EGFR pharmdx. Codice K test per uso manuale Edizione 05/2015. Uso previsto Per uso diagnostico In Vitro.

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1 EGFR pharmdx Codice K test per uso manuale Edizione 05/2015 Uso previsto Per uso diagnostico In Vitro. Il saggio EGFR pharmdx è un sistema di analisi qualitativa immunoistochimica (IHC) che consente di identificare l espressione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) in tessuti normali e neoplastici fissati secondo le procedure di routine per la valutazione istologica. L analisi EGFR pharmdx individua in maniera specifica la proteina EGFR (HER1) nelle cellule che esprimono EGFR. L analisi EGFR pharmdx è dunque valida per identificare i pazienti affetti da tumore colorettale che sono idonei ad una terapia a base di ERBITUX (Cetuximab) o Vectibix (Panitumumab). Cenni introduttivi Introduzione Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) è un recettore transmembrana 170 kd codificato dal gene HER1 umano. La proteina EGFR contiene un dominio extracellulare di legame al legante, una regione transmembrana e un dominio intracellulare con un attività intrinseca di protein-tirosin-chinasi. Il recettore EGFR è omologo ad altri componenti della famiglia di recettori/erbb dell EGF, tra cui HER2/erbB2 o neu, HER3/erbB3 e HER4/erbB4. 1,2 La proteina EGFR è espressa da una vasta gamma di cellule normali, tra cui molti tipi di cellule epiteliali e tumori da queste derivati. 3-9 Tra le cellule non epiteliali che esprimono EGFR vanno citate la muscolatura liscia, i fibroblasti e i nervi. 10 Specificità L EGFR antiumano monoclonale murino, clone 2-18C9, viene fornito come supernatante per colture tissutali di un ibridoma. È prodotto da un topo immunizzato con EGFR immunoprecipitato proveniente da una linea cellulare A431 (carcinoma epidermoide umano). Gli studi di mappatura dell epitopo indicano che l anticorpo riconosce un epitopo nella regione extracellulare della molecola che è ricca di cisteina, la quale si estende dal sotto-dominio S2 ed è prossimale al dominio transmembrana. L ulteriore mappatura degli aminoacidi di importanza critica indica che l epitopo è conformazionale e dipendente dal ponte di bisolfuro nella molecola nativa. 11 Questo anticorpo monoclonale non ha evidenziato reazioni crociate con HER2, HER3 o HER4 e con il tag vettore, myc. In genere si assiste alla colorazione del citoplasma, tuttavia il test deve essere ripetuto nel caso in cui la colorazione del citoplasma impedisca di distinguere la colorazione della membrana e complichi l interpretazione dei risultati. Principio della procedura Il sistema di analisi IHC denominato EGFR pharmdx contiene tutti i reagenti necessari per portare a termine una procedura di colorazione IHC su campioni fissati secondo le procedure convenzionali e inclusi in paraffina. Dopo l incubazione con l anticorpo monoclonale primario anti-proteina EGFR umana, clone 2-18C9, il kit prevede l impiego di un reagente di visualizzazione pronto all uso, il quale sfrutta la tecnologia a base di destrano. Il reagente è composto da molecole di anticorpo secondario di capra anti-murino e da molecole di perossidasi di rafano, legate ad una comune catena principale di destrano. Questa tecnologia elimina la necessità di applicare in modo sequenziale un anticorpo di collegamento e un coniugato con perossidasi. La conversione enzimatica del cromogeno aggiunto successivamente porta alla formazione di un prodotto di reazione visibile nel sito antigenico. A questo punto è possibile applicare la colorazione di contrasto al campione e montare un vetrino coprioggetto. L interpretazione dei risultati avviene per mezzo di un microscopio ottico. Per verificare il rendimento del reagente, nel kit vengono forniti dei vetrini di controllo contenenti due linee cellulari umane fissate in formalina e incluse in paraffina, con valori di intensità di colorazione pari a 2+ e 0. Reagenti EGFR pharmdx per uso manuale. Il materiale elencato è sufficiente per effettuare 35 test (35 vetrini incubati con anticorpo primario anti-proteina EGFR e 35 vetrini incubati con il corrispondente reagente di controllo negativo). Il numero di test è calcolato in base all uso di 3 gocce di reagente pronto all uso per ogni vetrino. Il kit contiene materiale sufficiente per effettuare un massimo di 5 serie di colorazione singole. ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 1/13

2 Materiali forniti Quantità Descrizione 1x8 ml Proteinase K Enzima proteolitico Proteinase K < 0,1 % diluito in tampone Tris-HCl, contenente sodio azide 0,015 mol/l. 1x8 ml Blocco della perossidasi Perossido di idrogeno al 3%. 1x4 ml Anticorpo monoclonale IgG 1 murino EGFR pharmdx Anticorpo monoclonale IgG 1 murino antiumano EGFR (clone 2-18C9), in forma di supernatante per colture tissutali in tampone Tris-HCl. Contiene proteina stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/l. 1x4 ml Reagente di controllo negativo alle IgG 1 di topo Anticorpo monoclonale IgG 1 murino in forma di supernatante per colture tissutali in tampone Tris-HCl. Contiene proteina stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/l. 1x8 ml Polimero marcato, HRP Destrano coniugato con perossidasi di rafano e immunoglobuline di capra anti-immunoglobuline di topo isolate per affinità. Fornito in tampone Tris-HCl contenente proteina stabilizzante e un agente antimicrobico. 1x10 ml Tampone substrato DAB+ Soluzione tampone substrato, a ph 7,5, contenente < 0,1% di perossido di idrogeno, stabilizzanti, enhancer e un agente antimicrobico. 1x1 ml Cromogeno liquido DAB+ Soluzione cromogeno contenente 3,3'-diaminobenzidina (5%). 1x1 L Tampone di lavaggio 10x Soluzione salina tamponata con Tris, contenente Tween 20, a ph 7,6. 5 vetrini Vetrini di controllo EGFR pharmdx Ogni vetrino contiene sezioni di due linee cellulari pellettizzate, fissate in formalina, incluse in paraffina, che rappresentano un livello moderato di espressione della proteina EGFR e assenza di espressione EGFR. I valori di intensità della colorazione IHC dei pellet cellulari sono pari a 2+ e 0. Linea cellulare: CAMA-1 Livello di espressione: 0 Linea cellulare: HT-29 Livello di espressione: 2+ ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 2/13

3 Materiali necessari ma non forniti Idrossido di ammonio, 15 mol/l, diluito a 0,037 mol/l Colorazione di contrasto: ematossilina, a base di alcol o acqua, ad esempio Dako Hematoxylin (codice S3302) oppure Dako Automation Hematoxylin (codice S3301) Vetrini coprioggetto Acqua distillata o deionizzata (acqua grado reagente) Forno essiccante, in grado di mantenere una temperatura di C Etanolo, assoluto e al 95% Camera umidificata Microscopio ottico (ingrandimento dell obiettivo 4x-40x) Mezzo di montaggio, ad esempio Dako Faramount (codice S3025), Dako Glycergel (codice C0563) o Dako Ultramount (codice S1964) Tessuti positivi e negativi da utilizzare come controlli di lavoro (vedere Controllo della qualità) Vetrini: vetrini Fisher SuperFrost Plus, vetrini polilisinati, vetrini a carica positiva o vetrini Dako Silanized Slides, codice S3003 (vedere Preparazione dei campioni) Vaschette o bagni per la colorazione Contaminuti (per intervalli di 2 30 minuti) Spruzzetta Xilene, toluene o derivati dello xilene Nota: tutti i reagenti inclusi o disponibili a parte, come Dako Wash Buffer (codice S3006), sono formulati in modo specifico per questo test. Affinché il test abbia il livello di rendimento specificato, evitare sostituzioni di qualsiasi genere. Preparazione dei campioni I campioni bioptici devono essere manipolati in modo da preservare il tessuto per la colorazione IHC. Adottare i metodi standard per il trattamento dei tessuti di tutti i campioni. 