METODI DI RIFERIMENTO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

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1 METDI DI RIFERIMENT ED INTERPRETAZINE DEI RISULTATI AMEDE PIETRI Istituto di Scienze degli Alimenti e della Nutrizione - Facoltà di Agraria U.C.S.C.

2 AFLATSSINE B1 CH 3 B2 CH 3 G1 CH 3 G2 CH 3

3 NUCLE CUMARINIC B 1 AFLATSSINE ANELL CICLPENTENIC CH 3 H M 1 GRUPP BIFURANIC (4-idrossi-derivato) Doppio Legame (DNA binding) CH 3

4 METABLITI AFLATSSINE NEL LATTE H AFLATSSINA M 1 CH 3 AFLATSSINA M 2 H CH 3

5 AFLATSSINE Solubilità assai poco solubili in acqua (10-30 µg/ml) insolubili in solventi non polari molto solubili nei solventi organici mediamente polari (CHCl 3 e CH 3 H) Stabilità instabili sotto luce UV in presenza di 2 ph estremi (ph<3 o ph>10) in presenza di ossidanti p.f.: C (AFB 1 ) Reattività l anello del lattone è sensibile a idrolisi alcalina le AF sono sensibili a NH 3 e NaCl Assorbimento UV AFB 1 (in CHCl 3 ) λ max ε

6 METDI PER L ANALISI DELLE MICTSSINE Chimico-fisici metodi rapidi (fluorescenza verdegialla, minicolonna) metodi strumentali diretti (fluorimetria, spettrofotometria, MS) metodi cromatografici (TLC, HPLC, HPLC-MS, GLC, GLC-MS)

7 Fluorescenza

8 METDI PER L ANALISI DELLE MICTSSINE Biologici saggi biologici prove su animali prove su microrganismi colture di cellule e di tessuti metodi immunologici radioimmunologici (RIA), immunoenzim. (ELISA, STRIPS), col. di immunoaffinità (IAC)

9 RIVELAZINE/QUANTIFICAZINE DELLE AFLATSSINE Di quale tipo di risultati hai bisogno? Immediati (5-20 min) Rapidi ( min) Non-urgenti (entro 24 ore o alcuni giorni)

10 P U R I F I C A Z I N E CLNNE IMMUNAFFINITÀ Principio di azione Anticorpo Micotossina Altri composti / Matrice

11 P U R I F I C A Z I N E + Vantaggi CLNNE DI IMMUNAFFINITÀ Elevata specificità Facile utilizzo Buoni recuperi Buona riproducibilità Possibilità di applicazione con metodi di determinazione non sofisticati - Svantaggi Costo?? RIGENERAZINE?? Data di scadenza

12 D E T E R M I N A Z I N E CRMATGRAFIA LIQUIDA CN RIVELAZINE FLURIMETRICA MLECLE FLURESCENTI cratossina Zearalenone Aflatossina M1 MLECLE DERIVATIZZABILI Aflatossine Fumonisine (PA, reazione di Roth)

13 D E T E R M I N A Z I N E CRMATGRAFIA LIQUIDA CN RIVELAZINE FLURIMETRICA + Vantaggi Specificità Sensibilità Precisione - Svantaggi Tempo richiesto per la derivatizzazione

14 METDI BASATI SU CLNNE DI IMMUN-AFFINITA + HPLC + Vantaggi Stato dell arte Specificità/Accuratezza/Precisione Adatti per numeri medi di campioni Pochi punti critici - Svantaggi E necessario personale qualificato Costo considerevole della strumentazione

15 D E T E R M I N A Z I N E DERIVATIZZAZINE Pre-colonna Post-colonna H H AFLATSSINE CH3 - Iodio - Elettrochimico - PBPB Pyridinium Bromide PerBromide (C 5 H 5 N + HBr 3- ) - Fotochimico Br 2 Br H Br H CH 3

16 + I I 2 CH 3 I CH 3 AFB 1 H CH 3 + CF 3 CH H CH 3 AFB 1 AFB 2a

17 Photochemical derivatization of aflatoxin B 1 to B 2a

18 Standard aflatossine per latte

19 Campione di latte non derivatizzato

20 Campione di latte derivatizzato

21 REGLAMENT CE N. 401/2006 B.6. Accettazione di una partita o sottopartita Accettazione, se il campione di laboratorio non supera il limite massimo, tenendo conto dell incertezza della misura e della correzione per il recupero. Rifiuto, se il campione di laboratorio supera il limite massimo oltre ogni ragionevole dubbio, tenendo conto dell incertezza della misura e della correzione per il recupero.

