COLTURE CELLULARI STABILIZZATE

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1 Dipartimento di Bioscienze, Biotecnologiche e Biofarmaceutica Corso di Laurea triennale in: Biotecnologie Mediche e Farmaceutiche Laboratorio di Fisiologia cellulare con elementi di Biofisica AA COLTURE CELLULARI STABILIZZATE (Gestione ed uso dell area sterile, passaggio e subcoltura di cellule stabilizzate)

2 Una coltura cellulare è costituita da un gruppo omogeneo di cellule eucariotiche provenienti da tessuti animali; le colture sono mantenute in vita per tempi anche molto lunghi, usando condizioni sperimentali appropriate. Ottenere colture cellulari partendo dai tessuti degli organismi superiori è un operazione complessa, dato che tali tessuti sono eterogenei (cioè presentano tipi cellulari diversi tra loro). Generalmente i protocolli di isolamento prevedono una prima fase il cui scopo è quello di separare i diversi tipi cellulari presenti nel tessuto demolendo la matrice extracellulare e le giunzioni intercellulari che le mantengono unite. A tale scopo il tessuto viene incubato con enzimi proteolitici (tripsina e/o collagenasi) dissociando le singole cellule mediante tecniche meccaniche. Alla fase di dissociazione segue la fase di separazione; per separare i vari tipi cellulari da una sospensione cellulare mista si può procedere in vari modi: 1. Separando le cellule in base alle loro dimensioni o al loro peso, centrifugandole a bassa velocità con l ausilio di sostanze (es Percoll, Ficoll o Lymphoprep) che possono anche essere stratificate in gradienti a diversa densità; 2. Sfruttando la diversa attitudine dei diversi tipi cellulari ad aderire su superfici di vetro o di plastica; 3. Marcando le cellule con anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti, e poi separando le cellule marcate da quelle non marcate; 4. Utilizzando terreni di coltura selettivi che favoriscano la crescita solo di alcuni tipi cellulari e/o aggiungendo al terreno di coltura ormoni che favoriscono (o inibiscono) la crescita di determinati tipi cellulari. La sospensione cellulare omogenea così ottenuta è messa in coltura, cioè viene trasferita in contenitori appositi contenenti miscele di sostanze inorganiche ed organiche necessarie al sostentamento delle cellule. Le cellule crescono adese o in sospensione. Le cellule che crescono al supporto su cui sono state seminate (cioè sulla parete della fiasca) crescono formando monostrati (se sono sane, in quanto risentono dell inibizione da contatto) o pluristrati (se sono tumorali e quindi non risentono dell inibizione da contatto). Le cellule non crescono adese alla parete della fiasca, ma sospese nel terreno di coltura senza aderire ad alcun supporto. COLTURA PRIMARIA: coltura preparata a partire dai tessuti di un organismo eucariote. COLTURA SECONDARIA: coltura propagata a partire dalle colture primarie; CLONE: popolazione proveniente da un unica cellula progenitrice. 2

3 MATERIALI E SOSTANZE UTILIZZATE: DMEM (Minimum Essential Medium): è il terreno di coltura; FBS (Siero Fetale Bovino): contiene numerosi fattori di crescita (non contenuti nel terreno di coltura) utili per la crescita delle cellule. PBS (Tampone fosfato salino): un tampone fosfato a ph 7.4 e isotonico (300mOsm/l). Serve per lavare le cellule allontanando residui di terreno di coltura che contiene inibitori della tripsina. TRIPSINA: enzima proteolitico che rompe i legami peptidici delle proteine extracellulari che costituiscono il substrato su cui le cellule sono ancorate (nel nostro caso serve per staccare le cellule dalla plastica della fiasca): la temperatura ottimale per il suo funzionamento è 37 C ma funziona anche a temperatura ambiente. In questo caso occorre lasciar agire per un tempo più lungo. L-GLUTAMINA ed ANTIBIOTICI: la L-glutamina è un amminoacido essenziale. Soluzioni di antibiotici ad ampio spettro (penicillina/streptomicina) vengono aggiunte al terreno di coltura per contrastare l'eventuale proliferazione batterica. FIASCHE: sono i contenitori in cui le cellule proliferano. Internamente sono sterili; possono avere un tappo ventilato, cioè con un filtro che permette gli scambi gassosi e contemporaneamente garantisce la sterilità della coltura. TERRENI DI COLTURA Il terreno di coltura viene scelto in base alle caratteristiche e alle esigenze del tipo cellulare utilizzato. Può essere liquido (pronto all uso) oppure in polvere (in tal caso deve essere ricostituito come indicato dalla casa produttrice). In ogni caso il terreno di coltura deve avere le seguenti caratteristiche: Deve avere determinati valori di ph (7.4) e osmolarità (300mOsm/l); Deve essere non tossico; Deve contenere tutti i composti necessari al metabolismo cellulare, e precisamente: 1. Ioni, per mantenere il bilancio osmotico; 2. Zuccheri, come fonte di energia; 3. Amminoacidi, per la formazione di proteine; 4. Vitamine, cofattori enzimatici. Il terreno di coltura può contenere anche Rosso Fenolo, quale indicatore di ph. Prima dell uso al terreno di coltura vengono aggiunti una miscela di antibiotici (di solito penicillina/streptomicina) e un antimicotico (generalmente anfotericina B). 3

