DIAGNOSI DELLE MALATTIE da διά (diá, attraverso) + γιγνώσκειν (ghignóskein, conoscere)

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1 DIAGNOSI DELLE MALATTIE da διά (diá, attraverso) + γιγνώσκειν (ghignóskein, conoscere) È la procedura che consente l identificazione dell agente causale (eziologico) di uno stato morboso, in base ai sintomi oggettivi ed eventualmente anche ai risultati di indagini di laboratorio.

2 Diagnosi sintomatica: esame dei sintomi e confronto, per analogia, con quanto noto in letteratura. Criteri per la diagnosi/i Diagnosi funzionale: manca di specificità: è basata sulle alterazioni della funzionalità della pianta (es. fotosintesi). Diagnosi ex-juvantibus: sulla base del rimedio risultato efficace si individua il fattore di stress; ad es.: fertilizzanti e carenze nutrizionali; irrigazione e carenza idrica; aria filtrata ed inquinanti aerodispersi. Diagnosi biologica: individuazione dell agente mediante indagini molecolari, microbiologiche, microscopiche, immunologiche, saggi di trasmissione.

3 Criteri per la diagnosi/ii Diagnosi sintomatica (su base semeiotica, dal greco σημεῖον, semèion, segno, e τέχνη, arte ): esame dei sintomi e dei segni (sindrome, quadro clinico) e confronto, per analogia, con quanto noto in letteratura; si opera su campioni o in campo, su aree campione ; esame dell intera pianta (o, meglio, di individui diversi) in varie fasi. Si definiscono patognomonici (da pathos, πάθος, sofferenza, malattia, e gnomonikos, γνώμον, giudice, indicatore ) i sintomi caratteristici ed esclusivi di una malattia, tali da accreditare la diagnosi, al di là di ogni dubbio; sono di sospetto quelli che si limitano ad indirizzare il ragionamento diagnostico verso una serie di possibili cause. Convergenza e divergenza sintomatica

4 Sintomi e segni della malattia = semeiotica Sintomi: le reazioni o alterazioni esterne o interne di una pianta come risultato di una malattia parassitaria o non. Segni: il patogeno o parti e prodotti di esso presenti su una pianta In Medicina umana i segni (reperti obiettivi, riconosciuti dal medico nel corso dell esame clinico, es. pressione arteriosa, temperatura) sono diversi dai sintomi, che sono invece esperienze soggettive riferite dal paziente, come ad esempio la fatica.

5 Sintomi fogliari/i La clorosi è un sintomo reversibile di eziologia generica, dovuto a insufficiente formazione di clorofilla o ad una sua anomala degradazione. Può manifestarsi a mosaico, a variegature, con striature nervali o internervali, con macchie anulari.

6 Sintomi fogliari/ii La necrosi è un sintomo irreversibile di eziologia generica e consiste nella morte di regioni fogliari, variamente distribuite

7 Sintomi fogliari/iii Laciniatura vs bolla fogliare Arresto di sviluppo dei tessuti internervali della lamina fogliare Deformazioni dovute all anomalo accrescimento delle regioni internervali; le aree bollose assumono una colorazione anomala tendente al rosso

8 Necrosi sui frutti

9 I sintomi necrotici più comuni sono: Leaf spots: lesioni localizzate sulle foglie che consistono di cellule morte Blight: estremamente rapido e generalizzato imbrunimento e morte delle foglie, rami e fiori Canker: lesioni necrotiche sul fusto e su organi carnosi Dieback: necrosi estensiva di un ramoscello Root rot: disintegrazione o decadimento di parte o tutta la radice Damping-off: rapida morte e collasso dei germinelli Soft rots: macerazione di frutti, radici, bulbi Anthracnose: lesioni necrotiche e secche sullo stelo, foglie, frutti Scab: lesione localizzate che si rompono dando un apparenza scabbiosa Decline: progressiva perdita di vigore

10 Rottura del colore dei fiori Virescenza Tulip Breaking Virus (TBV) Camellia Yellow Mottle Virus (CYMV)

11 SINTOMI SU ORGANI LEGNOSI/I SCOPAZZO: aumento delle ramificazioni primarie e secondarie, che vanno a costituire un insieme affastellato ed asimmetrico (es. virosi; infezioni da fitoplasmi); deriva da blastomania (contemporanea attivazione di gemme dormienti) FASCIAZIONE: appiattimento di organi cilindrici (es. infezione batterica)