13 I campioni conservati nei fissativi elencati di seguito sono idonei all uso con l analisi EGFR pharmdx. Formalina tamponata neutra al 10% (v/v); formalina non tamponata al 10% (v/v); formalina non tamponata al 25% (v/v); alcol-formalina-acido acetico (AFA); Richard-Allen Scientific s Pen-fix; Bouin s Fixative. I tessuti fissati in Anatech s PreFer non sono idonei all uso con l analisi EGFR pharmdx. Se i tessuti fissati in PreFer vengono analizzati con il test EGFR pharmdx, la preservazione della morfologia è insoddisfacente e si possono ottenere risultati erronei. 14 Sezioni incluse in paraffina Si possono utilizzare i tessuti trattati con i metodi convenzionali e inclusi in paraffina. I campioni bioptici devono essere bloccati in uno spessore di 3 o 4 mm e fissati per il periodo di tempo necessario, in base al tipo di fissativo utilizzato. In seguito i tessuti vengono disidratati e diafanizzati in una serie di alcoli e xilene, quindi infiltrati con paraffina fusa. La temperatura della paraffina non deve superare i 60 C. I blocchi di tessuto adeguatamente fissati e inclusi in paraffina che esprimono la proteina EGFR si conserveranno a tempo indeterminato prima del sezionamento e del montaggio sui vetrini, purché conservati in un luogo fresco (15-25 C). 13,15 I campioni di tessuto devono essere tagliati in sezioni di 3 5 µm. Dopo il sezionamento, i tessuti vengono montati sui vetrini e infine collocati sugli appositi rack per l essiccamento. Si consiglia di utilizzare vetrini Fisher SuperFrost Plus, vetrini silanizzati Dako Silanized Slides (codice S3003), vetrini a carica positiva o vetrini polilisinati. Scuotere il rack porta-vetrini su una salviettina assorbente, in modo da eliminare l acqua intrappolata sotto la paraffina e sul vetro. Lasciare asciugare il rack porta-vetrini a temperatura ambiente per un ora, quindi metterlo in un incubatrice a C per un altra ora. È necessario eliminare tutt a l eventuale acqua in eccesso trattenuta sui vetrini dopo il periodo in incubatrice. A questo scopo, scuotere i vetrini su salviettine assorbenti e lasciarli asciugare nell incubatrice per un altra ora. Dopo il periodo trascorso nell incubatrice, i vetrini devono essere lasciati a temperatura ambiente finché non si raffreddano e finché la paraffina non si indurisce. Per preservare l antigenicità, è necessario che le sezioni di tessuto montate sui vetrini (Fisher SuperFrost Plus, polilisinati, a carica positiva o Dako Silanized Slides - codice S3003) vengano sottoposte alla procedura di colorazione entro 2 mesi dal sezionamento, purché conservate a temperatura ambiente (20 25 C). 14 Consultare il manuale Dako "Immunochemical Staining Methods" 16 o i riferimenti bibliografici 13 e 15 per ulteriori informazioni sulla preparazione dei campioni. L uso di questo sistema di analisi con tessuti decalcificati non è stato approvato ed è fortemente sconsigliato. I vetrini da utilizzare per la valutazione EGFR e per la verifica della presenza di tumore devono essere preparati in contemporanea. Si consiglia di preparare almeno 5 vetrini: 1 per la presenza di tumore, 2 per la valutazione della proteina EGFR (uno per l anticorpo primario e uno per il reagente di controllo negativo), 2 vetrini di riserva. Precauzioni 1. Per uso professionale. 2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN 3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura. Sebbene non sia classificato come prodotto a rischio, il contenuto di NaN 3 alle concentrazioni indicate può reagire con il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento, sciacquare le tubature con abbondante acqua per prevenire l eventuale accumulo di azide Sia per i campioni che per i reagenti, si consiglia di adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica. 4. Ridurre al minimo la contaminazione batterica dei reagenti, così da evitare una colorazione aspecifica. 5. Tempi, temperature e modalità di incubazione diversi da quelli specificati possono generare risultati erronei. 6. I reagenti sono stati diluiti in modo ottimale. Ulteriori diluizioni potrebbero causare la perdita di colorazione antigenica. 7. Non sostituire gli anticorpi primari o i reagenti di controllo negativi con anticorpi primari e reagenti di controllo negativi appartenenti a lotti di produzione diversi (il numero di lotto è riportato sull etichetta delle fiale) o con reagenti di altri produttori. 8. Il polimero marcato, il cromogeno liquido DAB+ e la soluzione preparata cromogeno-substrato DAB+ possono subire alterazioni se esposti a livelli di luce eccessivi. Evitare di conservare i componenti del kit e di eseguire la colorazione in condizioni di luce intensa, ad esempio sotto la luce diretta del sole. ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 3/13

4 9. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, così da evitare il contatto con gli occhi e la pelle. 18 Smaltire i reagenti inutilizzati nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali previste in materia. 10. Su richiesta è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti. 11. In generale, l'utilizzo del prodotto da parte di soggetti di età inferiore a 18 anni non è consentito. Gli utenti devono essere accuratamente informati in merito alle corrette procedure operative, alle proprietà pericolose del prodotto e alle disposizioni di sicurezza necessarie. Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla Scheda dati di sicurezza (SDS). Pericolo DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Può provocare il cancro. H341 Sospettato di provocare alterazioni genetiche. P201 Procurarsi istruzioni specifiche prima dell uso. P202 Non manipolare prima di avere letto e compreso tutte le avvertenze. P281 Utilizzare il dispositivo di protezione individuale richiesto. P308 + P313 IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: Richiedere assistenza medica. P405 Conservare sotto chiave. P501 Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e internazionali. Attenzione Wash Buffer (10X): 5-10% Sodium chloride, 5-10% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride H319 Provoca grave irritazione oculare. P280 Indossare guanti protettivi. Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. Indossare indumenti protettivi. P264 Lavare accuratamente le mani dopo l'uso. P305 + P351 + P338 IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. P337 + P313 Se l irritazione degli occhi persiste, consultare un medico. Conservazione Conservare il kit per analisi EGFR pharmdx a 2 8 C. Conservare anche i vetrini di controllo a 2 8 C. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza stampata all esterno della confezione del kit. Non sono stati osservati segni evidenti che suggeriscano l instabilità di questi prodotti, pertanto è opportuno analizzare un controllo positivo e un controllo negativo contemporaneamente ai campioni dei pazienti. Se i prodotti sono conservati in condizioni difformi da quelle specificate nel relativo foglietto illustrativo, l uso dei reagenti dovrà essere convalidato dall utente. 