4 Formulation (mg/l) Inorganic Salts Calcium Chloride anhydrous Ferric(III)-Nitrate 9H 2 O 0.10 Potassium Chloride Magnesium Sulphate anhydrous Sodium Chloride Sodium Dihydrogen Phosphate H 2 O Sodium Hydrogen Carbonate Amino Acids L-Arginine HCl L-Cystine L-Glutamine in E and E Glycine L-Histidine HCl H 2 O L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine HCl L-Methionine L-Phenylalanine L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine L-Valine Vitamins D-Calcium-Pantothenate 4.00 Choline Chloride 4.00 Folic Acid 4.00 Myo-Inositol 7.20 Nicotinamide 4.00 Pyridoxal HCl 4.00 Riboflavin 0.40 Thiamine HCl 4.00 Other Components D-Glucose anhydrous HEPES in E and E Phenol Red Sodium Pyruvate

5 IL PROBLEMA DELLA STERILITA : Un problema che ha reso difficili i tentativi pionieristici di mantenimento di colture e complica la vita quotidiana dei biologi cellulari è la sterilità: i terreni di coltura ed il siero sono infatti molto appetibili per batteri, lieviti e funghi che possono facilmente inquinare le colture cellulari. Questo problema viene affrontato a vari livelli: 1. Tutte le manipolazioni delle colture cellulari vengono fatte in cappe a flusso laminare provviste di filtri, che limitano la contaminazione occasionale con microrganismi trasportati dall aria. 2. Tutti i materiali utilizzati per la manipolazione (pipette, piastre da coltura) sono sterili e di norma monouso. 3. Ai terreni di coltura vengono spesso aggiunti antibiotici per limitare la possibilità di inquinamento da parte dei più comuni batteri. CABINA FLUSSO LAMINARE ORIZZONTALE 5

6 CABINA A FLUSSO LAMINARE VERTICALE LE CABINE DI QUESTO TIPO SONO NATE CON L AVVENTO DELLE COLTURE CELLULARI NELL INTENTO DI PROTEGGERE, OLTRE ALL AMBIENTE E ALL OPERATORE, ANCHE IL PRODOTTO, E SFRUTTANO I FILTRI HEPA ED IL PRINCIPIO DEL FLUSSO LAMINARE VERTICALE D ARIA. I FILTRI HEPA (HIGH-EFFICIENCY PARTICULATE AIR), A VOLTE DETTI ERRONEAMENTE FILTRI ASSOLUTI, SONO IN GRADO DI TRATTENERE IL % DI PARTICELLE DI 0.3 μm. ORA SONO ANCHE DISPONIBILI IN COMMERCIO FILTRI PIU EFFICIENTI DETTI ULPA (ULTRA-LOW PARTICULATE AIR), IN GRADO DI TRATTENERE IL % DI PARTICELLE DI 0.12μm. I FILTRI HEPA SONO COSTITUITI DA FOGLI DI FIBRE DI VETRO IDROREPELLENTI AVENTI DIAMETRO MEDIO DI 0.1 μm. 6