12 SINTOMI SU ORGANI LEGNOSI/II TUMORI E GALLE: accrescimento anormale (ipertrofia e/o iperplasia) di un gruppo di cellule, che prende l aspetto di una massa rotondeggiante di consistenza carnosa o legnosa; crescita indefinita e definita (es. batteriosi) CANCRO: lesione localizzata su organi legnosi con formazione di una ferita aperta intorno alla quale si instaurano processi di reazione iperplastica; in alcuni casi dalle ferite fuoriesce un flusso gommoso

13 Cancro e tumore in Patologia animale e Patologia vegetale In Patologia animale: Il tumore (dal latino tumor, rigonfiamento) è una classe di malattie caratterizzate da una incontrollata riproduzione di alcune cellule dell organismo, che smettono di rispondere ai meccanismi fisiologici di controllo cellulare a seguito di danni al loro patrimonio genetico; si presenta sia in una forma benigna che in quella maligna (assumendo in questo secondo caso il nome di cancro). Quindi, il cancro è un tumore maligno. In Patologia vegetale: Il cancro è costituito da una lesione localizzata su organi legnosi con formazione di una ferita aperta intorno alla quale si instaurano processi di reazione iperplastica; in alcuni casi dalle ferite fuoriesce un flusso gommoso Il tumore è una massa cospicua di tessuto neoplastico (ipertrofico e iperplastico), a crescita indefinita, priva di organizzazione interna, con consistenza analoga a quella dell organo su cui è inserita.

14 GOMMOSI Processo patologico, che si manifesta con la formazione di sostanze gelatinose, incolori o brune, dette gomme o mucillagini; esse sono un miscuglio di molte sostanze, tra cui prevalgono gli arabani e i galattani e si rapprendono all aria. La gommosi è dovuta a degenerazione di cellule del legno, della corteccia, delle foglie, dei frutti e dei semi. Si distinguono gommosi non parassitarie, traumatiche e parassitarie.

15 La sharka delle drupacee (Plum Pox Virus, PPV)

16 APPASSIMENTO vs AVVIZZIMENTO APPASSIMENTO: evidente diminuzione del turgore cellulare causata da mancanza di acqua; è un fenomeno reversibile (elastico) AVVIZZIMENTO ( appassimento permanente, plastico): morte dei tessuti per carenza idrica

17 MODIFICAZIONE DELL ASPETTO GENERALE DELLA PIANTA Deficienze ed eccessi di sviluppo NANISMO: dimensione inferiore al normale di tutta la parte di essa Ipoplasia: riduzione del numero di cellule Ipotrofia: ridotto accrescimento cellulare pianta o GIGANTISMO: Iperplasia: aumento eccessivo del numero di cellule Ipotrofia: eccessivo accrescimento in volume delle cellule

18 MARCIUMI Si verificano quando la morte cellulare è preceduta dal disfacimento delle pareti cellulari Marciume secco, o mummificazione (asciutto e compatto) Marciume molle, o cancrena (molli e acquosi) Carie (tessuti asciutti e friabili) Scabbia: superficiali (asciutti e friabili)

19 Sintomi/segni patognomonici

20 Ancora sintomi/segni patognomonici

21 Sintomi di sospetto

22 CONVERGENZA SINTOMATICA agenti diversi causano su una pianta sintomi simili Può succedere (forse) che le deformazioni fogliari della bolla del pesco vengano confuse con attacchi di afidi. Nel caso della bolla la foglia, oltre che deformata, diventa carnosa al tatto e croccante-fragile, con frattura vitrea. Inoltre l attacco di afidi è riconoscibile dalla presenza sulla pagina inferiore degli insetti stessi. bolla afidi

23 a b CONVERGENZA SINTOMATICA Agenti diversi di stress provocano sintomi macroscopici molto simili (es. aerosol marini, aerosol marini, drift da torri di raffreddamento, sali antigelo, fluoruri aerodispersi, fiamma libera) c e d f

24 DIVERGENZA SINTOMATICA: ozono su mais, ravanello, soia, tabacco e viburno

25 Vademecum per la diagnosi Raccogliere informazioni (anamnesi), possibilmente sul campo, su: PIANTA: specie/cultivar, età, quadro delle operazioni colturali, origine del materiale SITO: terreno, eventi particolari (scavi, trattamenti), prodotti applicati (es. diserbanti), andamento meteo PROBLEMA: descrizione dei sintomi, distribuzione geografica (nella pianta e tra le piante, nel territorio), epoca di comparsa, evoluzione CONDIZIONI ORDINARIE della vegetazione circostante, comprese le piante spontanee

