Screening prenatale della sindrome di Down: le varianti biochimiche, il loro uso ottimale ed il ruolo del laboratorio analisi
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1 Screening prenatale della sindrome di Down: le varianti biochimiche, il loro uso ottimale ed il ruolo del laboratorio analisi Marta Paggini UO Laboratorio Analisi Chimico Cliniche, ASL 8, Arezzo RIASSUNTO Il test di Screening prenatale per la sindrome di Down è uno strumento utilissimo per le donne in gravidanza nel percorso decisionale verso la Diagnosi Prenatale Invasiva. Il test utilizza l analisi multivariata ed esiste in varie formulazioni: il Triplo test, il più vecchio, che si esegue al 2 trimestre di gestazione, il Test Combinato, il più recente, che si esegue alla fine del 1 trimestre ed il Test Integrato, che è la somma dei due ed è quello con le migliori prestazioni perché utilizza un maggior numero di parametri. L offerta del Test Combinato è la prevalente e le misure del secondo trimestre sono state progressivamente abbandonate nella maggior parte dei centri. L esperienza pratica dimostra che una quota consistente di gestanti rimane esclusa dal test o perché si presenta al secondo trimestre o perché non riesce a prenotare il test in tempi utili. Per queste gestanti sarebbe utile avere a disposizione il Triplo test o il Test Integrato Biochimico, come raccomandato nelle Linee Guida del Ministero della Salute. L esperienza della ASL di Arezzo dimostra che il Triplo test e il Test Integrato Biochimico, gestiti prevalentemente dal Laboratorio Analisi, permettono di completare l offerta del test di screening prenatale per la sindrome di Down, arrivando all intera popolazione delle gestanti e con ottimi risultati. Parole Chiave: Triplo test; Test Combinato; Traslucenza Nucale; Test Integrato ABSTRACT Prenatal screening for Down s Syndrome: the biochemical tests, their best use and the role of the laboratory. The prenatal screening for Down s Syndrome is a useful tool offered to pregnant women to help them to decide whether or not to have Invasive Prenatal Diagnosis. It exists in various combinations: the Triple test, the oldest one, carried out in the 2nd trimester of pregnancy, the Combined Test, more recent, carried out at the end of the 1st trimester and the Integrated Test, which is the combination of the two and the most reliable. The Triple test uses only biochemical parameters in maternal blood (AFP, ue3 and hcg), while the Combined Test uses both biochemical (PAPP-A and free β hcg) and an ultrasound marker (the Nuchal Translucency), combined together in the same calculation. The Integrated test can use all the markers or only the biochemical markers in its biochemical version. Unfortunately, the second trimester test (Triple test) has been neglected and abandoned in most of the centers and pregnant women who can t (for various reasons) have the Combined Test are left with no screening at all. The Arezzo Hospital experience shows that keeping the whole array of the tests, both at the first and at the second trimester, allows all pregnant women to have one test with good performances. In two years, 1247 pregnant women had the Biochemical tests: 612 Triple tests and 635 Integrated Biochemical Tests. The positives were 65, 5.2%, among which there were 4 Down s Syndrome. There were no false negatives and therefore a 100% Detection Rate. As a matter of fact, a screening test can t be so called if it is not available to all the eligible subjects. Key-words: Triple test; Combined Test; Integrated Test; Nuchal Translucency INTRODUZIONE Il test di Screening Prenatale per la sindrome di Down è stato introdotto in Gran Bretagna alla fine degli anni ottanta dal gruppo del Prof. N.Wald e si basa sull utilizzo di alcuni parametri (biochimici ed ecografici) per calcolare un rischio individuale, a partire da un rischio a priori legato all età. I parametri utilizzati hanno il requisito di essere significativamente diversi