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23 REGLAMENT CE N. 401/2006 Se a livello comunitario non è previsto alcun metodo specifico i laboratori sono liberi di applicare un metodo di loro scelta, a condizione che esso rispetti i criteri seguenti

24 METDI UFFICIALI PER L ANALISI DI AFLATSSINE IN VARIE MATRICI MEDIANTE IAC E LC/FD Aflatossina Matrice Concentraz (µg/kg) Metodo Ufficiale B1, B2, G1, G2 Mais, arachidi, burro arachidi 10 AAC ; EN B1, B2, G1, G2 Burro arachidi, pistacchi, pasta di fichi, peperoncino 1 AAC ; EN B1 Mangimi > 1 AAC M1 Latte liquido 0.02 AAC

25 REGLAMENT CE N. 401/2006 Note relative ai criteri di rendimento per le micotossine I valori di precisione sono calcolati dall equazione di Horwitz RSD R = 2 (1-0.5logC) RSD R è la dev. std relativa C è il tasso di concentrazione (0.001 = 1000 mg/kg)

26 CME ESPRIMERE UN RISULTAT DI ANALISI Un risultato va espresso nella forma: Dove: a±2u oppure a±u a = è la miglior stima del valore vero (risultato dell analisi corretto per il recupero) u = è l incertezza standard U = è l incertezza espansa, calcolata con un fattore di copertura 2, corrispondente ad un livello di fiducia del 95.45%

27 ESEMPI, UTILIZZAND L EQUAZ. DI HRWITZ Analisi aflatossine (µg/kg) Risultato±incertezza Intervallo 0,050±0,071 0,021-0,120 2,0±1,6 0,4 3,6 5,0±3,5 1,4 8,6 20,0±11,5 8,5 31,5

28 INCERTEZZA DI MISURA E rappresentata da una deviazione standard o da una grandezza ad essa riconducibile La sua utilità è strettamente legata alle regole utilizzate per la sua stima che deve essere il più possibile standardizzata attraverso modelli

29 INCERTEZZA DI MISURA Uncertainty of measurement does not imply doubt on the validity of a measurement: on the contrary, knowledge of the uncertainty implies increased confidence in the validity of a measurement result (EURACHEM/CITAC Guide, Quantifying Uncertainty in Analytical measurement, Second Edition, April 2000) L importanza dell incertezza di misura è stata pienamente recepita dalla norma UNI CEI EN IS/IEC 17025, che impone ad un laboratorio di prova l adozione e l applicazione di procedure per stimare l incertezza di misura (par ).

30 INCERTEZZA DI MISURA Uncertainty of measurement does not imply doubt on the validity of a measurement: on the contrary, knowledge of the uncertainty implies increased confidence in the validity of a measurement result (EURACHEM/CITAC Guide, Quantifying Uncertainty in Analytical measurement, Second Edition, April 2000) L importanza dell incertezza di misura è stata pienamente recepita dalla norma UNI CEI EN IS/IEC 17025, che impone ad un laboratorio di prova l adozione e l applicazione di procedure per stimare l incertezza di misura (par ).

31 STIMA DELL INCERTEZZA DI MISURA Caso A Norme e metodi ufficiali che contengono dati di validazione Se il laboratorio verifica di rispondere ai requisiti di ripetibilità, può stimare l incertezza mediante la deviaz. Standard di riproducibilità (s R ): U(y) = k s R incertezza estesa Con K fattore di copertura (= 2 nelle misurazioni chimiche) Caso B Norme e metodi che non contengono dati di precisione Metodi interni Approccio GUM (Guide to Expression of Uncertainty in Measurement, UNI CEI ENV 13005:2000)

32 ACCETTAZINE RIFIUT DI UNA PARTITA IN BASE AL RISULTAT DELL ANALISI, TENEND CNT DELL INCERTEZZA DELLA MISURA

33 GRAZIE PER L ATTENZINE AMEDE PIETRI