26 DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA DEI SINTOMI 1. Nella popolazione vegetale omogenea a bande a macchie di leopardo secondo un gradiente senza alcun criterio 2. Nella pianta omogenea secondo un gradiente (alto/basso; nord/sud) senza alcun criterio 3. Nella foglia omogenea al margine nelle regioni internervali a bande senza alcun criterio bifacciali o no Nel caso di lesioni fogliari: colore forma (lesioni individuali; aree estese; irregolari, tondeggianti, allungate) dimensioni margine/alone

27 Distribuzione dei sintomi nella foglia

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30 Distribuzione dei sintomi nella pianta

31 Distribuzione geografica delle piante malate/i Buxus sempervirens: esiti di infezione da Verticillium Cancro del cipresso Marciume radicale su abete e pioppo

32 Distribuzione geografica delle piante malate/ii Tracheofusariosi su banano Siepe di alloro morta di sete Marciume radicale su pino Telerilevamento ( remote sensing )

33 Il futuro (prossimo): telerilevamento di prossimità con immagini multispettrali acquisite da drone - UAV (Unmanned Aerial Vehicle) (=APR, Aeromobile a Pilotaggio Remoto)

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35 Criteri per la diagnosi/iii ( oltre i sintomi ) Diagnosi ex-juvantibus: sulla base del rimedio risultato efficace si individua il fattore di stress; ad es.: fertilizzanti e carenze nutrizionali; irrigazione e carenza idrica; aria filtrata ed inquinanti aerodispersi. Diagnosi biologica: individuazione dell agente mediante indagini molecolari, microbiologiche, microscopiche, immunologiche, saggi di trasmissione.

36 L accertamento di una diagnosi biologica deve soddisfare i postulati di Koch L individuazione certa del microbo responsabile della malattia è validata solo se sono rispettati i 4 postulati di Koch: Robert KOCH ( ) Scopritore del bacillo della TBC, premio Nobel per la Medicina nel ) l agente sospetto deve essere costantemente associato alla malattia 2) deve essere isolato e coltivato in purezza 3) inoculato nell ospite sano, deve indurre la stessa sintomatologia 4) lo stesso agente deve essere reisolato dall ospite che è stato sperimentalmente infettato

37 I postulati di Koch (su animali) 1 3 2

38 Isolamento di un patogeno fungino Ritaglio di sezioni di foglia dal margine delle lesioni Sterilizzazione superficiale in sodio ipoclorito, soluzione al 7%, 5 min. Trasferimento in sterilità in acqua distillata sterile (risciacquo) e quindi asciugamento su carta da filtro sterile Cappa a flusso laminare Collocazione delle sezioni di foglia in piastra su substrato agarizzato Accrescimento del patogeno su substrato Subcultura in purezza a partire da un frammento di micelio

39 Messa in piastra su substrato agarizzato di campioni Ma, se si lavora male.

40 Correlation is NOT causation 1850: la comparsa dell oidio sulla vite in Toscana è stata correlata con l introduzione della locomotiva a vapore! 1970: la comparsa della malattia fungina nota come Southern Corn Leaf Blight (Drechslera maydis razza T) su mais negli USA è stata correlata con l esplorazione lunare (1969)

41 Tasso di mortalità in autostrade USA popolazione (migliaia) numero di cicogne Importazione di limoni dal Messico (t)

42 Tar spot ( croste nere ) dell acero Rhytisma acerinum Edinburgo, anni 70: 1. La malattia è (quasi) assente in città, ma frequente in campagna. 2. L anidride solforosa (SO 2 ) è presente in città e (quasi) assente in campagna. pertanto (??) 3. SO 2 è responsabile della rarefazione della malattia in città. invece (!) Il patogeno sverna nelle foglie cadute al suolo. In città queste vengono spazzate via, mentre in campagna rimangono a terra a garantire la ripresa delle infezioni a primavera. Nessun ruolo di SO 2.