12 Preparazione dei reagenti Preparare i seguenti reagenti prima della colorazione. Soluzione tampone di lavaggio Preparare una quantità sufficiente di tampone per i cicli di lavaggio. A questo scopo, diluire il prodotto Wash Buffer 10x con rapporto 1:10 usando acqua distillata o deionizzata (acqua grado reagente). Eliminare la soluzione tampone se appare torbida. Soluzione cromogeno-substrato DAB+ Miscelare accuratamente questa soluzione prima dell uso. L eventuale presenza di precipitato nella soluzione non altera la qualità della colorazione. Con la procedura illustrata di seguito è possibile preparare 1 ml di soluzione cromogeno-substrato DAB+. FASE 1. Trasferire 1 ml di tampone substrato DAB+ in una provetta. FASE 2. Aggiungere una goccia di cromogeno liquido DAB+. Miscelare e applicare sulle sezioni tissutali con una pipetta. La soluzione preparata cromogeno-substrato (DAB) è stabile per 5 giorni circa, purché conservata a 2 8 C. Nota importante: il colore della soluzione cromogeno liquido DAB+ nel flacone può variare da trasparente a violetto chiaro-marrone. Questa caratteristica non altera il rendimento del prodotto. Diluire in base alle istruzioni fornite sopra. L aggiunta di una quantità eccessiva di soluzione cromogeno liquido DAB+ al tampone substrato DAB+ causa un deterioramento del segnale positivo. Colorazione di contrasto Preparare la soluzione ammoniacale per l eventuale colorazione di contrasto blu richiesta. La soluzione ammoniacale (0,037 mol/l) viene preparata miscelando 2,5 (±0,5) ml di idrossido di ammonio 15 mol/l (concentrato) in 1 litro di acqua grado reagente. La soluzione ammoniacale 0,037 mol/l inutilizzata può essere conservata in un flacone perfettamente sigillato a temperatura ambiente (20 25 C) per 12 mesi. Mezzo di montaggio ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 4/13

5 Per il montaggio acquoso si consiglia di utilizzare i mezzi Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (codice S3025) o Dako Glycergel Mounting Medium (codice C0563). Liquefare Glycergel prima dell uso riscaldando il mezzo fino a 40 (±5) C circa. È possibile utilizzare anche un mezzo di montaggio permanente non acquoso, ad esempio Dako Ultramount (codice S1964). Procedura per la colorazione Note sulla procedura Prima dell uso, l utente deve leggere attentamente le istruzioni fornite di seguito e studiare tutti i componenti (vedere Precauzioni). Tutti i reagenti devono essere equilibrati a temperatura ambiente (20 25 C) prima dell immunocolorazione. Analogamente, tutte le fasi di incubazione devono svolgersi a temperatura ambiente. Evitare che le sezioni di tessuto si secchino durante la procedura di colorazione, altrimenti si potrebbe assistere ad un aumento del fenomeno di colorazione aspecifica. Per prevenire l essiccamento dei tessuti, collocare i vetrini in una camera umidificata. Deparaffinazione e reidratazione Prima della colorazione, i vetrini contenenti i tessuti devono essere deparaffinati per rimuovere il mezzo di inclusione e successivamente reidratati. Non rimuovere la paraffina solo parzialmente: la presenza di eventuali residui del mezzo di inclusione può provocare un aumento della colorazione aspecifica. FASE 1. Immergere i vetrini in un bagno di xilene e incubare per 5 (±1) minuti. Cambiare il bagno e ripetere una volta. FASE 2. Picchiettare i vetrini per eliminare il liquido in eccesso e immergerli in etanolo assoluto per 3 (±1) minuti. Cambiare il bagno e ripetere una volta. FASE 3. Picchiettare i vetrini per eliminare il liquido in eccesso e immergerli in etanolo al 95% per 3 (±1) minuti. Cambiare il bagno e ripetere una volta. FASE 4. Picchiettare i vetrini per eliminare il liquido in eccesso e immergerli in acqua grado reagente per 5 (±1) minuti. Avviare la procedura di colorazione (vedere le istruzioni contenute nella sezione C, Protocollo di colorazione). Le soluzioni di xilene e di alcol devono essere sostituite dopo 40 vetrini. Al posto dello xilene è possibile utilizzare i derivati di toluene o xilene, ad esempio Histoclear. Protocollo di colorazione FASE 1. Digestione proteolitica con proteinasi K Picchiettare per eliminare l acqua grado reagente in eccesso. Utilizzando carta bibula (ad esempio Kimwipe o carta di tessuto assorbente), asciugare accuratamente il vetrino attorno al campione per rimuovere il liquido in eccesso e mantenere i reagenti all interno dell area prescritta. Applicare una quantità di soluzione Proteinase K sufficiente per coprire il campione (almeno 3 gocce, 100 µl). Incubare per 5 (±0,5) minuti. Sciacquare delicatamente con acqua grado reagente da una spruzzetta (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul tessuto). Immergere in un bagno di acqua grado reagente per 5 (±1) minuti. Il kit EGFR pharmdx include una fase di pretrattamento con digestione dell enzima proteolitico. Talvolta è possibile che le sezioni di tessuto siano sovradigerite e questo causa la disgregazione delle membrane cellulari e della struttura generale del tessuto. Eseguire l analisi prestando attenzione alla durata della fase di digestione proteolitica. Nota: se la sovradigestione è un problema frequente, i tessuti fissati in formalina tamponata neutra al 10% possono essere sottoposti a post-fissazione in formalina tamponata neutra al 10% per 10 minuti dopo la deparaffinazione. Vedere la procedura riportata di seguito. Procedura di post-fissazione 1. Deparaffinare le sezioni e immergerle in acqua grado reagente. 2. Immergere i vetrini in un bagno di formalina tamponata neutra al 10% per 10 minuti. 3. Risciacquare i vetrini due volte in acqua deionizzata o distillata. 4. Proseguire con la procedura di colorazione EGFR pharmdx. FASE 2. Blocco della perossidasi Picchiettare per eliminare l acqua in eccesso e asciugare i vetrini come descritto precedentemente. Applicare una quantità di soluzione Peroxidase Block sufficiente per coprire il campione (almeno 3 gocce, 100 µl). Incubare per 5 (±1) minuti. Sciacquare delicatamente con tampone di lavaggio da una spruzzetta (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul tessuto). Immergere in un bagno di tampone di lavaggio per 5 (±1) minuti. FASE 3. Anticorpo primario o reagente di controllo negativo Collocare i vetrini in una camera umidificata durante le incubazioni con anticorpo primario/reagente di controllo negativo e polimero marcato, in modo da evitare che i tessuti si secchino. Picchiettare per eliminare il tampone in eccesso e asciugare i vetrini come descritto precedentemente. Applicare una quantità di anticorpo primario o di reagente di controllo negativo sufficiente per coprire il campione (minimo 3 gocce, 100 µl). Incubare per 30 (±1) minuti in una camera umidificata. Sciacquare i vetrini come nella fase 2. FASE 4. Polimero marcato, HRP Picchiettare per eliminare il tampone in eccesso e asciugare i vetrini come descritto precedentemente. Applicare una quantità di polimero marcato sufficiente per coprire il campione (almeno 3 gocce, 100 µl). ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 5/13

