BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO NEL SIERO, PLASMA O LIQUIDO CEREBROSPINALE UMANO MEDIANTE IMMUNODOSAGGIO ENZIMATICO

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1 PLATELIA LYME IgG DETERMINAZIONE QUALITATIVA DEGLI ANTICORPI IgG ANTI-BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO NEL SIERO, PLASMA O LIQUIDO CEREBROSPINALE UMANO MEDIANTE IMMUNODOSAGGIO ENZIMATICO

2 1- USO PREVISTO Platelia Lyme IgG è un immunodosaggio ELISA indiretto per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgG anti-borrelia burgdorferi sensu lato nel siero, plasma o liquido cerebrospinale (LCS) umano. 2- INTERESSE CLINICO La borreliosi di Lyme (o malattia di Lyme) è una malattia infettiva non contagiosa causata dal batterio Borrelia burgdorferi, della famiglia Spirochetacee, trasmessa dalle zecche del genere Ixodes (2). Numerosi animali sono portatori del batterio e il contagio nell'uomo avviene attraverso il morso di zecche infette. Il rischio di trasmissione è tanto più elevato quanto più è prolungato il morso. La malattia di Lyme è particolarmente diffusa nelle regioni temperate e fredde dell'emisfero Nord, dalla Cina all'america del Nord e dalla Scandinavia al Nord Africa. Si stima un'incidenza annua di circa casi negli Stati Uniti (3) e probabilmente più di in Europa, dove sembra esservi un gradiente positivo da ovest a est (4). È stato chiaramente dimostrato che la Borrelia burgdorferi, descritta nel 1984 come un'unica specie di batteri, in realtà è un complesso di numerose specie, tre delle quali sono patogene per l'uomo: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii e Borrelia afzelii (7). Queste tre specie patogene sono presenti in Europa, mentre negli Stati Uniti si registra solamente la presenza della B. burgdorferi sensu stricto. La malattia di Lyme è caratterizzata da vari sintomi clinici, talvolta difficili da riconoscere (6). La sua manifestazione si può suddividere in tre fasi. La prima fase (Stadio I) può essere asintomatica ed è caratterizzata da una sindrome simile all'influenza. Nel 50-80% dei casi, a distanza di giorni o settimane dal morso della zecca, si sviluppa una tipica eruzione cutanea localizzata con estensione centrifuga, detta eritema migrante (EM). In assenza di trattamento, la disseminazione ematogena della Borrelia nelle settimane successive si manifesta attraverso artriti infiammatorie, disturbi neurologici o meningei, compresi sintomi cardiaci e cutanei (Stadio II). A distanza di mesi o anni dall'infezione, la malattia può evolvere verso una fase cronica accompagnata da diversi livelli di acrodermatite cronica atrofizzante, encefalopatia, encefalomielite e artrite cronica (Stadio III) (1). 92

3 Ogni specie di Borrelia burgdorferi presenta un tropismo particolare. Se l'eritema migrante allo stadio I è indifferentemente associato alle tre specie, le complicazioni neurologiche sono più frequentemente associate alla specie B. garinii, le artriti alla specie B. burgdorferi ss, mentre l'acrodermatite cronica atrofizzante è specifica alla specie B. afzelii. La diagnosi della malattia di Lyme può essere confermata solo dopo un'attenta analisi dell'anamnesi medica del paziente, dei criteri clinici e biologici e una valutazione del rischio di contaminazione. Date le difficoltà relative alla determinazione diretta, all'isolamento della coltura o all'implementazione dei metodi di biologia molecolare, la sierologia rappresenta un elemento chiave nella diagnosi biologica della malattia di Lyme (1,5,8). Gli anticorpi IgM anti-borrelia burgdorferi compaiono a distanza di circa 3-6 settimane dalla contaminazione e possono persistere per tutta l'evoluzione della malattia. La risposta degli anticorpi IgG è più tardiva e raggiunge il suo picco solamente dopo mesi o addirittura anni. Sebbene la sierologia sia trascurabile durante la fase precoce, svolge un ruolo fondamentale durante le fasi secondaria o terziaria, soprattutto in assenza di eritema migrante. In caso di esito negativo del test sierologico, nonostante un quadro clinico suggestivo, è necessario eseguire un nuovo test a distanza di 3 settimane dal primo prelievo. Come la presenza di anticorpi IgM specifici non è sinonimo di infezione recente, la presenza di anticorpi IgG specifici non indica necessariamente un'infezione pregressa. Inoltre, la determinazione dell indice di sintesi intratecale di anticorpi IgG specifici anti-borrelia burgdorferi sensu lato fornisce un contributo orientativo ai fini della diagnosi quando si sospetta una malattia di Lyme (9,10,11). Gli antigeni e gli anticorpi utilizzati nei dosaggi Platelia Lyme IgG (Rif ) e Platelia Lyme IgG (Rif ) sono stati selezionati per consentire rispettivamente la determinazione degli anticorpi IgG e IgM specifici diretti contro i vari ceppi americani ed europei di Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii). 3- PRINCIPIO Platelia Lyme IgG è un test qualitativo per la determinazione degli anticorpi IgG anti-borrelia burgdorferi sensu lato nel siero, plasma o liquido cerebrospinale umano mediante un metodo immunoenzimatico ELISA indiretto. Gli antigeni inattivati di Borrelia burgdorferi vengono utilizzati per sensibilizzare la micropiastra. Come coniugato viene utilizzato un anticorpo monoclonale marcato con perossidasi specifico per le catene gamma umane (anti-igg). Il test prevede le seguenti fasi: 93

