Nuove strategie di prevenzione e terapia del danno renale acuto

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1 Nuove strategie di prevenzione e terapia del danno renale acuto Luigi Biancone SCU Nefrologia Dialisi Trapianto, ASO San Giovanni Battista di Torino Dir. G.P. Segoloni

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4 MSC and kidney Krause D et al, J Clin Invest, 2005 Paracrine effects of EPCs -Growth factors (VEGF, etc.) -Microvesicles (MVs).

5 Phases of AKI Ischemia/Sepsis Chem otaxis Tether Trigger Strong adhesion Transendothelial migration GFR (%) 0 - Initiation Cell Injury CMJ Hypoxia Microvascular injury with obstruction, coagulopathy & inflammation Extension BBM loss Exfoliation Tubular Obstruction Dedifferentiation Migration Proliferation Maintenance Redifferentiation Repolariztion Recovery Repair Days Vessel lum en Endothelial cells Basement membrane Injured tissue platelets selectins ts chem ota ctan CYTOKINES RANTES MCP-1... Injured tubule Leukocyte integrins chemokines Signal adhesion molecules (ICAM-1) IL-6 inos RBC CHEMOKINES TNF-α TGF-β Inflammatory cell NO O - 2 OH - OCl - ONOO - Tubular cell injury Vasoconstriction T-cell Plugging Monocyte

6 RUOLO DELLE STAMINALI DI ORIGINE MIDOLLARE NEL RIPARARE IL DANNO RENALE ACUTO Staminali di origine midollare sono state identificate durante la rigenerazione tubulare -Poulsom et al J Pathol Fang et al JASN Gupta et al Kidney Int Lin et al J Am Soc Nephrol La capacità delle Staminali di origine midollare di transdifferenziare è stata messa in discussione -Duffield et al. J Clin Invest Togel et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005

7 L INFUSIONE DI MSC CONTRIBUISCE ALLA RIPARAZIONE DEL DANNO TUBULARE Dopo danno tubulare indotto da cisplatino e gicerolo, le MSC colonizzano il tessuto renale leso ma solo poche si differenziano in cellule epiteliali tubulari. -Morigi et al. J Am Soc Nephrol Herrera et al. In J Mol Med 2004 MSC proteggono dal danno renale acuto da ischemia con meccanismi indipendenti dalla differenziazione. -Lange et al. Kidney Int Tögel et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005

8 Coinvolgimento delle MSC nella riparazione del danno tubulare

9 Kidney International Supplements (2011) 1, 90 93; Potential of mesenchymal stem cells in the repair of tubular injury Barbara Imberti, Marina Morigi and Ariela Benigni

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11 Westenfelder C, Togel FE. Protective actions of administered mesenchymal stem cells in acute kidney injury: relevance to clinical trials. Kidney inter., Suppl. 2011; 1:

12 PHASE I CLINICAL TRIAL: PREVENTION AND TREATMENT OF AKI WITH ALLOGENEIC MSCS Westenfelder C, Togel FE. Kidney inter., Suppl. 2011; 1: In this safety and feasibility trial, adult subjects who have undergone coronary artery bypass graft and/or cardiac valve surgery were infused via the suprarenal aorta with allogeneic MSCs. All studied subjects presented with the following risk factors for post-cardiac surgeryassociated AKI: underlying chronic kidney disease, congestive heart failure, diabetes mellitus, hypertension, chronic obstructive pulmonary disease, and age >65 years. Preliminary analysis of the outcomes in this cohort of study subjects showed that: the suprarenal, postoperative administration of allogeneic MSCs is feasible and safe, as it has not resulted in adverse or serious adverse events preliminary efficacy data appear promising, showing, that MSC therapy prevented postoperative deterioration in renal function (~20% AKI incidence in case controls), reduced length of stay (by ~40%), need for readmission (by ~40%), and prevented late deterioration in renal function

13 Kunter U, Rong S, Moeller MJ et al. Mesenchymal stem cells as a therapeutic approach to glomerular diseases: benefits and risks. Kidney inter., Suppl. 2011; 1:

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17 MDPs self-assemble into nanofibrous hydrogels. Wang Y et al. JASN 2011;22: by American Society of Nephrology

18 Preconditioned nanofibers reverse endothelial cell hyperpermeability. Wang Y et al. JASN 2011;22: by American Society of Nephrology

19 Secreted protein expression profiling of preconditioned nanofibers. Wang Y et al. JASN 2011;22: by American Society of Nephrology

20 Preconditioned nanofibers are renoprotective in experimental models of AKI. (A) Renal histology was assessed by H&E staining 24 hours after LPS administration. Wang Y et al. JASN 2011;22: by American Society of Nephrology

21 Quali segnali sono coinvolti nell interazione tra cellule staminali e tessuto con danno? La comunicazione tra cellule danneggiate sopravvissute al danno e cellule staminali residenti o reclutate dal midollo osseo deve essere essenziale. le microvescicole (MV) rappresentano un meccanismo di comunicazione tra cellule coinvolto nel trasferimento di informazione genetica dalle cellule staminali alle cellule mature. Deregibus MC et al. Blood. 2007;110:

22 MECCANISMI DI PRODUZIONE DI MV Gli esosomi originano dal compartimento endosomiale e hanno dimensioni di nm. Camussi et al Kidney Int 78:838, 2010 Sono liberati per esocitosi con meccanismo dipendente dall attivazione del citoscheletro.