fra le gravidanze sane e le gravidanze affette; non essendo però i valori delle due distribuzioni nettamente separati, è permesso solo un calcolo di probabilità, mediante l analisi multivariata. Il primo test messo a punto è stato il Triplo test 1, che utilizza le misure di AFP, ue3 e hcg totale nel sangue materno, tra la 15 a e la 20 a settimana di gravidanza; successivamente è stato introdotto il Test Combinato, da eseguire tra la 10 a e la 13 a settimana e che utilizza la misura della free β hcg, della PAPP-A nel sangue materno e la misura ecografica della Traslucenza Nucale 2 ; infine è stato proposto, sempre da Wald, il Test Integrato, che unisce tutti questi parametri in un unico calcolo di rischio 3. Il Test Integrato può anche essere solo Biochimico, se manca la misura della Traslucenza Nucale, ma sono eseguiti entrambi i prelievi ematici. Al momento in Italia il Test di Screening prenatale per la sindrome di Down è regolato da una legge nazionale, il DM 245/98 e da Leggi Regionali, laddove sono state elaborate. In Toscana è ancora in vigore la Delibera 569/2001, nella quale vengono dettagliati i requisiti per l accesso alla Diagnosi Prenatale gratuita, fra i quali sono elencati il Triplo test a rischio superiore al cut off e l età materna superiore a 35 anni al parto. Nel 2007 sono state pubblicate altre delibere regionali che hanno introdotto il Test Combinato, rimandando però il riassetto definitivo del percorso di Diagnosi Prenatale a provvedimenti futuri, ancora da emanare. Nel 2010, sono state pubblicate le Linee Guida sulla Gravidanza Fisiologica del Ministero della Salute e a pag 396 LigandAssay 17 (4) 2012
2 Figura 1 Linee guida del Ministero della Salute sulla gravidanza fisiologica. Figura 2 Raccomandazioni sulla Diagnosi Prenatale della Sindrome di Down, tratte dalle Linee Guida. 121 è affrontata in maniera esaustiva la problematica di questo strumento, utilissimo nel percorso decisionale della gestante sulla eventuale Diagnosi Prenatale Invasiva (Fig. 1). In particolare, le Linee Guida, oltre ad abbandonare l età come criterio di screening, raccomandano che sia un test al primo trimestre, che un test al secondo trimestre, siano a disposizione, per coprire la totalità delle aventi diritto (Fig. 2). Nella pratica, sul territorio nazionale prevale l offerta del Test Combinato, con l abbandono delle misure del secondo trimestre e quindi del Triplo test. Di conseguenza, capita che gestanti che si presentano in ritardo per l esecuzione del Test Combinato o che non riescono a prenotare in tempo utile causa l esistenza di una lista d attesa (soprattutto per la parte ecografica), non riescano ad usufruire di un test offerto loro dal Servizio Sanitario Nazionale. Sono quindi costrette a tentare di avere la prestazione in aree limitrofe o in strutture private o a eseguire direttamente la Diagnosi Invasiva senza valutazione del rischio. Questo lavoro mette in evidenza come le due varianti esclusivamente biochimiche del test di Screening Prenatale per la Sindrome di Down, cioè il Triplo test e il Test Integrato Biochimico (o Sierologico), descritti anche dalle Linee Guida del Ministero della Salute, permettano di completare l offerta a tutte le gestanti. Il lavoro per queste due tipologie è prevalentemente a carico del Laboratorio Analisi, che deve eseguire sia le misure del primo che del secondo trimestre e calcolare il rischio utilizzando anche alcuni dati anamnestici e clinici, dotandosi di un programma di calcolo, fra le varie possibilità presenti in commercio 4. I due test biochimici completano l offerta del test di Screening per la Sindrome di Down, rivolgendosi ad una fetta di popolazione destinata altrimenti a rimanere esclusa: il Triplo test è il test per le gestanti che arrivano in ritardo, il Test Integrato Biochimico per quelle che arrivano in tempo per il prelievo del primo trimestre, ma non riescono ad eseguire la misura della Traslucenza Nucale. I due test contribuiscono