4 Fase 1 I campioni dei pazienti (siero o plasma) e i controlli vengono diluiti in un rapporto di 1:101. I campioni di liquido cerebrospinale vengono diluiti in un rapporto di 1:2. I campioni diluiti vengono poi distribuiti nei pozzetti della micropiastra. Durante questa incubazione di un'ora a 37 C, gli anticorpi IgG anti-borrelia burgdorferi presenti nel campione si legano all'antigene Borrelia adeso ai pozzetti della micropiastra. Gli anticorpi non specifici non legati e altre proteine seriche vengono eliminati dai lavaggi successivi all'incubazione. Fase 2 Il coniugato (anticorpo monoclonale marcato con perossidasi specifico per le catene gamma umane) viene aggiunto nei pozzetti della micropiastra. Durante questa incubazione di un'ora a 37 C, l'anticorpo monoclonale marcato si lega al siero IgG catturato dall'antigene Borrelia. Il coniugato non legato viene eliminato dai lavaggi successivi all'incubazione. Fase 3 La presenza di immunocomplessi (Antigene Borrelia, anticorpi IgG anti- Borrelia burgdorferi, coniugato anti-igg) viene dimostrata attraverso l'aggiunta di una soluzione di sviluppo enzimatica in ogni pozzetto. Fase 4 Al termine del periodo di incubazione a temperatura ambiente ( C), la reazione enzimatica viene bloccata attraverso l'aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N. La lettura della densità ottica ottenuta con uno spettrofotometro impostato su 450/620 nm è proporzionale alla quantità di anticorpi IgG anti-borrelia burgdorferi presenti nel campione. 4- INFORMAZIONI SUL PRODOTTO Le quantità di reagenti fornite sono state calcolate per consentire l'esecuzione di 96 test in un massimo di 6 cicli. Tutti i reagenti sono destinati all'uso esclusivo nella diagnostica in vitro. 94

5 Marcatura Natura dei reagenti Presentazione R1 Microplate Micropiastra (Pronta per l'uso) : 12 strip con 8 pozzetti divisibili, sensibilizzati con antigene Borrelia inattivato 1 R2 R3 Concentrated Soluzione di lavaggio concentrata (20x) : Washing Tampone TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 Solution (20x) Conservante: < 1,5% ProClin 300 Negative Control Controllo negativo : Siero umano negativo per anticorpi IgG anti- Borrelia burgdorferi e negativo per antigene HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: < 1,5% ProClin x 70 ml 1 x 0,75 ml R4 Cut-off Control Controllo del valore soglia : Siero umano reattivo per anticorpi IgG anti- Borrelia burgdorferi e negativo per antigene HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: < 1,5% ProClin x 0,75 ml R5 Positive Control Controllo positivo : Siero umano reattivo per anticorpi IgG anti- Borrelia burgdorferi e negativo per antigene HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: < 1,5% ProClin x 0,75 ml R6 Conjugate (51x) Coniugato (51x) : Anticorpo monoclonale murino anti-catene gamma umane unito a perossidasi di rafano Conservante: < 1,5% ProClin 300 R7 Diluent Diluente per campioni e coniugato : (Pronto per l'uso). Tris-NaCl (ph 7,7), siero di vitello fetale, 0,1% Tween 20 e rosso fenolo Conservante: < 1,5% ProClin 300 R9 R10 Chromogen TMB Stopping Solution Cromogeno (Pronto per l'uso) : 3,3,5,5 tetrametilbenzidina (< 0.1%), H 2O 2 (<1%) Soluzione bloccante (Pronta per l'uso) : Soluzione di acido solforico 1N 1 x 0,7 ml 2 x 65 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml Pellicola adesiva per micropiastre 4 95

6 Per informazioni sulle condizioni di conservazione e sulla data di scadenza, consultare le indicazioni riportate sulla confezione. 5- AVVERTENZE E PRECAUZIONI L'affidabilità dei risultati dipende dalla corretta implementazione delle buone prassi di laboratorio riportate di seguito: Non utilizzare reagenti scaduti. Non mischiare, né combinare reagenti provenienti da lotti diversi in uno stesso ciclo. OSSERVAZIONE : per la soluzione di lavaggio (R2, identificativo etichetta: 20x color verde), il Cromogeno (R9, identificativo etichetta: TMB color turchese) e la soluzione bloccante (R10, identificativo etichetta: 1N color rosso) è possibile utilizzare lotti diversi da quelli contenuti nel kit, a condizione che i reagenti siano strettamente equivalenti e venga utilizzato un unico lotto in uno stesso ciclo di analisi. Prima dell'uso, attendere circa 30 minuti per consentire al reagente di raggiungere la temperatura ambiente (18-30 C). Ricostituire o diluire con cura i reagenti evitando contaminazioni. Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (vapori acidi, alcalini e di aldeide) o polvere potenzialmente in grado di alterare l'attività enzimatica del coniugato. Utilizzare preferibilmente materiale monouso oppure elementi in vetro perfettamente lavati ed asciugati con acqua deionizzata. Il lavaggio della micropiastra è una fase essenziale della procedura: eseguire il numero di cicli di lavaggio raccomandato e assicurarsi che tutti i pozzetti, una volta riempiti, vengano completamente svuotati. Un lavaggio inadeguato può condurre a risultati inesatti. Non far asciugare la micropiastra nell'intervallo di tempo compreso fra la fine dell'operazione di lavaggio e la distribuzione del reagente. Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la soluzione di sviluppo. La reazione enzimatica è particolarmente sensibile al metallo o agli ioni metallici. Di conseguenza, evitare che gli elementi di metallo entrino in contatto con le varie soluzioni contenenti il coniugato o il cromogeno. La soluzione di cromogeno (R9) deve essere incolore. La colorazione blu indica che il reagente non può essere utilizzato, pertanto dovrà essere sostituito. Utilizzare puntali diversi per ogni campione. Verificare l'accuratezza delle pipette e il buon funzionamento delle altre strumentazioni. 96

