di lavoro Gallina S, Tramuta C, Bianchi DM, Golfieri G, Falsetti S, Zaquini L, Cerutti E, Decastelli L