in questo modo al pieno raggiungimento del significato stesso dell espressione test di Screening. Nella ASL di Arezzo il test di Screening prenatale per la Sindrome di Down è offerto dal 1993, quando la Regione Toscana invitò tutti gli Ospedali dei capoluoghi di Provincia ad organizzarsi, con un coordinamento regionale, per offrire il Triplo test alle gestanti, prevedendo nell immediato futuro un suo recepimento da parte della legislazione nazionale. Le prestazioni del Triplo test sono state tutt altro che scadenti: l esperienza della ASL di Arezzo mostra che nel periodo su circa test eseguiti, sono stati identificati 29 casi di sindrome di Down su 33, con una sensibilità del 88% circa e con una concomitante quota di falsi positivi corrispondente all atteso, che dipende dall età della popolazione. Tra i test ad alto rischio, sono stati diagnosticate anche altre aneuploidie (2 Trisomie 18, una Triploidia ed una sindrome di Turner). Nei calcoli è sempre stata utilizzata la datazione ecografica e le sue implicazioni sono spiegate più avanti. L utilizzo del Triplo test da parte dei ginecologi della provincia e la cura con cui il test è stato eseguito non sono mai diminuiti negli anni e l introduzione nel 2007 del Test Combinato è avvenuta rapidamente, grazie alle rete organizzativa già esistente. Nella nostra provincia il Test Combinato prevede il prelievo per il Duo test presso il Laboratorio Analisi ed il calcolo di rischio, eseguito o dal Laboratorio stesso o dal ginecologo curante, qualora questo sia in possesso di un idoneo programma di calcolo. Tuttavia, difficoltà di vario genere hanno limitato l offerta della misura della Traslucenza Nucale, che nella nostra provincia è stata eseguita solo privatamente fino al Più in dettaglio, i motivi per cui le gestanti non sono riuscite e non riescono tuttora ad accedere a questa prestazione sono: LigandAssay 17 (4)
3 1. Numero molto limitato di ecografisti certificati con la Fetal Medicine Foundation di Londra, gli unici secondo la normativa regionale a poter effettuare la misura della Traslucenza Nucale in ambiente ospedaliero; la procedura di certificazione è tuttavia volontaria. 2. Difficoltà a rivolgersi a centri limitrofi che offrono il Test Combinato, per l esistenza di liste d attesa. 3. Limitate possibilità economiche della gestante per l esecuzione della suddetta misura in ambiente privato. 4. Consistente numero di gestanti che giungono all osservazione del ginecologo nel secondo trimestre, soprattutto le pazienti non italiane che afferiscono ai consultori. 5. Impossibilità oggettiva ad eseguire la misura della Traslucenza Nucale, per esempio per inadeguata posizione fetale. La spiccata eterogeneità che si rileva nella popolazione delle gestanti ed i problemi sopra descritti, hanno trovato soluzione nella flessibilità dell offerta, mutuata dall Ospedale S.Anna di Torino, il centro italiano col maggior numero di test eseguiti 5. Secondo questo modello, accanto al Test Combinato, sono offerte tutte le altre varianti: il Test Integrato Biochimico, per le donne che arrivano in tempo per il prelievo del primo trimestre, ma non eseguono la misura della Traslucenza Nucale per uno dei motivi elencati sopra, il Triplo test, per le donne che si presentano in ritardo o che chiedono esplicitamente il test più economico ed il Test Integrato per le donne che chiedono il test a più alte prestazioni. Nell ultimo gruppo sono particolarmente rappresentate le donne di età superiore a 35 anni e le donne che hanno effettuato un percorso di fecondazione assistita. I due test biochimici sono gestiti dal Laboratorio Analisi, che è dotato di programma di calcolo di rischio (Alpha LMS, Logical Medical Systems, Londra, GB) ed è delle loro prestazioni che questo lavoro si vuole occupare. Secondo i dati pubblicati negli studi SURUSS 6 e riportati anche nelle Linee Guida del Ministero della Salute, le prestazioni dei vari test sono elencate nella tabella 1, calcolate