7 ISTRUZIONI DI SICUREZZA E IGIENE Il materiale di origine umano utilizzato nella preparazione dei reagenti è stato analizzato e classificato non reattivo per l'antigene di superficie dell'epatite B (HBs Ag), gli anticorpi per il virus dell'epatite C (anti-hcv) e il virus dell'immunodeficienza umana (anti-hiv1 e anti-hiv2). Dato che nessun metodo può garantire con assoluta certezza l'assenza di agenti infettivi, manipolare i reagenti di origine umana e i campioni dei pazienti come potenzialmente infetti. Qualsiasi materiale, comprese le soluzioni di lavaggio, che entri direttamente in contatto con campioni e reagenti contenenti materiali di origine umana deve essere considerato potenzialmente in grado di trasmettere malattie infettive. Indossare guanti monouso durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti. Non pipettare con la bocca. Evitare di rovesciare campioni o soluzioni contenenti campioni. Pulire le superfici contaminate con candeggina diluita al 10%. Se il liquido conta-minante è un acido, neutralizzare le superfici con bicarbonato di sodio, quindi pulire con candeggina diluita al 10% e asciugare con carta assorbente. Il materiale utilizzato per la pulizia deve essere gettato in un contenitore speciale per rifiuti contaminati. Dopo la decontaminazione, eliminare i campioni dei pazienti, i reagenti contenenti materiale di origine umana, compreso il materiale e i prodotti contaminati mediante uno dei seguenti metodi: - immersione nella candeggina alla concentrazione finale di 5% di ipocloruro di sodio per 30 minuti, - oppure lavaggio in autoclave a 121 C per almeno 2 ore. ATTENZIONE : non introdurre soluzioni contenenti ipocloruro di sodio nell'autoclave Evitare qualsiasi contatto del Cromogeno e della Soluzione bloccante con la pelle e le mucose. La manipolazione e l'eliminazione dei residui chimici e biologici devono essere eseguite attenendosi alle buone prassi di laboratorio. 97

8 Tutti i reagenti forniti nel kit sono destinati all'uso esclusivo nella diagnostica in vitro. Attenzione : alcuni reagenti contengono ProClin 300 < 1,5% R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle S28-37: In caso di contatto con la pelle, lavarsi immediatamente e abbondantemente con acqua e sapone. Xi - Irritante Usare guanti adatti. 6- PRELIEVO, PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 1. Il siero, il plasma (EDTA, eparina o citrato) e il liquido cerebrospinale sono i tipi di campione raccomandati. 2. Per la manipolazione, l'elaborazione e la conservazione dei campioni ematici, attenersi alle seguenti raccomandazioni: Prelevare tutti i campioni di sangue secondo le precauzioni in uso. Per il siero, consentire la completa coagulazione dei campioni prima di procedere alla centrifugazione. Assicurarsi che le provette siano sempre chiuse. Dopo la centrifugazione, separare il siero o il plasma dal coagulo o dai globuli rossi e conservarlo in una provetta chiusa ermeticamente. È possibile conservare i campioni a una temperatura compresa fra +2 e 8 C a condizione che il test venga eseguito entro 7 giorni. Se il test non viene eseguito entro 7 giorni, o per motivi di consegna, congelare i campioni a una temperatura di -20 C o inferiore. Non utilizzare campioni scongelati più di cinque volte. I campioni precedentemente congelati devono essere miscelati bene (Vortex) dopo lo scongelamento e prima del test. 3. I campioni di siero o plasma contenenti 90 g/l di albumina o 100 mg/l di bilirubina non coniugata, campioni lipemici contenenti l'equivalente di 36 g/l di trioleina (trigliceride) e i campioni sottoposti ad emolisi contenenti fino a 10 g/l di emoglobina non influenzano i risultati. 4. Non riscaldare i campioni. 5. Per dimostrare una sintesi intratecale delle IgG, utilizzare campioni di liquido cerebrospinale prelevati mediante puntura lombare contemporaneamente al siero o al plasma. Osservare le raccomandazioni che si applicano normalmente ai campioni di liquido cerebrospinale. È particolarmente importante non utilizzare campioni problematici di aspetto eterogeneo (in questo caso, preferire il surnatante dopo centrifugazione) o campioni altamente emolizzati. Il liquido cerebrospinale deve essere analizzato immediatamente dopo il prelievo. 98