7 SISTEMI DI STERILIZZAZIONE : FILTRI: si utilizzano per sterilizzare i terreni, i tamponi o altre sostanza allo stato liquido. Si tratta di membrane di cellulosa o altre sostanze (nylon, nitrocellulosa, polisulfone, policarbonato; la scelta del tipo di filtro dipende dalla sostanza che dobbiamo filtrare) che differiscono per la porosità (di solito usiamo membrane con pori da 0,2 µm che ci permettono di filtrare i possibili contaminanti presenti nella soluzione) e per il diametro (dipende dall uso che ne vogliamo fare, ad esempio se vogliamo applicarlo ad una siringa o ad un apparato di filtrazione). Durante l uso è consigliabile non applicare una pressione troppo alta che provocherebbe una rottura del filtro. MEZZI CHIMICI: si usano sostanze dal conosciuto potere germicida, diluite alle concentrazioni opportune. Le sostanze più usate sono l ipoclorito di sodio (concentrazione [c] d uso 2%), lo Zefirol ([c] d uso dall 1% al 5%) e l etanolo ([c] d uso 70%). Si utilizzano per la pulizia degli strumenti, della cappa, dell incubatore, delle mani dell operatore e di tutto ciò che non può essere sterilizzato con altri mezzi. MEZZI FISICI: sono due, le radiazioni ed il calore. L uso dei raggi ultravioletti (non ionizzanti) è possibile grazie all esistenza di particolari lampade (lampade UV) che vengono accese nella cappa sterile e/o nell ambiente in cui è posta la cappa. Tali lampade vanno tenute accese minimo due ore, preferibilmente tutta la notte. I Raggi gamma (ionizzanti) hanno un elevato potere penetrante e vengono utilizzate per sterilizzare materiale monouso per colture cellulari (pipette, fiasche, Petri ) vendute in confezioni monouso che ne preservano la sterilita. La sterilizzazione con il calore è utilizzata per la vetreria e per strumenti di metallo e plastica; si distingue sterilizzazione a secco (in stufe che raggiungono dai 180 C ai 300 C) per la strumentazione in vetro che non ha pezzi di plastica (che non resisterebbero a tali temperature) e sterilizzazione in autoclave (che sterilizza con vapore acqueo a 120 C) dove si possono mettere a sterilizzare strumenti di plastica o bottiglie (compreso il tappo). Con questo metodo e possibile sterilizzare tamponi salini (PBS) che non contengono proteine, ormoni o vitamine che sono termolabili. 7

8 INCUBATORE: L incubatore a CO2 è un attrezzatura di precisione per il mantenimento delle cellule in coltura; è costituito da una camera chiusa (il cui volume va da 0,04 a 1 m 3 ) al cui interno sono ricreate, nei limiti del possibile, le condizioni fisiologiche dei tessuti animali in cui le cellule vivevano prima dell isolamento. I parametri che vanno tenuti sotto controllo sono: TEMPERATURA: il controllo della temperatura (che deve essere mantenuta costante a 37 C) viene assicurato da un termostato che agisce su una resistenza; un sistema di ventole per la circolazione forzata dell aria garantisce che la temperatura sia uniforme in tutti i punti della camera. CONCENTRAZIONE DI CO 2 : il livello di anidride carbonica può variare dallo 0,03% al 40%; per esperimenti in normossia, l aria atmosferica è miscelata con il 5% di CO 2. ph: deve essere di 7,4; dipende dal riequilibrio tra lo ione bicarbonato contenuto nel terreno di coltura e la CO 2. L equazione di Handerson-Hasselbach definisce il ph: ph = log([HCO 3 - ]/[H 2 CO 2 ]) UMIDITÀ: l ambiente deve essere saturo per evitare evaporazione di acqua dal terreno di coltura; allo scopo nell incubatore è presente un vassoio di umidificazione contenente acqua. 8