6 Incubare per 30 (±1) minuti in una camera umidificata. Sciacquare i vetrini come nella fase 2. FASE 5. Soluzione cromogeno-substrato DAB+ Picchiettare per eliminare il tampone in eccesso e asciugare i vetrini come descritto precedentemente. Applicare una quantità di soluzione cromogeno-substrato DAB+ sufficiente per coprire il campione (almeno 3 gocce, 100 µl). Incubare per 10 (±1) minuti. Sciacquare delicatamente con acqua grado reagente da una spruzzetta (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul tessuto). Raccogliere la soluzione cromogeno-substrato DAB+ in un contenitore per materiali pericolosi e smaltire in modo appropriato. Immergere in un bagno di acqua grado reagente per 2 5 minuti. Colorazione di contrasto (istruzioni per ematossilina) Il prodotto finale della reazione di colorazione è insolubile in alcol e in acqua. È possibile utilizzare ematossilina a base di alcol o acqua, come Dako Hematoxylin (codice S3302) o Dako Automation Hematoxylin (codice S3301). Non utilizzare colorazioni di contrasto regressive. FASE 1. FASE 2. Immergere i vetrini in un bagno di ematossilina. Incubare per 2 5 minuti, a seconda dell intensità dell ematossilina utilizzata. Sciacquare delicatamente in un bagno di acqua grado reagente. Verificare che tutta l ematossilina residua venga lavata via. Facoltativo: immergere i vetrini 10 volte in un bagno di soluzione ammoniacale 0,037 mol/l (vedere Preparazione dei reagenti). Quando si utilizzano i prodotti Dako Hematoxylin (codice S3302) o Dako Automation Hematoxylin (codice S3301), la fase della soluzione ammoniacale non è necessaria. Nota: si consiglia vivamente di utilizzare i prodotti Dako Hematoxylin (codice S3302) o Dako Automation Hematoxylin (codice S3301). Con un incubazione di 5 minuti, questa colorazione di contrasto genera un prodotto finale viola chiaro/blu che non oscura l immunocolorazione specifica. Una colorazione di contrasto troppo forte potrebbe mascherare un espressione EGFR debole. FASE 3. Sciacquare delicatamente in un bagno di acqua grado reagente per 2 5 minuti. Montaggio Per il montaggio acquoso si consiglia l uso di mezzi Dako come Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (codice S3025) o Dako Glycergel Mounting Medium (codice C0563). Liquefare Glycergel prima dell uso riscaldando il mezzo fino a 40 C (±5) circa. È possibile utilizzare anche un mezzo di montaggio permanente non acquoso, ad esempio Dako Ultramount (codice S1964). Nota: è possibile leggere i vetrini in qualunque momento. Tuttavia, se i vetrini vengono coperti con un mezzo di montaggio acquoso ed esposti alla luce intensa è possibile che si verifichi un certo grado di scolorimento. Per evitare che ciò accada, conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente (20 25 C). Controllo della qualità Se le procedure consigliate per la fissazione, il trattamento e l inclusione dei tessuti vengono modificate in laboratorio, è possibile che i risultati presentino variazioni significative. In tal caso, oltre ad utilizzare i vetrini di controllo forniti da Dako, occorre effettuare tutta una serie di controlli interni con regolarità. Negli USA, consultare le linee guida sul controllo della qualità stabilite nel "College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry". Fare inoltre riferimento alle istruzioni "CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline" 19 e ai riferimenti bibliografici per ulteriori informazioni. Vetrini di controllo EGFR pharmdx (forniti nel kit) Tutti i vetrini di controllo forniti nel kit contengono due linee cellulari umane pellettizzate, fissate in formalina e incluse in paraffina, con valori di intensità di colorazione pari a 2+ e 0. È necessario utilizzare un vetrino in ogni procedura di colorazione. Valutando le linee cellulari sul vetrino di controllo fornito da Dako è possibile verificare la validità della procedura di colorazione. Non utilizzare i vetrini di controllo per l interpretazione dei risultati dei campioni. Tessuto di controllo positivo I controlli dovrebbero essere costituiti da campioni freschi di autopsia/biopsia/chirurgia che sono stati fissati, trattati e inclusi in paraffina nei tempi più brevi possibili, seguendo la medesima procedura utilizzata per i campioni dei pazienti da analizzare. I controlli positivi confermano se i tessuti sono stati preparati correttamente e se sono state adottate tecniche di colorazione corrette. È necessario includere un controllo positivo per ogni set di condizioni di analisi previsto in ogni ciclo di colorazione. I controlli positivi devono produrre una colorazione positiva debole, così da evidenziare variazioni leggere nella sensibilità dell anticorpo primario. I vetrini di controllo forniti nel kit o i campioni trattati diversamente dai campioni dei pazienti consentono di convalidare soltanto il rendimento del reagente, ma non verificano la preparazione del tessuto. I controlli positivi noti devono essere utilizzati esclusivamente per verificare il corretto rendimento dei tessuti trattati e dei reagenti per l analisi, NON per formulare una diagnosi specifica dei campioni dei pazienti. Se i controlli positivi non presentano una colorazione positiva, significa che i risultati ottenuti con i campioni dei pazienti analizzati non sono validi. Tra i tipi di cellule normali che possono essere utilizzati come campioni EGFR positivi deboli vanno citate le cellule epiteliali ghiandolari della prostata e l epitelio bronchiale del polmone. Poiché il pattern di colorazione EGFR è eterogeneo, anche gli elementi del tessuto normale che si colorano in modo debole possono risultare negativi. Un controllo interno positivo particolarmente forte è il perinevrio. Tra le cellule normali che presentano una colorazione EGFR positiva di moderata intensità vanno citate le cellule epiteliali della cervice e la pelle. Tessuto di controllo negativo In ogni ciclo di colorazione è necessario utilizzare un tessuto di controllo negativo (negativo alla proteina EGFR) che sia stato fissato, trattato e incluso in paraffina secondo la medesima procedura adottata per i campioni dei pazienti da analizzare. In questo modo è possibile ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 6/13

7 verificare la specificità dell anticorpo primario e fornire un indicazione della colorazione di fondo specifica. Molteplici tipi di cellule presenti nella maggior parte delle sezioni tissutali offrono siti interni di controllo negativo (è necessaria una verifica dell utente). Se si osserva una colorazione specifica nel tessuto di controllo negativo, significa che i risultati ottenuti con i campioni dei pazienti analizzati non sono validi. Tra gli elementi del tessuto che possono essere utilizzati come controlli negativi vanno citati i miociti cardiaci. Anche le cellule acinose pancreatiche sono negative all EGFR, mentre l epitelio del dotto biliare pancreatico assume una colorazione positiva. L analisi EGFR pharmdx non produce una colorazione dei linfociti, quando questi sono presenti, pertanto è possibile utilizzare i linfociti come controllo negativo interno. Reagente di controllo negativo aspecifico Al posto dell anticorpo primario, è possibile utilizzare il reagente di controllo negativo (fornito nel kit) su una sezione di ogni campione con lo scopo di valutare la colorazione aspecifica e favorire l interpretazione della colorazione specifica nel sito dell antigene. Il periodo di incubazione del reagente di controllo negativo deve corrispondere a quello dell anticorpo primario. Verifica del saggio Prima di utilizzare per la prima volta un sistema di colorazione in una procedura diagnostica, l utente deve verificare la specificità del test applicandolo ad una serie di tessuti interni con caratteristiche note di rendimento IHC, che rappresentano tessuti positivi e negativi noti. Tali procedure di verifica devono essere ripetute per ogni nuovo lotto di test. A questo scopo, fare riferimento alle procedure per il controllo della qualità descritte in questa sezione del foglietto illustrativo del prodotto e ai requisiti di controllo della qualità espressi nel "CAP Certification Program for Immunohistochemistry" e/o alle istruzioni "CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline". 