43 Chernobyl (URSS-Ucraina), 26 aprile 1986 Il maggiore incidente nucleare della storia in Europa Il 2 maggio piove in Toscana. Una settimana dopo si ammalano le foglie di platano. Ma è una infezione del fungo patogeno Apiognomonia veneta

44 I 5 criteri di causalità (indispensabili ai fini dell accertamento di una relazione causa-effetto nel caso di agenti abiotici) Sir Austin Bradford Hill (1965) - fumo/uomo/tumore polmone L associazione deve essere dimostrata in diversi studi ripetuti nel tempo e in varie condizioni Causalità: esistenza di un rapporto dose-effetto (cioè, più intensamente o a lungo agisce la presunta causa, più aumenta il rischio relativo) Misura la costanza con cui una specifica esposizione produce una determinata malattia. Difficilmente applicabile a malattie cronico-degenerative, ove un singolo determinante può provocare effetti assai diversi Ogni causa deve precedere il relativo effetto. Ma nelle malattie croniche la successione temporale degli eventi può essere difficile da stabilire. La plausibilità biologica richiede che la presunta causa sia verosimilmente inquadrabile nel contesto delle conoscenze sull argomento

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46 Malattie a eziologia monofattoriale o malattie monofattoriali Sono generate da una causa talmente forte da essere capace da sola, di provocare tutti gli eventi che conducono alla comparsa e allo sviluppo della malattia stessa. Sono le classiche malattie del passato (es. peronospora). Oggi, specie nel settore forestale, sono diffusi casi complessi cronico-degenerativi, che coinvolgono fattori diversi (biotici e non) che agiscono contemporaneamente o in successione sulla popolazione vegetale. Queste malattie sono dette multifattoriali o ad eziologia multifattoriale. Una situazione simile è presente in Medicina, ove si sono diffuse malattie misteriose e drammatiche, quali le demenze (Alzheimer), la neurodegenerazione nei disturbi del movimento (Parkinson), le malattie neuromuscolari (SLA Sclerosi Laterale Amiotrofica), ad eziologia incerta e indubbiamente multifattoriale.

47 Una tipica problematica ad eziologia multifattoriale : il deperimento forestale di nuovo tipo. Un deperimento (decline disease) ha queste caratteristiche: lento e progressivo aggravamento delle condizioni di salute e di vigoria, che colpisce prevalentemente una coorte matura di alberi, anche di specie diverse, con sofferenza generale, riduzione di accrescimento, microfillia, filloptosi, disseccamenti di rami. L eziologia è complessa e coinvolge importanti contributi da fattori biotici e abiotici. Impossibile individuare un agente specifico responsabile di tutto il quadro clinico.

48 Ciò che differenzia il deperimento da una malattia convenzionale è la mancanza di un agente specifico: il deperimento è un fenomeno complesso, causato da un insieme di fattori non specifici, abiotici (tra questi in particolare condizioni ambientali e cure inappropriate) e biotici, che interagiscono fra loro e fra loro sono intercambiabili, ben sintetizzati nella spirale del deperimento di Manion (1991) I fattori: Predisponenti (a lungo termine): clima, età, predisposizione genetica, condizioni ambientali. Possono predisporre le piante all attacco di fattori Scatenanti (a breve termine): gelo, siccità, insetti defogliatori; se non fossero già presenti fattori predisponenti, le piante potrebbero recuperare, ma invece esse divengono vulnerabili ai fattori Complementari: insetti e funghi opportunisti. Ad essi il compito di affibbiare il colpo di grazia, ma normalmente non sarebbero importanti se l albero non fosse deperiente.

49 DISSECCAMENTO RAPIDO DELL OLIVO NEL SALENTO ha di territorio in Provincia di Lecce, ovvero circa 6000 piante. Tutto è iniziato quando è comparso un disseccamento anomalo delle foglie, con un imbrunimento della parte legnosa dei tronchi e dei rami e un deperimento complessivo. Il legno dell annata nelle piante deperenti è estesamente imbrunito e colonizzato da funghi tracheomicotici del genere Phaeoacremonium. Gli imbrunimenti causati da questi miceti sono solitamente collegati alla presenza di gallerie del rodilegno giallo (Zeuzera pyrina). Nelle piante sintomatiche di olivo (ma anche di mandorli ed oleandri con bruscature fogliari presenti nelle vicinanze degli oliveti colpiti) è stato identificato, sia con saggi molecolari che sierologici, un ceppo del batterio Xylella fastidiosa, un agente da quarantena non segnalato in Europa e nel Bacino del Mediterraneo.