9 PRIMA PARTE: INTRODUZIONE ALLE COLTURE CELLULARI 1. Predisporre puntali e pipette pasteur in vetro da autoclavare Avvolgere con alluminio i contenitori precedentemente riempiti di puntali o pipette pasteur, e applicare il nastro indicatore per la sterilizzazione. 2. Preparare Phosphate buffered saline 1X(PBS): PBS 1X ph 7.4: 1,37M NaCl 1,37M KCl 81 mm Na 2 HPO 4 7H 2 O 19 mm KH 2 PO 4 Preparare 500 ml di PBS 1X a partire da PBS 10X. Misurare in un cilindro 50 ml di PBS 10X e aggiungere H 2 O distillata fino ad un volume finale di 500 ml. Trasferire il tampone così preparato in una bottiglia di vetro Pirex. 3. Autoclavare puntali, pipette pasteur e PBS Allestire l autoclave seguendo le istruzioni del manuale d uso ed avviare il ciclo di sterilizzazione (121 ºC per 15 minuti). 4. Preparare mezzo di coltura per cellule MDCK (Madin-Darby Canine Kidney Cells): Aggiungere: 5% vol/vol FBS (12,5ml), Penicillina/Streptomicina 10mg/ml (2,5 ml) 5. Sotto cappa, collegare il sistema di filtraggio alla pompa da vuoto. Versare il terreno di coltura nella camera superiore e filtrare la soluzione accendendo la pompa da vuoto. Sistema di filtraggio SteriCup 9

10 SECONDA PARTE: PROPAGAZIONE DI UNA COLTURA CELLULARE Osservare al microscopio a contrasto di fase una fiasca con superficie di crescita di 25cm 2 (T25) contenente un monostrato confluente di cellule MDCK: 1. Aspirare il terreno di coltura; 2. Lavare il monostrato cellulare aggiungendo 3ml di PBS; 3. Aspirare il PBS; 4. Aggiungere 1 ml di tripsina; 5. Lasciar agire la tripsina per circa 5 min a 37 C; 6. Trascorsi i 5 minuti, verificare che le cellule si siano staccate; 7. aggiungere 5 ml di terreno completo e risospendere piu volte con la pipetta per disaggregare completamente gli eventuali cumuli di cellule; 8. Calcolare il numero di cellule/ml presenti nella sospensione cellulare ottenuta utilizzando l emocitometro; 9. Calcolare il volume di sospensione cellulare corrispondente a 5x10 5 cellule. 10. Trasferire il volume appena ottenuto in una fiasca T25, contenente 5 ml di Mezzo completo. N.B.: Per aspirare le soluzioni utilizzare la pipetta pasteur collegata alla pompa da vuoto. Per aggiungere le soluzioni utilizzare la pipetta monouso collegata al pipettatore automatico 10

11 Suggerimenti per effettuare la conta cellulare usando l Emocitometro di Burker Ø Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro (sterile), prelevare una piccola quantità di sospensione cellulare dalla fiaschetta Ø Avvicinare il capillare all intercapedine tra portaoggetto e coprioggetto dell emocitometro Ø Parte della sospensione entrerà per capillarità nella camera di conta Ø Posizionare la camera di conta sul piatto del microscopio e, a basso ingrandimento (16-20X), mettere a fuoco le linee incise sul vetrino Ø Identificare i quadranti limitati su tutti i lati da 3 linee incise sul vetro e posizionarne uno al centro del campo di osservazione come mostrato nella immagine che segue. 11

12 Ø Contare tutte le cellule nel quadrato (pallini neri) usando le linee singole come guida. Le eventuali cellule che si trovano sui lati del quadrato (tre linee) vengono contate solo su due dei quattro lati scelti arbitrariamente. Quelle sugli altri due lati (pallini vuoti) vanno ignorate nella conta. Ø Spostarsi in un altro quadrato, procedendo in diagonale, ed effettuare una nuova conta. Ripetere la conta su più quadrati diversi e poi calcolare la media aritmetica dei risultati delle conte (N). Determinazione della concentrazione cellulare: Ciascun quadrato dell'emocitometro con il coprioggetto in posizione delimita uno spazio con un volume di 0.1 mm 3 ossia di 10-4 cm 3. Posto che 1 cm 3 equivale ad 1 ml, la concentrazione di cellule per ml sara' determinata dal seguente calcolo: Cellule/ml = N x fattore di diluizione x 10 4 Posto: 1. un numero di cellule medio N=50 2. fattore di diluizione=1 se non abbiamo diluito la sospensione cellulare prima di caricarla nella camera di conta Cellule/ml= 50x1x10 4 = cellule /ml 12