23 MECCANISMI DI PRODUZIONE DI MV Le Shedding vesicles hanno dimensioni di 100nm - 1mm. Sono prodotte con meccanismo dipendente dall influsso di calcio, l attivazione della calpaina e la riorganizzazione del citoscheletro. Camussi et al Kidney Int 78:838, 2010 Ca++ modifica la simmetria dei fosfolipidi di membrana con attivazione di specifici enzimi (flippase, floppase e scramblase)

24 ATTIVITA BIOLOGICHE DELLE MV Trasferimento di informazione genetica MVs derivate da cellule staminali embrionali murine riprogrammano le cellule staminali/progenitori emopoietici. - Ratajczak J et al. Leukemia 2006; 20: MVs derivate da progenitori endoteliali umani attivano un programma angiogenetico nell endotelio per trasferimento orizzontale di mrna. - Deregibus MC et al. Blood. 2007;110:

25 Genetic information shuttled by Stem cell derived MVs Embryonic Stem Cells mouse mrna: Ratajczak J et al. Leukemia 2006 mouse microrna: Yuan Aet al. PLoS One 2009 Adult Stem Cells human EPC derived MV mrna: Deregibus et al. Blood GEO database: GSE 7019 human EPC derived MV microrna: Cantaluppi et al 2010 human MSC derived MV mrna: Bruno et al JASN 2009 GEO database: GSE human MSC derived MV microrna: Collino et al PloS One 2010 human Liver SC derived MV mrna: Herrera et al J Cell Mol Med GEO database: GSE 15569

26 Ruolo potenziale delle MV derivate da cellule danneggiate nella riparazione tessutale Trasferimento MV-mediato di mrna polmonare specifico alle cellule staminali (Dooner et al 2008; Aliotta et al 2010).

27 Role of MVs derived from injured tissue in inducing change in the phenotype of bone marrow stem cells MV-mediated transfer of lung specific mrna to bone marrow (BM) stem cells In co-culture experiments of bone marrow cells separated from injured lung cells, the bone marrow cells express genes for lung-specific proteins such as Clara cell-specific protein, surfactant B, and surfactant C. (Dooner et al 2008; Aliotta et al 2010). mrna, mirna and protein transfer BM cells Lung injured cells MVs BM cells acquire Lung phenotype -Aliotta JM et al. Exp Hematology 2010

28 Ruolo potenziale delle MV derivate da cellule staminali nella riparazione del danno tissutale

29 Caratterizzazione delle MV derivate da MSC Le MV trasferiscono patterns selezionati di mrna e microrna (GEO d.b. accession GSE12243) Sono stati individuati 239 mrna, 132 dei quali associati a Entrez Gene identifiers con l analisi IPA 6.0, compresi: -mrna caratteristici delle linee cellulari mesenchimali, quali quelli nervosi, osteogenici, epiteliali ed emopoietici; -mrna coinvolti nel controllo della trascrizione, proliferazione cellulare e della regolazione immune.

30 EVIDENZE DI TRASFERIMENTO DI INFORMAZIONI GENETICHE DA PARTE DI MV Dimostrezione del trasferimento di mrna: Esperimenti dimostrano il trasferimento di geni reporter in cellule target sia in vitro sia in vivo. Bruno et al. J Am Soc Nephrol 20:1053, 2009 Herrera et al. J Cell Mol Med 14:1605, 2010 Esperimenti dimostrano la traslazione in proteine di un RNA reporter quale il green fluorescence protein mrna (GFP). Deregibus et al. Blood 110: 2440, 2007 Aliotta et al. Exp Hematol. 38:233, 2010

31 Caratterizzazione dei mirnas small not coding region (20-24 ases) that function as importnant players in gene regulation Collino et al. PloSOne 2010, 5 (7):e11803

32 Caratterizzazione dei mirnas Collino et al. PloSOne 2010, 5 (7):e11803

33 EVIDENCE FOR MV MEDIATED MEDIATED TRANSFER OF GENETIC INFORMATION MV mediated transfer of specific mirnas to target cells Collino et al. PloSOne 2010, 5 (7):e11803

34 Effetti proliferativi e anti-apoptotici delle MV derivate da MSC sulle cellule tubulari renali Proliferative effect Anti-apoptotic effect -Bruno et al. J Am Soc Nephrol 20:1053, 2009

35 MV derivate da MSC proteggono dal danno tubulare acuto Murine model of Acute Kidney Injury (AKI) * *: 75,000 MSC or 15 μg of MV -Bruno et al. J Am Soc Nephrol 20:1053, 2009

36 MV derivate da MSC proteggono dal danno tubulare acuto MSC or MV injection Functional Recovery MSC or MV injection -Bruno et al. J Am Soc Nephrol 20:1053, 2009

37 MV derivate da MSC si localizzano nel tessuto renale danneggiato -Bruno et al. J Am Soc Nephrol 20:1053, 2009

38 MV derivate da MSC proteggono dal danno tubulare acuto AKI AKI+MV AKI+RNaseMV AKI+MSC -Bruno et al JASN 2009

39 MV derivate da MSC proteggono dal danno tubulare acuto -Bruno et al. J Am Soc Nephrol 20:1053, 2009

40 Trasferimento orizzontale di mrna ed espressione di proteine umane nelle cellule tubulari epiteliali trattate con MV derivate da MSC -Bruno et al. J Am Soc Nephrol 20:1053, 2009

41 CONCLUSIONI -La terapia cellulare con MSC è una prospettiva di prevenzione e trattamento dell AKI allo stadio attuale di sperimentazione clinica. -Alternative sperimentali come le MV o i nanopolimeri condizionati possono superare alcune problematiche delle terapie cellulari mantenendo i vantaggi terapeutici delle staminali

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43 Giovanni Camussi Laboratory of Renal and Vascular Pathophysiology Università di Torino Luigi Biancone Benedetta Bussolati Stefania Bruno Vincenzo Cantaluppi Federica Collino M. Chiara Deregibus Andrea Ranghino