19 Per la verifica del saggio è possibile utilizzare sia tessuti negativi, sia carcinomi per i quali siano noti i valori di intensità della colorazione EGFR. Tabella 1. Finalità del controllo di qualità giornaliero Tessuto: fissato e trattato come il campione del paziente Anticorpo specifico e sistema di rivelazione Fondo: anticorpo aspecifico (reagente di controllo negativo, IgG 1 murine) fornito Vetrino di controllo fornito da Dako. Controllo positivo: tessuti o cellule che contengono l antigene bersaglio da individuare (potrebbe essere presente nel tessuto del paziente). Il controllo ideale è un tessuto con una colorazione positiva debole, in quanto è più sensibile all anticorpo o alla degradazione dell antigene. Controllo negativo: tessuti o cellule che si presume negativi (potrebbero trovarsi nel tessuto del paziente o nel tessuto di controllo positivo). Controlla solo la procedura di colorazione. Valutando le linee cellulari sul vetrino di controllo fornito da Dako è possibile verificare la validità della procedura di colorazione. Controlla tutte le fasi dell analisi. Convalida le procedure e i reagenti utilizzati per la colorazione EGFR. Rilevamento di una reattività crociata indesiderata dell anticorpo verso le cellule e/o i componenti cellulari. Rilevamento di una colorazione di fondo aspecifica. Rilevamento di una colorazione di fondo aspecifica. Tessuto del paziente. Rilevamento della colorazione specifica. Rilevamento di una colorazione di fondo aspecifica. Interpretazione della procedura di colorazione La valutazione dei vetrini deve essere effettuata da un patologo con un microscopio ottico. Tutte le valutazioni devono essere effettuate sulla regione tumorale del campione. Per la valutazione della colorazione immunocitochimica e la determinazione dell intensità, serve un obiettivo con un ingrandimento 10x o 20x. Per l interpretazione dei risultati della colorazione, prendere in considerazione le cellule intatte: spesso le cellule necrotiche o degradate assumono una colorazione aspecifica. 19 In ogni kit EGFR pharmdx sono contenute linee cellulari positive e negative, che consentono di convalidare i cicli di colorazione ogni volta che viene eseguita l analisi. Una colorazione adeguata delle linee cellulari di controllo indica che il kit EGFR pharmdx funziona correttamente. L assenza di colorazione della membrana per la linea cellulare di controllo CAMA-1 (0) e una colorazione marrone chiaro o incompleta della membrana per la linea cellulare di controllo HT-29 (2+) indicano che il ciclo di colorazione è valido. Se l intensità della colorazione della linea cellulare di controllo positiva è troppo debole o troppo forte, è possibile che vengano generati risultati falsi-negativi o falsi-positivi. In questo caso è necessario ripetere il test. Sono disponibili immagini di riferimento nella guida all interpretazione del test EGFR pharmdx. Il kit EGFR pharmdx colora prevalentemente le membrane cellulari, rivelando sia una colorazione circonferenziale completa che incompleta. Il pattern di immunocolorazione è spesso eterogeneo e rivela varie intensità di colorazione all interno di una singola neoplasia. È stata osservata anche la colorazione del citoplasma e degli spazi extracellulari. Spesso si assiste alla colorazione del citoplasma, tuttavia il test va ripetuto nel caso in cui una significativa colorazione del citoplasma complichi la distinzione della colorazione della membrana e l'interpretazione dei risultati. I tumori devono essere classificati positivi all'egfr o negativi all'egfr tramite la colorazione della membrana come struttura da valutare. Una cellula tumorale è positiva all'egfr se presenta una colorazione della membrana oltre il livello di fondo, sia essa completamente circonferenziale o meno. Un tumore senza colorazione della membrana oltre il livello di fondo in qualsiasi cellula tumorale è classificato come tumore negativo all'egfr. ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 7/13

8 A seconda della durata dell incubazione o della potenza dell ematossilina impiegata, la colorazione di contrasto può produrre un blu più o meno scuro nel nucleo della cellula. Una colorazione di contrasto eccessiva o incompleta può compromettere la corretta interpretazione dei risultati. Tabella 2. Risultati della colorazione con EGFR pharmdx Riferire al medico curante Tumore negativo all'egfr Tumore positivo all'egfr Definizione Assenza di colorazione della membrana oltre il livello di fondo in tutte le cellule tumorali La colorazione positiva all'egfr è definita come una qualsiasi colorazione IHC della membrana della cellula tumorale oltre il livello di fondo, sia essa completamente circonferenziale o meno. Intensità della colorazione Percentuale di colorazione delle cellule tumorali 1+, 2+ o 3+ > 0% Tali definizioni di risultati positivi e negativi rispettano le pubblicazioni sull'argomento, 24 ma possono necessitare di modifiche in contesti specifici. (Vedere la sezione sottostante Limiti specifici del prodotto) Limiti Limiti generali L IHC è una tecnica diagnostica multifase che richiede un addestramento specifico per quanto riguarda la scelta dei reagenti appropriati, la selezione, la fissazione e il trattamento dei tessuti, la preparazione del vetrino per IHC e l interpretazione dei risultati della colorazione. La colorazione del tessuto dipende dal modo in cui tale tessuto viene trattato prima. Una fissazione eseguita in maniera scorretta, il congelamento, lo scongelamento, il lavaggio, l essiccazione, il riscaldamento, il sezionamento o la contaminazione con altri tessuti o fluidi possono produrre artefatti, intrappolare l anticorpo o generare risultati falsi-negativi. Risultati incoerenti possono essere provocati anche da modifiche apportate ai metodi di fissazione e di inclusione o da irregolarità intrinseche del tessuto. Una colorazione di contrasto eccessiva o incompleta può compromettere l interpretazione dei risultati. L interpretazione clinica di qualsiasi colorazione positiva o assenza di colorazione non può prescindere dal contesto della presentazione clinica, della morfologia e di altri criteri istopatologici e deve sempre essere accompagnata da studi morfologici e controlli adeguati, oltre che da altri test diagnostici. L interpretazione della colorazione è di competenza di un patologo qualificato, che deve avere una profonda conoscenza degli anticorpi, dei reagenti e dei metodi impiegati. La colorazione deve essere eseguita in un laboratorio autorizzato certificato, sotto la supervisione di un patologo incaricato di esaminare i vetrini colorati e garantire l adeguatezza dei controlli positivi e negativi. I tessuti delle persone infette dal virus dell epatite B e contenenti l antigene di superficie dell epatite B (HBsAg) possono essere interessati da una colorazione aspecifica con la perossidasi di rafano. 25 I reagenti potrebbero provocare reazioni impreviste in tessuti che non sono mai stati analizzati in passato. Inoltre non è possibile escludere la possibilità che si verifichino reazioni impreviste anche in gruppi di tessuti già analizzati in passato, vista l elevata variabilità biologica dell espressione antigenica nelle neoplasie o in altri tessuti patologici. 