9 Se necessario per analisi successive, conservare i campioni a 4-8 C (per brevi periodi) o a -20 C (per lunghi periodi) (10). NOTA: non è stata studiata la stabilità dei campioni di liquido cerebros-pinale a 4-8 C o - 20 C o dopo più cicli di scongelamento e in presenza dei componenti di interferenza elencati al punto PROCEDURA 7.1. MATERIALE RICHIESTO, MA NON FORNITO Agitatore tipo Vortex. Lettore di micropiastre dotato di filtri 450 nm e 620 nm (*). Incubatore di micropiastre con regolazione termostatica impostata su 37±1 C (*). Sistema di lavaggio automatico, semi-automatico o manuale per micropiastre (*). Acqua distillata o deionizzata sterile. Guanti monouso. Occhiali di sicurezza o antispruzzo. Carta assorbente. Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o preimpostate per misurare e dispensare da 10 µl a µl e 1 ml, 2 ml e 10 ml. Cilindri graduati con capacità di 25 ml, 50 ml, 100 ml e ml. Ipocloruro di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio. Contenitore per rifiuti biologici. Provette monouso. (*) Per informazioni dettagliate sulla strumentazione raccomandata, consultare il nostro reparto tecnico RICOSTITUZIONE DEI REAGENTI R1: Prima di aprire la bustina di plastica, lasciare 30 minuti a temperatura ambiente (18-30 C). Estrarre il vassoio, riporre immediatamente le strip non utilizzate nella bustina e verificare la presenza di essiccante. Richiudere con cura la bustina e conservarla a 2-8 C. R2: Diluire in rapporto 1/20 la soluzione di lavaggio R2 in acqua distillata: ad esempio 50 ml di R2 e 950 ml di acqua distillata per ottenere la soluzione di lavaggio pronta per l'uso. Preparare 350 ml di soluzione di lavaggio diluita per una piastra da 12 strip in caso di lavaggio manuale. R3, R4, R5: Diluire in rapporto 1/101 nel Diluente (R7) (esempio: 10 µl di R3 + 1 ml di R7). 99

10 R6+R7: Il coniugato (R6) è concentrato 51x e deve essere omogeneizzato prima dell'uso. Diluire in rapporto 1/51 nel Diluente (R7). Per una piastra, diluire 0,5 ml di Coniugato (R6) in 25 ml di Diluente (R7). Per ottenere il volume necessario per due strip, dividere i suddetti volumi per CONSERVAZIONE E VALIDITÀ DEI REAGENTI APERTI E / O RICOSTITUITI Il kit deve essere conservato a 2-8 C. Se viene conservato a 2-8 C prima dell'apertura, ogni componente può essere utilizzato fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta riportata sul kit. R1: Dopo l'apertura, le strip mantengono la stabilità fino a un mese, se conservate a 2-8 C nella stessa bustina sigillata (verificare la presenza di essiccante). R2: Dopo la diluizione, la Soluzione di lavaggio può essere conservata per 2 settimane a 2-30 C. La Soluzione di lavaggio concentrata conservata a 2-30 C, in assenza di contaminazione, mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta. R3, R4, R5, R6, R7: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a 2-8 C mantengono la stabilità fino a un mese. R6+R7: Dopo la diluizione, la soluzione di lavoro del coniugato mantiene la stabilità per 8 ore a temperatura ambiente (18-30 C) oppure per 24 ore a 2-8 C. R9: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a 2-8 C mantengono la stabilità fino a 2 mesi. R10: Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, il reagente conservato a 2-8 C mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta PROCEDURA PER I CAMPIONI DI SIERO O PLASMA Seguire attentamente la procedura descritta di seguito e le buone prassi di laboratorio. Prima dell'uso, consentire al reagente di raggiungere la temperatura ambiente (18-30 C). Utilizzare i controlli negativi, positivi e di cut-off in ogni ciclo per convalidare i risultati del test. 1. Definire accuratamente il piano di distribuzione e di identificazione per i controlli e i campioni dei pazienti. 2. Preparare la Soluzione di lavaggio diluita (R2) [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. 3. Estrarre il vassoio e le strip (R1) dall'involucro protettivo [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. 100

11 4. Diluire i controlli R3, R4, R5 e i campioni dei pazienti (S1, S2 ) nel Diluente (R7) per ottenere una diluizione in rapporto 1/101: 10 µl di campione e 1,0 ml di Diluente (R7). Vortexare i campioni diluiti. 5. Distribuire in ogni pozzetto 200 µl di controlli diluiti e di campioni dei pazienti secondo lo schema riportato di seguito: A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Ricoprire la micropiastra con la pellicola adesiva ed esercitare pressione per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente la micropiastra a bagnomaria termostatato o in un incubatore a secco per 1 ora ± 5 minuti a 37 C ± 1 C. 7. Al termine del primo periodo di incubazione, rimuovere la pellicola adesiva. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti biologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 4 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la micropiastra e picchiettare delicatamente su carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso. 8. Preparare la soluzione di lavoro del coniugato (R6+R7) [Fare riferimento alla Sezione 7.2]. Distribuire immediatamente 200 µl della soluzione di lavoro del coniugato (R6+R7) in tutti i pozzetti. Agitare leggermente la soluzione prima dell'uso. 9. Ricoprire la micropiastra con la pellicola adesiva ed esercitare pressione per assicurarne la tenuta. Incubare immediatamente la micropiastra a bagnomaria termostatato o in un incubatore a secco per 1 ora ± 5 minuti a 37 C ± 1 C. 10. Al termine del secondo periodo di incubazione, rimuovere la pellicola adesiva. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti biologici (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 4 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio (R2). Capovolgere la micropiastra e picchiettare delicatamente su carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso. 101

