COME PRODURRE UN FIORE

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1 COME PRODURRE UN FIORE STUDIARE I GENI COINVOLTI NELLO SVILUPPO FIORALE Dott.ssa Gregis Veronica

2 Ibridazione in situ Dov è espresso il gene d interesse? In che tessuti e strutture è presente il suo mrna? Questa metodica si basa sull ibridazione di sonde marcate direttamente su cellule o tessuti. Si può ibridare su sezioni istologiche o su materiale non sezionato (in quest ultimo caso si parla whole mount). E una delle poche tecniche che permette di localizzare l espressione di un dato mrna a livello delle singole cellule. Ideale per studiare i geni espressi in un gruppo ristretto di cellule all interno di un tessuto, o i geni la cui espressione è modulata nel tempo e nello spazio (estremamente utilizzata negli studi di biologia dello sviluppo).

3 Ibridazione in situ IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI Ibridazione: appaiamento di 2 molecole di DNA o RNA complementari

4 Ibridazione in situ Fissaggio del tessuto e imbibizione in paraffina Scelta del tessuto da analizzare Taglio del tessuto al microtomo Ibridazione con sonda a RNA antisenso Fette di 8 μmda montare su vetrini polilisinati

5 Metodi di marcatura degli acidi nucleici Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro

6 Metodi di marcatura degli acidi nucleici

7 Metodi di marcatura degli acidi nucleici

8 Metodi di marcatura degli acidi nucleici RNA

9 Metodi di marcatura degli acidi nucleici MARCATURA CON DIGOSSIGENINA Si basa sull incorporazione nella catena di DNA, in fase di sintesi, di deossiuridina trifosfato il quale, mediante un braccio spaziatore, porta legata la digossigenina (Dig dutp). MARCATURA CON FLUORESCINA La fluorescina è legata all uridina mediante un braccio spaziatore. digossigenina fluoresceina

10 Metodi di marcatura degli acidi nucleici

11 Metodi di marcatura degli acidi nucleici La sonda così ottenuta viene utilizzata per l ibridizzazione su vetrino e viene rivelata immunologicamente utilizzando un anticorpo monoclonale anti digossigenina o anti fluorescina coniugato con la fosfatasi alcalina. Si forma così un complesso evidenziato aggiungendo un adatto substrato della fosfatasi alcalina (X fosfato) e il colorante nitroblutetrazolio (NBT) oppure Fast Red chromogen.

12 Ibridazione in situ Sonda antisenso specifica per il gene SVP marcata con Dig-dUTP

13 Ibridazione in situ doppia marcatura Sonda antisenso specifica per il gene TFL1 marcata con DigdUTP Sonda antisenso specifica per il gene LFY marcata con FluorescindUTP

14 Utilizzo dei fluorofori per la localizzazione di proteine in vivo mrna di SVP presente nei primordi del fiori MA LA PROTEINA DOVE SI TROVA??? Posso creare una proteina di fusione con la GFP!

15 Utilizzo dei fluorofori per la localizzazione di proteine in vivo Perché la GFP? l'assorbimento ha dei picchi con radiazioni a lunghezze d'onda di 395 nm (ultravioletto) e 475 nm (spettro visibile blu) mentre l'emissione avrà un picco massimo intorno a 505 nm (colore verde). la fluorescenza della GFP è un fenomeno intrinseco alla stessa proteina e non richiede substrati né enzimi legata covalentemente ad altre proteine, non interferisce con la normale attività della molecola a cui è legata. Esistono diverse varianti con diverse caratteristiche di assorbimento ed emissione : YFP (yellow fluorescent protein) giallo CFP (cyan fluorescent protein) azzurro grigio BFP (blue fluorescent protein) blu.

16 Utilizzo dei fluorofori per la localizzazione di proteine in vivo ATG TGA psvp SVP genomic region GFP bp 6300 Plasmide contenente la proteina di fusione E. coli Agrobacterium Arabidopsis Controllo la presenza del costrutto in pianta e l espressione della proteina di fusione

17 Utilizzo dei fluorofori per la localizzazione di proteine in vivo mrna di SVP Il trascritto è presente nei primordi dei fiori prima della differenziazione degli organi fiorali Proteina di fusione psvp:svp GFP La proteina si localizza nei nuclei delle cellule dei primordi The Arabidopsis floral meristem identity genes AP1, AGL24 and SVP directly repress class B and C floral homeotic genes V. Gregis, A. Sessa, C. Dorca Fornell and M. Kater. The Plant Journal 2009

18 Utilizzo dei fluorofori per la localizzazione di proteine in vivo Confocal microscopic analysis of SEP3:GFP localisation in inflorescence meristem and early flower bud stages. (A) Overview of an inflorescence with the inflorescence meristem and early flower bud stages 1 to 5 indicated. SEP3:GFP protein is detected as green signal and cell membranes are stained with the red dye FM4 64. (B) Detail of an inflorescence meristem and a stage 2 flower bud. (C) Section through tissue in (B) showing the SEP3:GFP signal in the epidermis and the beginning SEP3:GFP signal in the centre of the stage 2 flower bud. (D) Detail of a stage 4 flower bud showing the highest SEP3:GFP signal in the entire floral meristem and only in the epidermis of the four sepals. (E) Section through the stage 4 flower bud in (D) showing both cytoplasmic and nuclear localisation of SEP3:GFP in the future second and third whorl, and only nuclear localisation in the innermost part of the floral meristem. (F) More basal section through the stage 4 flower bud in (D) showing again both cytoplasmic and nuclear localisation of SEP3:GFP in the future second and third whorl. In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana S. Urbanus, S. de Folter, A.Shchennikova, K. Kaufmann, R.Immink and G.Angenent. BMC Plant Biology 2009,