50 Diagnosi sierologica Diverse molecole organiche (proteine) hanno potere antigeno: iniettate in un animale stimolano la produzione di anticorpi (immuno-globuline, Ig) da parte dei linfociti del sangue; gli anticorpi diffondono nel sangue e tendono a combinarsi con le sostanze che li hanno indotti. Un siero (parte non corpuscolare del sangue) che contiene anticorpi è detto antisiero (contro uno specifico antigene). La reazione avviene anche al di fuori del corpo dell animale. Preparazione dell antisiero: iniettare sospensione virale purificata in animale (coniglio). Le IgG (gamma-globuline) sono le immunoglobuline più diffuse. Hanno una caratteristica struttura: gli antigeni sono agganciati dal sito di legame degli anticorpi a formare un complesso di macromolecole, che in un mezzo liquido tendono a precipitare anticorpo sistema chiave-serratura

51 Diagnosi sierologica: metodo ELISA (virologia) ELISA è un acronimo derivato dall espressione inglese Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Saggio Immuno-Assorbente legato ad un Enzima). Si tratta di un metodo d analisi immunologica per rilevare la presenza di un patogeno (antigene) usando uno o più anticorpi ad uno dei quali è legato un enzima in grado di determinare una reazione colorimetrica in presenza di un substrato specifico. E talmente sensibile che può essere applicato su materiale tal quale, senza procedimenti di estrazione/purificazione del virus. DAS-ELISA diretto (quando l analita possiede almeno due epitopi) (double antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay): A. nei pozzetti di una piastra di polistirene si fanno aderire gli anticorpi (primari) purificati (sensibilizzazione della piastra) - incubazione e lavaggio B. si aggiungono gli estratti del campione da esaminare - incubazione e lavaggio C. i pozzetti vengono riempiti con l enzima fosfatasi alcalina coniugata all anticorpo secondario - incubazione e lavaggio (l enzima permarrà solo nei pozzetti nei quali è presente l antigene) D. si riempiono i pozzetti con p-nitrofenilfosfato (substrato incolore), che cambia colore in presenza dell enzima, e quindi sono presenti gli antigeni (si forma p-nitrofenolo, giallo); il metodo è (anche) quantitativo

52 DAS-ELISA indiretto (DASI-ELISA) (determina la presenza di anticorpi, a loro volta legati alla presenza di antigeni) DAS-ELISA diretto (determina la presenza di antigeni) substrato enzima anticorpo terziario anticorpo secondario antigene anticorpo primario fosfatasi alcalina p-nitrofenilfosfato p-nitrofenolo + fosfato giallo intenso

53 DAS-ELISA diretto substrato enzima anticorpo antigene (virus) anticorpo

54 Diagnosi sierologica: valutazione dei risultati Nella piastra è sempre opportuno inserire due campioni di controllo (un positivo ed un negativo). Seguire l evoluzione della reazione colorimetrica con attenzione nelle prime fasi, prendendo come riferimento il controllo positivo che diventerà sempre più giallo con il passare del tempo, similmente ai campioni infetti. La colorazione può essere valutata tramite lettura visiva o con un apposito fotometro a 405 nm in grado di registrare l assorbanza di ogni pozzetto. Se l assorbanza di un campione supera di oltre 2 volte quella del controllo sano, il campione viene considerato come positivo, perciò infetto dal virus indagato.

55 Diagnosi molecolare Analisi degli acidi nucleici del patogeno, mediante tecniche di DNA ricombinante. Conoscendo la sequenza di una parte di acido nucleico del patogeno, si produce una sonda molecolare (di norma alcune centinaia di basi), che viene confrontata con un campione da indagare (acido nucleico complementare, target, anche solo 100 ng di DNA), con il quale si ibrida, se compatibile.

56 PCR (reazione a catena della polimerasi): Questa tecnica è stata ideata da Kary Mullis intorno ai primi anni 80 in medicina umana (per la diagnosi prenatale dell anemia falciforme). Successivamente è stata perfezionata e automatizzata al punto da rivoluzionare la biologia molecolare, sostituendo molte tecniche di clonaggio tradizionale. Ad oggi, numerose varianti della PCR trovano applicazione nella ricerca di base in ambito forense, in quanto consentono di amplificare sequenze di DNA provenienti da campioni biologici contenenti un numero esiguo di molecole bersaglio. Vincitore del Premio Nobel per la Chimica nel 1993