12 11. Distribuire rapidamente in ogni pozzetto e al riparo dalla luce 200 µl di Cromogeno (R9). Far sviluppare la reazione al buio per 30 ± 5 minuti a temperatura ambiente (18-30 C). Non utilizzare nastri sigillanti adesivi durante questo periodo di incubazione. 12. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 100 µl di Soluzione bloccante (R10) in ogni pozzetto. Utilizzare la stessa sequenza e lo stesso ritmo di distribuzione utilizzati per la soluzione di sviluppo. 13. Asciugare accuratamente il fondo della piastra. Leggere la densità ottica a 450/620 nm mediante un lettore nei 30 minuti successivi alla reazione. Non esporre le strip alla luce prima della lettura. 14. Prima della trascrizione dei risultati, verificare la corrispondenza fra la lettura e il piano di distribuzione delle piastre e dei campioni PROCEDURA PER CAMPIONI DI LIQUIDO CEREBROSPINALE NOTA: la determinazione della sintesi intratecale degli anticorpi IgG anti- Lyme si basa sull'applicazione della formula di Reiber. Per ogni paziente con sospetta malattia di Lyme, vengono prelevati contemporaneamente campioni appaiati di siero/plasma e di liquido cerebrospinale. Entrambi i tipi di campioni vengono analizzati nella stessa corsa elettroforetica. Diluire i campioni di liquido cerebrospinale nel Diluente (R7) per ottenere una diluizione di 1:2: 150 µl di campione di liquido cerebrospinale e 150 µl di Diluente (R7). Fatta eccezione per la diluizione dei campioni di liquido cerebrospinale, seguire rigorosamente il protocollo descritto sopra per i campioni di siero o plasma. 8- CALCOLO E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI CALCOLO DEL VALORE SOGLIA (CUT-OFF) (CO) Il valore di Cut-Off (CO) corrisponde al valore medio delle densità ottiche (DO) dei duplicati del controllo cut-off (R4): CO = media di DO R CALCOLO DEL RAPPORTO CAMPIONE (SIERO O PLASMA) Il risultato per un campione viene espresso sotto forma di rapporto mediante la seguente formula: Rapporto Campione = DO campione/co 8.3. CONTROLLO DI QUALITA Analizzare i risultati ottenuti da tutti i controlli per ogni micropiastra e per ogni ciclo. Per la convalida del test, è necessario soddisfare i seguenti criteri: Valori delle densità ottiche : - CO > 0,200

13 - 0,80 x CO < DO R4 Duplicato 1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < DO R4 Duplicato 2 < 1,20 x CO (La singola DO di ogni duplicato del controllo cut-off (R4) non deve differire più del 20% dal valore CO). Rapporti delle densità ottiche : - Rapporto R3 (DO R3 / VS) < 0,5 - Rapporto R5 (DO R5 / VS) > 2,0 Se non vengono rispettati i criteri del controllo di qualità, la seduta analitica dovrà essere ripetuta INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (SIERO O PLASMA) Rapporto campione Risultato Interpretazione Rapporto < 0,80 Negativo Il campione è considerato non reattivo per la presenza di anticorpi IgG anti-borrelia burgdorferi sensu lato. 0,80 Rapporto < 1,2 Equivoco Il campione è considerato equivoco per la presenza di anticorpi IgG anti-borrelia burgdorferi sensu lato. Il risultato deve essere confermato da un altro test eseguito su un secondo campione prelevato ad almeno 3 settimane di distanza dalla data della prima analisi. Rapporto 1,2 Positivo Il campione è considerato reattivo per la presenza di anticorpi IgG anti-borrelia burgdorferi sensu lato. In caso di sospetta infezione, potrebbe essere utile condurre ulteriori test sierologici, come la determinazione degli anticorpi IgM anti-borrelia, per confermare la diagnosi. Se l'esito del test sierologico è positivo o equivoco, si raccomanda di analizzare il campione con un metodo di conferma quale il Western-Blot (8) CALCOLO PER LA DETERMINAZIONE DELLA SINTESI INTRATECALE La determinazione della sintesi intratecale viene fatta con il calcolo dell indice di anticorpi IgG (AI IgG) utilizzando la formula di Reiber (9,10,11). Per ogni campione appaiato di siero e liquido cerebrospinale, stabilire i valori di DO rispettivi (DO IgG Siero, DO IgG LCS) e verificare che rientrino in un intervallo compreso tra 0,000 e 3,000. ATTENZIONE: se le DO del siero (DO IgG Siero) o le DO del liquido cerebrospinale (OD IgG LCS) non rientrano nell intervallo summenzionato, rianalizzare il campione utilizzando una diluizione maggiore del campione stesso nel Diluente R7 fornito in dotazione al kit. 103