riferendosi ad un cut- off fisso e ad una popolazione standardizzata. E da tener presente che mentre per il Test Combinato si usa esclusivamente la datazione ecografica, il Triplo test può utilizzare sia la datazione derivata dalla data di ultima mestruazione (UM), che quella ecografica; la prima modalità è particolarmente rappresentata nei dati di quei paesi (come gli USA), dove un certo numero di donne esegue il test senza avere ancora fatto valutazioni ecografiche. Questa modalità di lavoro nella nostra esperienza non è mai stata utilizzata, se non in casi eccezionali, prima di tutto perché tutte le gestanti in Italia possono usufruire di una ecografia nel primo trimestre di gravidanza, offerta gratuitamente dal Servizio Sanitario Nazionale; in secondo luogo, perchè l utilizzo della datazione dalla UM comporta una approssimazione nei calcoli, dovuta alle maggiore dispersione nella costruzione delle mediane di riferimento, che si traduce in uno scadimento considerevole delle prestazioni del test, riportato anche in letteratura 7. Nel nostro Laboratorio, inoltre, dal settembre 2009, la misura della hcg totale nel 2 trimestre è stata sostituita con la misura della free β hcg. I vantaggi sono stati di due tipi: la semplificazione della parte analitica, perché le serie analitiche da 5 sono diventate 4 e l aumento delle prestazioni, che l uso della free β hcg comporta rispetto a quello della hcg totale, che compensa l aumento del costo dovuto al prezzo dei reagenti. Secondo gli studi SURUSS, infatti, questa sostituzione comporta un significativo miglioramento delle prestazioni nel Triplo test, sia come sensibilità che come specificità 6. MATERIALI E METODI In questo lavoro sono stati considerati i test di Screening per la sindrome di Down esclusivamente biochimici eseguiti in due anni presso il Laboratorio Analisi dell Ospedale S.Donato di Arezzo, nel periodo compreso tra il 1/7/2010 e il 30/6/2012. In questo periodo sono giunte al Laboratorio per lo Screening Prenatale un totale di 3094 gestanti, prevalentemente aretine, ma con una minoranza di donne immigrate di varia provenienza (i gruppi più rappresentati sono le nazionalità rumena e bengalese) e di donne provenienti dalle aree geografiche limitrofe (Firenze, Siena, Perugia). L età delle donne di questo campione è compresa tra Tabella 1 Prestazioni delle diverse strategie con cut-off a 1:350 nella popolazione dello studio SURUSS (da Rif. 8) Tipo di test di screening Sensibilità Test positivi OAPR Età (>35 anni) 45% 16% 1:60 Test Combinato 83% 4,7% 1:27 Triplotest 81% 6,9% 1:38 Quadtest 84% 5,7% 1:30 Test Integrato Biochimico 85% 5,0% 1:26 Test Integrato 90% 3,0% 1:1492 Figura 3 Distribuzione dell età al parto nel periodo considerato. 398 LigandAssay 17 (4) 2012
4 15 e 49 anni, con un valore mediano di 32 anni e 858 donne (il 28%) di età superiore a 35 anni al parto, aventi già diritto alla Diagnosi Prenatale Invasiva. La distribuzione dell età delle gestanti età è riportata nella figura 3. Sui 3094 Screening richiesti, solo 1847 donne (il 60%) ha prodotto una misura di Traslucenza Nucale; 548 di queste (il 30%) hanno eseguito il Test Combinato, 1299 (il 70%) il Test Integrato. Pertanto sono state escluse da questa analisi. Le restanti 1247 donne, cioè il 40% della popolazione afferente allo Screening, non è riuscita ad eseguire il prelievo del primo trimestre e/o la misura della Traslucenza Nucale per uno dei motivi descritti sopra e pertanto ha eseguito le sole misure biochimiche: , la metà circa, con età mediana 29 anni, hanno eseguito il Triplo test, cioè un prelievo di sangue tra 15 e 19 settimane di gravidanza; tutte erano già in possesso di una datazione ecografica della gravidanza, eseguita mediante CRL o BPD; , con età mediana 33 anni, hanno eseguito il Test Integrato Biochimico (o Sierologico), quindi un primo prelievo tra 11 e 13 settimane ed un secondo prelievo tra 15 e 19 settimane; la datazione ecografica con CRL era richiesta per