22 Si prega di voler comunicare eventuali reazioni impreviste all assistenza tecnica Dako, fornendo tutta la documentazione del caso. Eventuali risultati falsi-positivi potrebbero essere dovuti ad un legame non immunologico delle proteine o dei prodotti di reazione del substrato, oltre che dall attività di pseudoperossidasi (eritrociti) e dall attività di perossidasi endogena (citocromo C). 21 Nota: i reagenti e le istruzioni fornite in questo sistema di analisi sono state studiate per assicurare una prestazione ottimale. L ulteriore diluizione dei reagenti o una variazione dei tempi o delle temperature di incubazione potrebbero generare risultati erronei o discordanti. Limiti specifici del prodotto La percentuale di risposta al trattamento con cetuximab per i pazienti risultati negativi all'egfr e per quelli che hanno riscontrato una colorazione positiva all'egfr in meno dell'1% delle cellule tumorali non è nota, poiché tali pazienti non erano presenti agli studi clinici sul farmaco. I tumori con colorazione positiva all'egfr in > 1% delle relative cellule esprimono l'egfr rispettando le attuali istruzioni per l'uso del cetuximab. I pazienti che presentavano una colorazione EGFR della membrana con una quantità di cellule tumorali inferiore all'uno percento non sono stati inseriti nello studio per il controllo randomizzato di Panitumumab e, pertanto, l'attività del Panitumumab in questa popolazione di pazienti è sconosciuta. I tumori con colorazione positiva all'egfr in >1% delle cellule sono considerati come esprimenti EGFR rispetto alle attuali indicazioni per l'uso del Panitumumab. Eventuali risultati falsi-negativi potrebbero essere dovuti alla degradazione dell antigene nei tessuti con il passare del tempo. I campioni devono essere sottoposti a colorazione entro due mesi dal montaggio dei tessuti sui vetrini, purché conservati a temperatura ambiente (20-25 C). 14,26 Per garantire risultati ottimali e riproducibili, la proteina EGFR richiede una fase di digestione proteolitica quando i tessuti sono fissati e inclusi in paraffina secondo i metodi convenzionali. ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 8/13

9 Caratteristiche prestazionali Specificità L anticorpo anti-egfr, clone 2-18C9 (2-18C9), è stato testato per studiare la reattività contro le linee cellulari che esprimono EGFR, HER2, HER3 ed HER4. Nel Western blotting dei lisati cellulari SKBR3 e A431, il clone 2-18C9 ha identificato una banda 170 kd che è coerente con il peso molecolare noto dell EGFR. Il clone 2-18C9 ha inoltre identificato la forma EGFRvIII (145 kd) del recettore nell analisi immunoistochimica, nella citometria di flusso e nel Western blotting delle linee cellulari EGFRvIII transfettate. Negli esperimenti di Western blotting, il clone 2-18C9 non ha reagito con i lisati cellulari CAMA-1 positivi per HER2, gli estratti proteici BL-21 E. coli HER3-trasformati e i lisati cellulari CHO-HER4 transfettati. Inoltre, transfettanti di Chinese Hamster Ovary (CHO) che esprimevano myc (tag vettore), sia da solo sia coespresso con uno dei membri della famiglia HER, sono stati sottoposti a coltura su vetrini in camera fissati in formalina e inclusi in paraffina e colorati con anti-myc e 2-18C9. L anticorpo anti-myc ha colorato tutti e cinque i transfettanti CHO, mentre il clone 2-18C9 ha colorato solo le cellule CHO transfettate con HER1. Studi clinici Studi clinici Cetuximab Sono stati eseguiti tre studi (EMD , IMCL CP e IMCL CP ) sul farmaco cetuximab, utilizzato nella cura del carcinoma colorettale (CRC). I risultati dei test che hanno espresso l'egfr aduna colorazione immunoistochimica con Dako sono stati adottati come uno dei criteri per determinare se un campione fosse idoneo o meno a far parte dello studio. In 2 dei 3 studi che comprendevano lo studio pivotal (EMD ), la soglia per i tumori che esprimevano l'egfr è stata fissata a 1+ (su un intervallo possibile da 0 a 3+) per quanto riguarda l intensità della colorazione positiva all'egfr in > 1% di tutte le cellule tumorali. È stata selezionata questa soglia perché un analisi dei sottogruppi applicata a un intera gamma di soglie differenti relative ai criteri di colorazione della membrana e ad altri criteri di differenziazione non aveva prodotto esiti significativi sul piano della differenziazione dei risultati clinici. Studio pivotal Cetuximab Lo studio pivotal (EMD ) ha consentito il reclutamento dei pazienti affetti da tumori per i quali è stata rilevata qualche cellula positiva all'egfr tramite il test Dako EGFR pharmdx. Tutti questi tumori riscontrati nello studio mostravano almeno l'1% di cellule positive all'egfr e tali tumori esprimevano l'egfr. I pazienti affetti da tumori che esprimevano sono stati curati con solo Cetuximab o con Cetuximab + Irinotecan. Sono stati analizzati 577 campioni di tumori. 474 dei 577 campioni di carcinoma colorettale (CRC) analizzati (82%, 95% CI = 78,1%, 86,1%) esprimevano l'egfr. 329 pazienti positivi all EGFR pharmdx sono risultati idonei alla randomizzazione 2:1 nei due filoni dello studio pivotal sul farmaco. In questo studio, i pazienti trattati con Cetuximab + Irinotecan hanno ottenuto una percentuale di risposta pari a 50 su 218 (22,9%, 95% CI = 17,5%, 29,1%). I pazienti trattati con solo Cetuximab hanno ottenuto una percentuale di risposta pari a 12 su 111 (10,8%, 95% CI = 5,7%, 18,1%). Il Cetuximab è stato somministrato solo ai pazienti affetti da tumori che esprimevano l'egfr Dako, come sopra descritto. La percentuale di risposta relativa ai tumori che non esprimevano l EGFR non è nota, pertanto non può essere utilizzata per un eventuale confronto. Non c è correlazione tra il grado di risposta del tumore e la percentuale di cellule positive all EGFR o l intensità della colorazione EGFR (vedere Tabella 3). Tabella 3. Percentuali di risposta nello studio pivotal sul cetuximab (EMD ) Numero totale di pazienti analizzati Percentuale di risposta # dei casi trattati con cetuximab + Irinotecan EGFR pharmdx + (>1%) 474* 50/218 (22,9%, 95% CI = 17,5%, 29,1%) EGFR pharmdx Nessuno Nessuno Percentuale di risposta # dei casi trattati con cetuximab solo 12/111 (10,8%, 95% CI = 5,7%, 18,1%) *329 pazienti positivi erano idonei alla randomizzazione 2:1 nei due filoni dello studio pivotal sul farmaco # La percentuale di risposta si riferisce al numero di pazienti che, rispetto all intera popolazione esaminata nello studio, ha conseguito una riduzione 50% per quanto riguarda la somma del diametro perpendicolare di tutto il tumore misurabile (in altre parole, una riduzione della superficie del tumore pari almeno al 50%), riduzione che è perdurata per almeno 28 giorni. Studi di supporto Cetuximab Il dosaggio EGFR pharmdx ha permesso di selezionare i pazienti ritenuti idonei a partecipare allo studio pivotal (EMD ) e ad uno studio di supporto (IMCL CP ) durante lo sviluppo del Cetuximab. Nello studio IMCL CP sono stati analizzati 140 campioni. Di questi, 105 campioni su 140 (75%, 95% CI = 66,9%, 83,1%) presentavano tumori che esprimevano l EGFR. Su 61 pazienti ammessi allo studio, solo 57 sono stati sottoposti alla terapia con cetuximab. In un ulteriore studio di supporto (IMCL CP ), per la selezione dei pazienti è stato utilizzato un prototipo del kit EGFR pharmdx (costituito dallo stesso anticorpo primario e dallo stesso sistema di rivelazione descritti in precedenza). In totale sono stati analizzati 412 campioni provenienti da 401 pazienti. 292 pazienti su 401 (72,8%, 95% CI = 68,0%, 77,6%) sono risultati positivi al test. Su 139 pazienti ammessi allo studio, 138 sono stati sottoposti alla terapia con cetuximab + Irinotecan. Tabella 4. Riepilogo della percentuale che esprime l EGFR nei pazienti affetti da tumore del colon ID studio Studio pivotal EMD Studio di supporto IMCL CP Studio con prototipo EGFR IMCL CP Rapporto che esprime l'egfr (n. che esprime/n. analizzati) % positivi Intervalli di confidenza 95% 474/577 82,1% 78,1 86,1% 105/140 75,0% 66,9 83,1% 292/401 72,8% 68,0 77,6% ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 9/13