14 Dopo la diluizione, le DO del campione devono essere comprese tra 0,000 e 3,000. In tal caso, prendere in considerazione il fattore di diluizione utilizzato per il calcolo dell indice di sintesi intratecale delle IgG (vedere sotto). Per ogni siero analizzato, stabilire i dati seguenti: Albumina (g/l) = Albumina Siero IgG totali (g/l) = IgG totali Siero Per ogni liquido cerebrospinale analizzato, stabilire i dati seguenti: Albumina (mg/l) = Albumina LCS IgG totali (mg/l) = IgG totali LCS Calcolare i diversi quozienti utilizzando le formule seguenti: Q Alb = Albumina LCS / [Albumina Siero x 1000] Q (IgG)lim = 0,93 x [Q Alb2 + (6 x 10-6 )] 1/2 1,7 x 10-3 Q IgG = IgG totali LCS / [IgG totali Siero x 1000] Q (IgG) spec. = DO IgG LCS / [DO IgG Siero x 50,5] ATTENZIONE: se ad esempio i campioni di liquido cerebrospinale e siero fossero rispettivamente diluiti in un rapporto di 1:5 e di 1:10 in modo da rientrare in un intervallo delle DO compreso tra 0,000 e 3,000, sarebbe necessario moltiplicare le DO del liquido cerebrospinale (DO IgG LCS) per 5 e le DO del siero (DO IgG Siero) per 10 prima di usare la formula di calcolo Q (IgG)spec. Determinare l indice degli anticorpi IgG (AI IgG) utilizzando una delle due formule seguenti: AI IgG = Q (IgG)spec. / Q IgG [se Q IgG < Q (IgG)lim] oppure AI IgG = Q (IgG)spec. / Q (IgG)lim [se Q IgG > Q (IgG)lim] 8.6. INTERPRETAZIONE DELL INDICE DI ANTICORPI (AI IgG) PER LA DETERMINAZIONE DELLA SINTESI INTRATECALE La formula di Reiber per la determinazione dell'indice di anticorpi IgG non si applica nelle situazioni seguenti: rapporto campione di liquido cerebrospinale < 0,50 (*) rapporto campione di liquido cerebrospinale 0,50, ma con rapporto siero/plasma < 0,50 (*) (*) Rapporto = DO / R4 medio Interpretare i risultati del liquido cerebrospinale in base all algoritmo seguente: 104

15 Determinare il rapporto liquido cerebrospinale Rapporto cerebrospinale < 0,50 Liquido cerebrospinale IgG negativo Rapporto cerebrospinale 0,50 Determinare il rapporto siero Rapporto siero < 0,50 Rapporto siero 0,50 Rapporto cerebrospinale < 0,80 Rapporto cerebrospinale 0,80 Formula di Reiber Non interpretare il risultato del liquido cerebreopsinale Liquido cerebrospinale IgG positivo Interpretazione indice di anticorpi IgG Algoritmo per la determinazione dell indice di anticorpi IgG utilizzando il kit Platelia Lyme IgG La sintesi intratecale delle IgG è confermata quando l indice di anticorpi IgG è superiore a 1,30. Non sussiste alcuna sintesi intratecale delle IgG quando l indice di anticorpi IgG è superiore a 0,70 ma inferiore o equivalente a 1,30. Il risultato non deve essere considerato valido se l indice di anticorpi IgG è inferiore o equivalente a 0,70 (errore procedurale, siero e liquido cerebrospinale non prelevati lo stesso giorno, contaminazione del liquido cerebrospinale, ecc.). Interpretazione (AI IgG) Positivo AI IgG > 1,30 Negativo 0,70 < AI IgG 1,30 Risultato non valido AI IgG 0, GUIDA ALLA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI Le reazioni non convalidate o non ripetibili spesso sono causate da: Lavaggi della micropiastra inadeguati. Contaminazione dei campioni negativi tramite siero o plasma con alto titolo di anticorpi. 105

16 Contaminazione della soluzione di sviluppo tramite agenti chimici ossidanti (candeggina, ioni metallici...). Contaminazione della Soluzione bloccante ESEMPIO DI CALCOLO (SIERO O PLASMA) N.B.: i seguenti dati vengono forniti a titolo esemplificativo e non devono essere sostituiti ai risultati ottenuti dall'utente. Valore di cut-off: - CO = (0,502+0,498)/2 = 0,500 Valori delle densità ottiche : - DO CO = 0,500 (N > 0,200) - DO R4 Duplicato 1 = 0,502 (0,80 x DO CO < DO R4 Duplicato 1 < 1,20 x DO CO) - DO R4 Duplicato 2 = 0,498 (0,80 x DO CO < DO R4 Duplicato 2 < 1,20 x DO CO) Rapporti delle densità ottiche : - Rapporto R3 = 0,29 (N < 0,5) - Rapporto R5 = 2,88 (N > 2,0) Controllo di qualità: Conforme 9- EFFICACIA 9.1. PREVALENZA Al fine di determinare la prevalenza degli anticorpi IgG anti-borrelia burgdorferi sensu lato nel siero umano, sono stati analizzati 295 campioni di sangue di donatori residenti nel nord della Francia. I risultati ottenuti sono stati i seguenti: 291 sieri negativi, 1 equivoco e 3 positivi. La prevalenza determinata mediante il test Platelia Lyme IgG si attesta intorno all'1,02% (3/295). 106 Controlli e campioni dei DO (450/620 nm) Rapporto Risultato pazienti R3 0,144 0,29 Negativo R4 0,502 / / R4 0,498 / / R5 1,440 2,88 Positivo Campione 1 1,650 3,30 Positivo Campione 2, etc... 0,120 0,24 Negativo