57 PCR (reazione a catena della polimerasi): Fornisce rapidamente molte copie di tratti di DNA di interesse. La miscela di reazione [in acqua: DNA da replicare, desossiribonucleotidi trifosfati (che forniscono le basi azotate per la sintesi del DNA, ioni magnesio, primer forward e reverse (inneschi) * e DNA polimerasi (la più utilizzata è la TAQ polimerasi)** ] viene portata a una temperatura tra 94 e 99 C. La doppia elica del DNA viene scissa (rottura ponti a idrogeno tra le basi azotate) ed i due filamenti di cui essa è composta sono liberi (fase di denaturazione). Successivamente la temperatura viene abbassata fino a C circa al fine di permettere il legame dei primer alle regioni loro complementari dei filamenti di DNA denaturati (fase di annealing/appaiamento). Infine la temperatura viene alzata fino a C al fine di massimizzare l azione della TAQ polimerasi che determina un allungamento dei primer legati, utilizzando come stampo il filamento singolo di DNA (fase di prolungamento/allungamento). * Un primer è un (breve) filamento di acido nucleico (di lunghezza compresa tra 18 e 25 paia di basi), che serve come punto di innesco per la replicazione del DNA. E complementare agli estremi 3 dei due filamenti del segmento da riprodurre. Il forward ha una sequenza identica a quella 5-3 del DNA di interesse; il reverse presenta, invece, una sequenza complementare. I primer sono necessari perché molte DNA-polimerasi non possono iniziare la sintesi di un nuovo filamento ex novo, ma possono solo aggiungere nucleotidi ad un filamento preesistente. ** Proviene dal batterio termofilo Thermus aquaticus ed è estremamente termostabile.

58 PCR 95 C 50 C 72 C

59 fase 1: DENATURAZIONE La doppia elica di DNA stampo è aperta al calore 94 C fase 3: ESTENSIONE La DNA polimerasi allunga gli inneschi e produce 2 nuove catene di DNA

60 Resa teorica di una reazione di PCR a partire da una singola copia di DNA Numero di cicli Numero di molecole di amplificati Il processo si ripete n volte; il numero di molecole di DNA copiate raddoppia ad ogni ciclo; al 30 ciclo ogni singola frazione di elica di partenza è stata replicata un miliardo di volte Y= N2 n Y= numero molecole di DNA amplificato N= numero molecole di DNA di partenza n= numero dei cicli di PCR

61 Il DNA amplificato (amplicone) viene fatto correre su gel di agarosio e una volta identificata la banda desiderata viene prelevato dal gel il frammento e purificato utilizzando kit di purificazione standard Corsa elettroforetica Purificazione - GEL + Le sequenze ottenute vengono analizzate, confrontandole con quelle presenti nelle banche dati internazionali di sequenze ( per giungere infine all'identificazione del genere di fungo isolato ACACATGCACTTGACATGTTTCCCGTACTCGCTGAGGACATGTCTGGTGGCCCTCATCTTCTCCTCCTTCAGACCAAGCTTCTGCTCCACCTG GTCCAGAATCGCCGGACCCCCGGGGTGCGCGATCCAGAACAGCGAGTTCCAATCGCTTATACCCAACGGAGAAAACGCCTGCACCAGCGCCT TCTCGATGTTCTTCGAGATCAACCCAGGAACATCCTTCAGGAGATGAAACGTCAGCCCCACCTCCCTCAAGTGTCCATCGATGGCCCCCTCG GAGTCCGGCAGGATCGTCTGAGCGGCCGACACCATCTCGAACAACGGCCGCTCCGTCGCCAAGTCGGGATCCGCACCCACGATGACCGCTGCA GCCCCGTCCCCGAACAAAGCCTGGCCGACGAGGGAATCGAGGTGGGTGTCGTTGGGTCCACGGAAGGTGACCGCGGTGATCTCGGAGCAAAC CACGAGGACACGAGCGCCCTTGTTGTTCTCGGCGAGGTCCTTGGCGAGACGGAGCACCGTGCCTCCGGCGAAACAGCCTTGTTGGTACATCA TGAAGCGTTTGACGGACGGGCGGAGGCCCAGGAGCTTCGTGATCTGGTAATCGGCACCAGGCATGTCA

62 Multiplex PCR Prevede l utilizzo simultaneo di due o più coppie di primer che amplificano due o più tratti di DNA bersaglio

63 Real-time PCR Una volta amplificata la sequenza di DNA di interesse (amplicone) si procede alla sua identificazione, ad esempio con l ibridazione da parte di una sonda alla quale sono legate molecole fluorogeniche (fluorofori). L emissione di un segnale fluorescente avviene in maniera specifica e proporzionale alla quantità di amplicone che si forma. Al termine dei cicli di amplificazione si effettua la cosiddetta ANALISI di DISSOCIAZIONE (o di MELTING) che consiste in un incremento progressivo della temperatura (da 45 a 99 C) con il raggiungimento di un valore (definito temperatura di melting) in cui la sonda si distacca dall amplificato.