10 Studi clinici Panitumumab I dati sull'efficacia che supportano l'utilizzo del Panitumumab nella terapia dei pazienti affetti da tumore colorettale metastatico refrattario (mcrc) sono stati forniti da studi su pazienti i cui tumori risultavano positivi all'espressione di EGFR, come valutato dal saggio Dako EGFR pharmdx. Studio controllato randomizzato Panitumumab Questo studio multicentrico comparativo del Panitumumab, randomizzato, open-label ( , studio companion di estensione ) unito alla migliore terapia di supporto (BSC) in contrapposizione con la BSC da sola, ha arruolato pazienti affetti da mcrc che non sono riusciti a seguire i programmi di chemioterapia contenente oxaliplatina e irinotecan e i cui tumori esprimevano una colorazione EGFR della membrana in 1% delle cellule tumorali valutate. In entrambi i gruppi di terapia, la percentuale media delle cellule tumorali con colorazione EGFR positiva della membrana era 20% (intervallo: dall'1% al 100%). Nello studio è stato osservato un miglioramento statisticamente significativo nel punto finale primario della sopravvivenza libera da progressione (PFS) per il Panitumumab associato al gruppo BSC confrontato con il gruppo di BSC da sola (p < 0,0001, test log-rank stratificato). In questo studio controllato randomizzato, la percentuale di risposta era dell'8,3% (19/229, 95% CI: 5,1%, 12,6%) e definita come risposta completa o parziale (criteri RECIST modificati), con una durata confermata di almeno 4 settimane. La percentuale di risposta corrispondente nei 174 pazienti che sono passati dalla BSC al Panitumumab nello studio companion di estensione era 9,8% (17/174, 95% CI: 5,8%,15,2%). Non esisteva alcuna correlazione tra gli effetti della terapia su PFS e la percentuale di colorazione EGFR della membrana tumorale o di intensità di colorazione EGFR. (Vedere la Tabella 5 sotto riportata). Tabella 5: Effetti della terapia su sopravvivenza libera da progressione con colorazione EGFR Studio N. pazienti/ eventi Rapporto pericolo a Intervallo di confidenza 95% per rapporto pericolo Completamente randomizzato 463 / 401 0,54 (0,44, 0,66) <0,0001 % di colorazione EGFR della membrana b 1-<10% 114 / 91 0,46 (0,30, 0,71) 0, % 182 / 157 0,55 (0,40, 0,76) 0,0004 >35% 164 / 150 0,56 (0,40, 0,78) 0,0007 Intensità massima della colorazione EGFR della membrana c a / 113 0,61 (0,41, 0,90) 0, / 206 0,49 (0,37, 0,65) <0, / 80 0,61 (0,39, 0,97) 0,0379 valore p I rapporti di pericolo per Panitumumab più la BSC rispetto alla BSC da sola sono stati valutati da un modello di Cox relativo ai pericoli proporzionali, regolato per il punteggio prestazionale ECOG e la regione geografica. Un valore < 1,0 indica una percentuale media di evento inferiore e un tempo maggiore per l'evento per Panitumumab più BSC rispetto alla BSC da sola. b esclusi 3 pazienti i cui tumori esprimevano una colorazione EGFR della membrana < 1% (violazioni del protocollo) c esclusi 2 pazienti i cui tumori esprimevano una colorazione EGFR della membrana < 1% e una colorazione EGFR della membrana a intensità massima < 1+ (violazioni del protocollo) Tabella 6: Riepilogo della percentuale di espressione di EGFR nei pazienti affetti da tumore del colon Studio pivotal ID studio Rapporto espressione EGFR (n. con espressione/n. testati) % espressione EGFR Intervalli di confidenza 95% 735/ ,2% 70,4 75,9% Riproducibilità Riproducibilità tra serie La riproducibilità tra serie è stata analizzata con una metodologia manuale presso due laboratori, in ognuno dei quali due tecnici hanno lavorato per 3 giorni su 5 campioni diversi (4 positivi, 1 negativo in ogni laboratorio), con valori di intensità della colorazione diversi, randomizzati e mascherati. La riproducibilità dei risultati positivi all'egfr rispetto a quelli negativi all'egfr è stata ottima (100%): 0 rispetto a 1+, 2+ e 3+. Per quanto concerne l intensità della colorazione, è stata registrata una variazione di 1+ in due dei campioni positivi e di 2+ in uno dei campioni (in uno dei test, gran parte dell elemento di tessuto positivo era stata lavata via dal vetrino). I due campioni negativi si sono confermati negativi. ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 10/13

11 Riproducibilità della colorazione tra laboratori La riproducibilità tra laboratori è stata analizzata presso tre laboratori geograficamente distinti, con 30 campioni randomizzati e mascherati caratterizzati da valori di intensità della colorazione IHC diversi. I vetrini appena tagliati sono stati inviati a tutti i laboratori scelti per il test, affinché venissero sottoposti a colorazione manuale e automatizzata e valutati da un patologo. La percentuale di concordanza tra i laboratori è risultata del 100% per una determinazione dicotoma positiva/negativa, dove 0 corrispondeva a un valore negativo, mentre 1+, 2+ e 3+ corrispondevano a valori positivi relativamente all espressione della proteina EGFR nelle procedure di analisi sia manuali sia automatiche. Immunoreattività La Tabella 7 mostra un quadro riepilogativo dell immunoreattività dell EGFR pharmdx sul gruppo di tessuti normali consigliato. Tutti i tessuti erano stati fissati in formalina e inclusi in paraffina. Tabella 7. Valutazione della colorazione del tessuto normale con EGFR pharmdx* Tipo di tessuto (campioni testati) Surrene (2) Midollo osseo (3) Mammella (2) Cervelletto, cerebellum (3) Cervello, cerebrum (3) Cervice (3) Colon (3) Esofago (2) Cuore (3) Rene (3) Fegato (3) Polmone (3) Cellule mesoteliali (3) Ovaio (3) Pancreas (3) Paratiroide (1) Nervo periferico (3) Ipofisi (3) Prostata (3) Ghiandola salivare (3) Muscolo scheletrico (3) Cute (3) Intestino tenue (3) Milza (3) Stomaco (3) Testicolo (3) Timo (3) Tiroide (3) Tonsilla (3) Utero (3) Colorazione positiva all'egfr dell'elemento tissutale e pattern di colorazione Cellule corticali (2+): citoplasma Cellule epiteliali lobulari (2+): membrana e citoplasma Strato molecolare (1+): extracellulare Cellule dell epitelio squamoso basale (2+): membrana ** Cellule dell epitelio squamoso basale (2+): membrana Tubuli (1+): colorazione citoplasmatica (granulare) Epatociti (sinusoidi) (3+); Dotti biliari (3+): membrana e citoplasma Cellule del rivestimento alveolare/cellule bronchiali basali (cellule mioepiteliali) (2+): membrana e citoplasma Cellule mesoteliali (2+): membrana e citoplasma Dotti (2+): membrana Processi cellulari nervosi (1+): fibroso Cellule dell epitelio ghiandolare (2+): membrana Elementi duttali (1+): citoplasma Cellule squamose, strutture degli annessi (2+): membrana e citoplasma Epitelio squamoso (3+): membrana e citoplasma Epitelio delle ghiandole endometriali (2+): membrana e citoplasma Cellule stromali endometriali (2+): membrana e citoplasma Miometrio: nessuna *La maggior parte dei tessuti analizzati ha prodotto una colorazione dei fibroblasti nel tessuto stromale (1+, fibroso) nonché delle cellule perinevrali e mioepiteliali. In alcuni casi è stata osservata una colorazione endogena degli eosinofili indotta dalla perossidasi. **È stata osservata una immunocolorazione variabile dell epitelio del colon normale. ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 11/13