17 9.2. SPECIFICITA Specificità nelle zone non endemiche La specificità è stata determinata su un pannello di 279 sieri prelevati da donatori di sangue sani residenti in una zona non endemica nel nord della Francia. I campioni sono stati selezionati sulla base dei risultati negativi ottenuti con il test EIA distribuito in Europa (marchio CE) e considerato lo standard di riferimento Specificità nelle zone endemiche La specificità è stata inoltre determinata su un pannello di 193 sieri prelevati da donatori di sangue sani residenti in zone endemiche nelle regioni orientali della Francia, nessuno dei quali presentava antefatti correlati alla malattia di Lyme (nessun sintomo clinico di borreliosi, né anamnesi di morsi di zecca). I campioni sono stati selezionati sulla base dei risultati negativi ottenuti con il test EIA distribuito in Europa (marchio CE) e considerato lo standard di riferimento. I risultati ottenuti sono riportati nella seguente tabella: Pannello di sieri Negativo Equivoco (1) Positivo (2) Specificità Zona non endemica (n=279) [IC 95%] (3) Zona endemica (n=193) [IC 95%] (278/278) [98,9%-] 99,5% (190/191) [97,1%-99,9%] (1) I risultati equivoci sono stati esclusi dal calcolo della specificità. (2) Il campione positivo al test Platelia Lyme IgG è risultato negativo al test Western-Blot. (3) IC 95%: intervallo di confidenza 95% SENSIBILITA La sensibilità del test Platelia Lyme IgG è stata calcolata e inclusa nei risultati della sensibilità ottenuti dal test Platelia Lyme IgM (Rif ) su un panello di 70 campioni di pazienti affetti da diverse forme di malattia di Lyme a diversi stadi clinici. I risultati, presentati nella tabella riportata di seguito, offrono un confronto con i dati sulla sensibilità ottenuti mediante il test EIA distribuito in Europa (marchio CE) e considerato lo standard di riferimento: 107

18 Stadio clinico Eritema migrante (Stadio I) [IC 95%] Neuroborreliosi (Stadio II) [IC 95%] Acrodermatite cronica atrofizzante (Stadio III) [IC 95%] Artrite di Lyme (Stadio III) [IC 95%] Numero di sieri Platelia Lyme (1) Riferimento Europa (1) IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM 66,7% [38,4%-88,2%] 96,9% [83,4%-99,9%] [54,9%-] 58,8% [32,9%-81,6%] 36,7% [19,9%-56,1%] 20,0% [0,05%-71,6%] 82,4% [56,6%-96,2%] 96,9% [83,4%-99,9%] [54,9%-] (1) I risultati equivoci sono stati esclusi dal calcolo della sensibilità. La sensibilità del test Platelia Lyme IgG è stata inoltre dimostrata su un pannello documentato di campioni forniti dal CDC (Center for Disease Control) e confrontata con i dati sulla sensibilità ottenuti mediante il test EIA distribuito in Europa (marchio CE) e negli Stati Uniti (approvato dall'fda) considerato lo standard di riferimento. I risultati ottenuti sono riportati nella seguente tabella: Stadio clinico Eritema migrante [IC 95%] Artrite / Artralgia [IC 95%] Non determinato [IC 95%] 15 Numero di sieri [81,9%-] 0,0% [0,0%-18,1%] [81,9%-] (1) I risultati equivoci sono stati esclusi dal calcolo della sensibilità. 93,3% [68,1%-99,8%] 97,0% [84,2%-99,9%] [54,9%-] [81,9%-] Riferiment Riferiment Platelia Lyme (1) o Europa (1) o USA (1) IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM IgG + IgM 38,5% [20,2%- 59,5%] [60,7%- ] [36,8%- ] 73,7% [48,8%- 90,9%] 40,0% [5,3%- 85,3%] [0,05%- ] 86,4% [65,1%- 97,1%] [60,7%- ] [47,3%- ] 70,4% [49,8%- 86,3%] [60,7%- ] [19,4%- 99,9%] 87,0% [66,4%- 97,2%] [60,7%- ] [36,8%- ] 108

19 9.4. CALCOLO DELL INDICE DI ANTICORPI IgG PER LA DETERMINAZIONE DELLA SINTESI INTRATECALE È stata effettuata una valutazione esterna su 104 campioni appaiati di pazienti non affetti da malattia di Lyme (n=19) o con malattia di Lyme sospetta (n=29), probabile (n=36) e confermata (n=20). I risultati dettagliati sono presentati di seguito per ogni categoria: Stato Malattia di Lyme non presente Sospetta malattia di Lyme Probabile malattia di Lyme Malattia di Lyme confermata Totale Liquido cerebrospi nale non interpretabile Liquido cerebros pinale negativo Liquido cerebros pinale positivo Indice AI IgG positivo Indice AI IgG negativo Indice AI IgG non valido Stato Malattia di Lyme non presente Sospetta malattia di Lyme Probabile malattia di Lyme Malattia di Lyme confermata Totale Positivo (rapporto liquido cerebrospinale o AI IgG) Negativo (rapporto liquido cerebrospinale o AI IgG) Non interpretabile (rapporto liquido cerebrospinale o AI IgG) 19 1 (5,3%) 18 (94,7%) 0 (0,0%) (48,3%) 15 (51,7%) 0 (0,0%) (66,7%) 10 (27,8%) 2 (5,5%) (85,0%) 2 (10,0%) 1 (5,0%) 109