l esecuzione del 1 prelievo. Le informazioni sull esecuzione dello Screening sono presenti anche nel sito della ASL, dal quale si può scaricare la modulistica (richiesta e informativa). I prelievi del primo trimestre vengono eseguiti solo presso il Punto Prelievi del Laboratorio Analisi di Arezzo, previo controllo dell età gestazionale ecografica; quelli del secondo trimestre anche presso i principali punti prelievo delle 4 vallate della Provincia. Per la maggior parte delle gestanti, è il ginecologo stesso, pubblico o privato, che provvede a compilare il modulo di richiesta con i dati necessari; in una minoranza dei casi, è la donna a chiedere direttamente il Test. In questo caso viene invitata a presentarsi presso il Punto Prelievi di Arezzo con le ecografie fatte, dalle quali si ricava (e fotocopia) la datazione e si trascrivono nel modulo i dati necessari, contestualmente alla consulenza pre-test. Il servizio è attivo tutte le mattine, dalle 10 alle 12 e senza appuntamento. Tutti i prelievi sono sottoposti alla compartecipazione di spesa. Nel Laboratorio di Arezzo le misure sono eseguite con strumentazione AutoDelfia (Perkin Elmer Life Sciences, Zaventem, Belgio) viene utilizzato come controllo di qualità interno il Maternal Serum (BIORAD Laboratories, Segrate, MI) ed il Laboratorio partecipa al controllo di qualità esterno NEQAS. Lo scopo di questo lavoro è verificare quali sono state le prestazioni di questi test esclusivamente biochimici nel loro complesso. RISULTATI I risultati ottenuti sono riportati nella tabella 2. Nel gruppo considerato di 1247 gravidanze, ci sono stati 65 test positivi, corrispondenti al 5,2%, inviati alla Diagnosi Prenatale Invasiva mediante Amniocentesi. Tra questi sono stati diagnosticati 4 casi di Trisomia 21 e non si è avuto alcun falso negativo. I 4 veri positivi sono tutti relativi a test Integrati Biochimici e sono tutti appartenenti a donne di età inferiore a 35 anni al parto. La quota di falsi Tabella 2 Risultati relativi ai test positivi Donna Età parto Tipo di test Rischio GE 34 Integrato biochimico 1:60 BS 28 Integrato biochimico 1:11 GC 34 Integrato biochimico 1:200 FK 32 Integrato biochimico 1:25 positivi è stata ovviamente maggiore nei Triplo test (6,7%, contro un atteso, in base alla distribuzione di età, del 7,2%) rispetto ai Test Integrati biochimici (3,7% contro un atteso del 5%). Nel gruppo considerato, la sensibilità è stata quindi del 100% e la specificità del 95%. DISCUSSIONE Nel percorso della Diagnosi prenatale della sindrome di Down, con l affermazione dell uso del Test Combinato, in molti centri sono stati abbandonati i dosaggi del secondo trimestre, rendendo impossibile l offerta del Triplo test e del Test Integrato Biochimico a quelle gestanti che arrivano in ritardo o non sono in grado per vari motivi di effettuare la misura della Traslucenza Nucale. Queste donne vengono pertanto lasciate senza un test di screening. Nelle linee guida del Ministero della Salute sono citati entrambi i test, ma in particolare è raccomandato un test al secondo trimestre per le donne che si presentano in ritardo. Per l esperienza della ASL 8 di Arezzo e descritta sopra, la scelta di offrire solo il Test del primo trimestre non sembra essere una scelta appropriata, visto che nella nostra Provincia il 40% circa delle gestanti non riesce ad eseguire il Test Combinato. I dosaggi del secondo trimestre quindi, permettendo l esecuzione sia del Triplo test che del Test Integrato Biochimico, risultano uno strumento indispensabile per offrire il test a tutte le gestanti, evitando di escludere una parte consistente di esse. Un test di Screening, infatti, non può essere elitario e raggiungere solo una fetta degli aventi diritto; si può definire tale solo se raggiunge la totalità della popolazione. BIBLIOGRAFIA 1. Wald NJ, Cuckle HS, Densem JW et al. Maternal Serum Screening for Down s syndrome in early pregnancy. 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