12 Risoluzione dei problemi Tabella 8. Risoluzione dei problemi Problema Probabile causa Intervento consigliato 1. colorazione dei vetrini. 2. Colorazione debole dei vetrini. 3. Eccessiva colorazione di fondo dei vetrini. 4. Il tessuto si stacca dai vetrini. 5. Colorazione specifica troppo intensa. 6. Colorazione debole della linea cellulare del vetrino di controllo Sovradigestione del tessuto. 1a. I reagenti non sono stati utilizzati nell ordine corretto. 1b. Sodio azide nel bagno tampone. 2a. Digestione proteolitica dell enzima Proteinase K insufficiente. 2b. Le sezioni trattengono troppa soluzione dopo il bagno di lavaggio. 2c. I vetrini non sono stati incubati sufficientemente a lungo con gli anticorpi o con la soluzione substrato-cromogeno DAB+. 2d. È stato utilizzato un metodo di fissazione inadeguato. 3a. Paraffina parzialmente rimossa. 3b. Sono stati utilizzati additivi amidacei nel montaggio delle sezioni sui vetrini. 3c. Vetrini risciacquati male. 3d. Le sezioni si sono asciugate durante la procedura di colorazione. 3e. Legame aspecifico dei reagenti con la sezione di tessuto. 1a. Rivedere l applicazione dei reagenti. 1b. Utilizzare il tampone fresco, privo di azide, fornito nel kit. 2a. Verificare che la soluzione Proteinase K sia incubata per 5 minuti completi. 2b. Eliminare la soluzione in eccesso picchiettando delicatamente prima di asciugare attorno alla sezione. 2c. Rivedere i tempi di incubazione consigliati. 2d. Controllare che il tessuto del paziente non sia fissato troppo e che il fissativo utilizzato sia quello giusto (vedere Preparazione dei campioni). 3a. Utilizzare soluzioni detergenti fresche e seguire la procedura descritta nella sezione Deparaffinazione e reidratazione. 3b. Evitare l uso di qualsiasi additivo per fare aderire le sezioni ai vetrini. Molti di questi additivi sono immunoreattivi. 3c. Utilizzare soluzioni fresche in bagni tampone e spruzzette. 3d. Utilizzare la camera umidificata. Controllare che sui vetrini venga applicato il volume di reagente corretto. Asciugare solo 3 o 4 vetrini per volta prima di applicare il reagente. 3e. Controllare che il campione sia fissato correttamente e/o verificare la presenza di necrosi. 4a. Uso di vetrini sbagliati. 4a. Utilizzare vetrini a carica positiva (Fisher SuperFrost Plus) o vetrini silanizzati (Dako Silanized Slides, codice S3003). 5a. È stato utilizzato un metodo di fissazione inadeguato. 5b. I tempi di incubazione del reagente sono eccessivi. 5c. È stata utilizzata una soluzione di lavaggio inadeguata. 6a. Digestione proteolitica dell enzima Proteinase K insufficiente. 6b. I vetrini non sono stati incubati sufficientemente a lungo con gli anticorpi o con la soluzione substrato-cromogeno DAB+. 6c. Degradazione del vetrino di controllo. 7a. Sovraincubazione con Proteinase K. 7b. Fissazione insufficiente. 5a. Assicurarsi di utilizzare solo i fissativi e i metodi di fissazione approvati (vedere Preparazione dei campioni). 5b. Rivedere le istruzioni del protocollo di colorazione. 5c. Utilizzare solo il tampone di lavaggio diluito che è fornito con il kit. 6a. Verificare che la soluzione Proteinase K sia incubata per 5 minuti completi. 6b. Rivedere i tempi di incubazione consigliati. 6c. Controllare la data di scadenza e le condizioni per la conservazione del kit stampate sull etichetta della confezione. 7a. Verificare che la soluzione Proteinase K sia incubata per non più di 5 minuti. 7b. Leggere la procedura di post-fissazione descritta nel protocollo di colorazione, applicarla a vetrini nuovi ed eseguire la colorazione secondo la procedura esistente. Nota: fare riferimento alla sezione Troubleshooting del manuale Dako Handbook: Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition, 16 the Atlas of Immunohistology, 23 or Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 20 Contattare l assistenza tecnica Dako per riferire di eventuali colorazioni insolite. ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 12/13

13 Bibliografia 1. Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. J Biol Chem 1990; 265: Riese DJ, Stern DF. Specificity within the EGF family/erbb receptor family signaling network. Bioessays 1998; 20:41 3. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, Seeburg PH, Libermann TA, Schlessinger J, Francke U, Levinson A, Ullrich A. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985; 230: Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, Saito T, Toyoshima K. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986; 319: Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, Ullrich A, Coussens L. The neu gene: An erbbhomologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985; 229: Gusterson B, Cowley G, Smith JA, Ozanne B. Cellular localization of human epidermal growth factor receptor. Cell Biol Intl Rpts 1984; 8(8): Gullick WJ. Prevalence of aberrant expression of the epidermal growth factor receptor in human cancers. Br Med Bull 1991; 47(1):87 8. Sainsbury JRC, Farndon JR, Sherbet GV, Harris AL. Epidermal-growth-factor receptors and oestrogen receptors in human breast cancer. Lancet 1985; 1(8425): Ozanne B, Richards CS, Hendler F, Burns D, Gusterson B. Over-expression of the EGF receptor is a hallmark of squamous cell carcinomas. J Pathol 1986; 149:9 10. Werner MH, Nanney LB, Stoscheck CM, King LE. Localization of immunoreactive epidermal growth factor receptors in human nervous system. J Histochem Cytochem 1988; 36: Pii K, Andersen FG, Jensen S, Spaulding B. Characterization of a new monoclonal antibody, clone 2-18C9, for the measurement of Epidermal Growth Factor Receptor expression in solid tumors. Am Assoc Canc Res 95 th annual meeting, Abst #5029 Orlando, Fl Mar Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co Atkins D, Reiffen KA, Tegtmeier CL, Winther H, Bonato MS and Störkel S. Immunohistochemical detection of EGFR in paraffinembedded tumor tissues: Variation in staining intensity due to choice of fixative and storage time of tissue sections. J Histochem Cytochem 2004; 52: Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, CLSI (formerly NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards). Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved guideline. Villanova, PA Order code M29-A2 19. CLSI (formerly NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. Villanova, PA Order code MM4-A. 20. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special report: quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech Histochem 1991; 66: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immuno-histology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986; Goldstein NS, Armin M. Epidermal growth factor receptor immunohistochemical reactivity in patients with American Joint Committee on Cancer Stage IV colon adenocarcinoma: implications for a standardized scoring system. Cancer 2001; 92: Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1980; 73: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: Potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994; 54:2771 ( ) P04035IT_01/K1492/ p. 13/13