20 9.5. PRECISIONE Precisione intra-saggio (ripetibilità): Al fine di valutare la ripetibilità intra-saggio, un campione negativo, un campione equivoco e due campioni positivi sono stati analizzati 30 volte durante lo stesso ciclo. Il rapporto (DO campione / CO) è stato determinato per ciascun campione. La tabella riportata di seguito fornisce la media dei rapporti, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione (%CV) per ciascuno dei quattro campioni: Precisione intra-saggio (ripetibilità) N=30 Campione negativo Campione equivoco Campione debolmente positivo Rapporto (DO campione / Valore di cut-off) Campione fortemente positivo Media 0,10 0,95 1,38 6,31 DS 0,007 0,082 0,116 0,134 % CV 6,0% 8,6% 8,4% 2,1% Precisione inter-saggio (riproducibilità): Al fine di valutare la riproducibilità inter-saggio, un campione negativo, un campione equivoco e due campioni positivi sono stati analizzati in duplicato in due cicli al giorno per un periodo di oltre 20 giorni. Il rapporto (DO campione / CO) è stato determinato per ciascun campione. La tabella riportata di seguito fornisce la media dei rapporti, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione (%CV) per ciascuno dei quattro campioni: Precisione inter-saggio (riproducibilità) N=80 Campione negativo Campione equivoco Campione positivo Campione fortemente positivo Rapporto (DO campione / Valore di cut-off) Media 0,19 0,85 3,92 6,67 DS 0,032 0,115 0,335 0,650 % CV 17,3% 14,8% 8,4% 9,7% 110

21 9.5. REATTIVITA CROCIATA 384 campioni ematici con caratteristiche tali da determinare reazioni non specifiche sono stati analizzati con il test Platelia Lyme IgG. I risultati ottenuti sono riportati nella seguente tabella: Pannello Numero di campioni Equivoco (1) Positivo Reattività crociata % Sifilide ,3% (2) CMV ,0% (2) EBV ,0% Leptospirosi ,1% (2) Malaria ,3% (2) Anticorpi antinucleo (ANA) ,0% Anticorpi eterofili (HAMA) ,0% Fattore reumatoide ,3% (2) HSV ,0% Toxoplasmosi ,0% Rosolia ,0% Morbillo ,0% Parotite epidemica ,0% HIV ,0% VZV ,0% TOTALE ,33% (1) I risultati equivoci sono stati esclusi dal calcolo della reattività crociata. (2) Non significativamente diverso dalla percentuale di prevalenza nelle zone endemiche (Test Fisher, p>0,05). I 2 sieri CMV e Malaria risultati positivi al test Platelia Lyme IgG e al test EIA distribuito in Europa (marchio CE) non sono stati confermati con il metodo Western-Blot. Il siero Fattore reumatoide risultato positivo al test Platelia Lyme IgG è stato confermato sia dal test EIA distribuito in Europa sia dal metodo Western-Blot. Il siero Leptospirosi, positivo al test Platelia Lyme IgG, è risultato equivoco al test EIA distribuito in Europa e confermato negativo al metodo Western-Blot. Il siero Sifilide risultato positivo al test Platelia Lyme IgG è stato confermato negativo sia al test EIA distribuito in Europa sia al metodo Western-Blot. 111

22 10- LIMITI DELLA PROCEDURA La diagnosi dell'infezione da Borrelia burgdorferi può essere stabilita solamente sulla base di una combinazione di dati clinici e biologici. Il risultato di un singolo test di ricerca degli anticorpi IgG anti-borrelia burgdorferi non costituisce una prova sufficiente per la diagnosi dell'infezione da Borrelia burgdorferi sensu lato. Se l'esito del test sierologico è positivo o equivoco, si raccomanda di analizzare il campione con un metodo di conferma quale il Western-Blot (8). La diagnosi della malattia di Lyme può essere stabilita solo sulla base di una combinazione di dati clinici e biologici del paziente. I risultati del liquido cerebrospinale e l interpretazione ottenuti utilizzando questo protocollo non devono essere considerati da soli e non costituiscono una prova sufficiente per la diagnosi. Il calcolo dell indice di anticorpi IgG utilizzando la formula di Reiber con questo protocollo non è valido se non vengono considerati tutti i dati biologici (Albumina Siero, Albumina LCS, IgG totali Siero, IgG totali LCS, DO IgG Siero e DO IgG LCS). È inoltre importante utilizzare le unità corrette come descritto nella formula di cui sopra. Questo protocollo è stato adattato solo per gli anticorpi IgG anti-borrelia. Non è stato valutato per gli anticorpi IgM anti-borrelia e per gli altri anticorpi IgG. Questo protocollo è stato adattato solo per l analisi del liquido cerebrospinale. Non sono stati valutati altri liquidi biologici (liquido sinoviale, ecc.). 11- CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORE Tutti i reagenti prodotti sono preparati conformemente al nostro Sistema di qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione del prodotto finale. Ogni lotto è sottoposto a un controllo di qualità e può essere commercializzato solo se conforme ai criteri di accettazione prestabiliti. La documentazione relativa alla produzione e ai controlli di ogni singolo lotto è conservata presso Bio-Rad. 12- RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI Vedere la versione Inglese. 112