19 Molecole e cellule a colori CusMiBio, Milano Settembre 2010 Dott.ssa Colombo Monica

20 Il microscopio ottico: sfrutta la luce con lunghezza d'onda dal vicino infrarosso all'ultravioletto, coprendo tutto lo spettro visibile. Campione da osservare: deve permettere il passaggio della luce che lo illumina da sotto. Stereomicroscopio ottico Utilizza due percorsi ottici separati diversamente allineati con due obiettivi e due oculari per provvedere immagini leggermente diversamente angolate agli occhi destro e sinistro. In questo modo produce una visione stereoscopica del campione in esame. Il campione può essere osservato tal quale, senza necessità di un trattamento particolare. Gli ingrandimenti ottenibili vanno da poche unità a circa 200 X.

21 Il Microscopio Elettronico a Scansione (SEM) Sfrutta la generazione di un fascio elettronico ad alta energia nel vuoto. Alti ingrandimenti (fino a x) Alta risoluzione (limite 2nm) Tridimensionalità Versatilità: sia per quanto riguarda la natura (solo materiali contenenti fluidi non sono analizzabili) che forma e dimensioni (di qualunque forma, fino a circa un decimetro cubo) Facile preparazione del campione: qualora non siano naturalmente conduttivi (metalli), devono solo essere ricoperti da un sottilissimo strato di un elemento conduttore (grafite o oro).

22 Generatore di elettroni, dove viene creato il fascio di elettroni il fascio viene focalizzato da un sistema di lenti e deflesso per scandire una area del campione nella camera da vuoto il fascio elettronico interagisce con il campione (scansione) L interazione fascio-campione genera vari segnali che vengono acquisiti da vari tipi di rivelatori e trasferiti agli elaboratori Sullo schermo si ricostruisce l immagine a livelli di grigio

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24 E molto importante, quando si studia lo sviluppo, conoscere il profilo di espressione dei geni sotto indagine. E cioè necessario conoscere in quale stadio dello sviluppo essi sono attivi, in quale parte eachelivello di attività essi sono espressi. I metodi in situ sono quelli sviluppati per rivelare in un campione i domini spaziali dove avviene l espressione dei geni. L ibridizzazione in situ rivela le regioni del campione dove uno specifico mrna è presente. Con la tecnica dei reporter genes è possibile vedere se in un campione una data sequenza regolativa (promotore) è attiva.

25 Saggio GUS (saggio istochimico di attività β-glucuronidasica): è una tecnica di biologia molecolare utile per l'analisi dell'attività di un promotore. La tecnica è basata sull'enzima di Escherichia coli β-glucuronidasi (uida); questo enzima idrolizza specifici substrati incolori e non fluorescenti (non endogeni), convertendoli in sostanze colorate, dunque visibili all'operatore. La sequenza regolativa da testare è fusa al gene (β-glucoronidasi). Se la sequenza regolativa è attiva in quello specifico tessuto o stadio, il gene è espresso. Esistono diversi glucuronidi che possono essere usati come substrato della reazione enzimatica. Per la colorazione istochimica viene utilizzato prevalentemente il 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucuronide (X-Gluc) che, idrolizzato, produce una molecola blu insolubile che viene facilmente visualizzata nel posto dove si forma e con alta sensibilità. Un organismo è adatto per il saggio GUS se non ha una propria attività β- glucuronidasica o la propria attività risulta talmente bassa da rappresentare un disturbo accettabile. Per questa ragione il saggio non può essere utilizzato in quasi tutti i vertebrati e in molti molluschi. Nelle piante superiori, nei muschi, nelle alghe, nei funghi e in quasi tutti i batteri non c'è attività GUS endogena.

26 GUS expression analysis Tissues were prefixed in 90% acetone at 20 C for 1 h and washed three times for 5 min with 50 mm phosphate buffer (ph 7.0) before incubation at 37 C overnight in reaction buffer (1 mg ml 1 X-Gluc, 0.1% Triton X-100, 2 mm Fe 2+ CN, 2 mm Fe 3+ CN, 50 mm phosphate buffer ph 7.0, 10 mm EDTA). Tissues were cleared in 70% ethanol, then mounted in glycerol 20% and observed. (A-E): SHP2::GUS (F-L): STY1::GUS (M S) NGA3:GUS

27 Altri sistemi reporter Altri sistemi in competizione con il GUS sono basati su, per esempio, luciferasi, GFP, β-galattosidasi, cloramfenicolo acetiltransferasi e fosfatasi alcalina. GFP: Il gene è fuso a quello di proteine di interesse in modo che, quando la fluorescenza è visibile nel campione, significa che la proteina a cui la GFP è legata è espressa. La luminescenza di GFP è un fenomeno intrinseco alla stessa proteina e non richiede substrati né enzimi.

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