I. cellula n Capitolo : PartE

Transcript

1 I. cellula n Capitolo : PartE II principali tipi di tessuto 3. Sangue, emopoiesi e midollo osseo Tessuti connettivi Tessuti epiteliali Tessuti muscolari Tessuto nervoso YOUNG_ch _0064.indd 45 22/07/14 13:40

2 Tipi cellulari e metodiche istologiche 3 Introduzione Sangue, emopoiesi e midollo osseo Il sangue è una sospensione di cellule in un fluido. Viene pompato nei vasi sanguigni attraverso il corpo dal cuore e, come risultato della sua circolazione, il sangue serve come mezzo di trasporto per i gas, i nutrienti, i prodotti di scarto del metaolismo, le cellule e gli ormoni. La componente fluida è nota come plasma ed è tipicamente composta per il 90% di acqua, l 8% di proteine, l 1% di sali inorganici, lo 0,5% di lipidi e lo 0,1% di glucosio; il resto sono componenti minori. Le proteine sono numerose e di diverso tipo, tra cui alumina, fattori della coagulazione sanguigna, anti-proteasi, proteine di trasporto e anticorpi (immunoglouline). Complessivamente queste proteine esercitano un effetto di trattenimento dell acqua, noto come pressione colloidoosmotica, che aiuta a regolare la distriuzione dei fluidi tra il plasma e lo spazio extracellulare, allo scopo di mantenere il fluido all interno del letto circolatorio. I componenti del plasma, inclusi ormoni, lipidi, sali minerali, molecole d acqua e piccole proteine, sono costantemente scamiate con il fluido extracellulare dei tessuti corporei, in accordo alle funzioni di trasporto del sangue. Le proteine e il plasma non possono essere visualizzati in microscopia ottica se non come una colorazione di fondo. Tipi cellulari del sangue Le componenti cellulari del sangue sono: Glouli rossi (eritrociti): sono cellule specializzate che contengono il pigmento rosso emogloina. Garantiscono gran parte del trasporto di ossigeno dai polmoni ai tessuti e gran parte dello scamio di anidride caronica. Sono cellule incapaci di muoversi autonomamente e assolvono ai loro compiti solo in quanto fatti circolare passivamente all interno dell alero vascolare. La frazione (in volume) di sangue occupata dagli eritrociti è detta ematocrito ed è compresa tra il 35 e il 50% negli adulti. Glouli ianchi (leucociti): costituiscono una parte importante dei meccanismi di difesa innata e del sistema immunitario dell organismo, ma svolgono queste funzioni principalmente nei tessuti; i leucociti nel sangue circolante sono in transito o semplicemente in attesa come riserve. Piastrine (tromociti): sono corpuscoli specializzati che si legano e rivestono le pareti vascolari danneggiate, tamponano piccole lesioni delle pareti dei vasi e attivano la cascata della coagulazione. Sono essenziali per l emostasi, il sistema che limita il sanguinamento. Nell adulto tutte queste cellule sono formate nel midollo osseo attraverso un processo noto come emopoiesi o ematopoiesi. Metodiche istologiche per lo studio del sangue e del midollo osseo Oggi la composizione cellulare del sangue è usualmente valutata con specializzati strumenti di laoratorio. La morfologia delle cellule è analizzata al microscopio usando metodi citologici. Un metodo comune è lo striscio di sangue, ottenuto spandendo con un vetrino copri-oggetto una goccia di sangue posta al ordo di un vetrino porta-oggetto, in maniera tale da ottenere un sottile film monocellulare. Questo striscio è quindi essiccato all aria, il che permette alle cellule di allargarsi come uova fritte, facendo sì che appaiano più grandi e consentendo una chiara visione del citoplasma assottigliato. Gli strisci vengono fissati con alcoli e colorati con metodi simili al Romanowsky, ossia con metodi che impiegano coloranti policromatici contenenti molteplici varianti molecolari così da ottenere sfumature complesse. Questi sono i coloranti migliori per evidenziare la morfologia delle cellule del sangue e del midollo osseo; esempi comuni sono il metodo di Giemsa e il metodo di Wright. Le caratteristiche distintive di colorazione sono facilmente identificaili e riflettono l affinità dei diversi organelli cellulari per le differenti componenti del colorante: Basofilia (lu scuro): affinità per il colorante asico lu di metilene; questa è una caratteristica del DNA nel nucleo e dell RNA nel citoplasma, contenuto principalmente nei riosomi. Azzurrofilia (violetto): affinità per coloranti azzurri; questa proprietà è tipica dei lisosomi, uno dei tipi di granuli presenti nei leucociti. Eosinofilia (rosa/rosso): affinità per il colorante acido eosina, perciò descritta anche come acidofilia. Neutrofilia (rosa salmone/lilla): affinità per un colorante un tempo ritenuto erroneamente essere a ph neutro; è caratteristica dei granuli citoplasmatici specifici dei granulociti neutrofili. L esame del midollo osseo emopoietico negli adulti richiede un campionamento prelevato dallo scheletro assiale, generalmente la cresta iliaca della pelvi, costituito da un aspirato midollare o un cilindro osseo. Campioni di aspirato, ma in genere non cilindri ossei, possono essere ottenuti anche dallo sterno. I frammenti di tessuto aspirato sono strisciati e colorati come fossero sangue. Le porzioni di tessuto più grandi e i cilindri ossei sono invece esaminati come preparazioni istologiche, spesso colorate con ematossilina ed eosina (EE). Uso clinico dei test ematologici 46 Le analisi di laoratorio delle varie componenti del sangue, incluse cellule, sali, proteine varie, ormoni e altro, rappresentano una maniera conveniente (e spesso l unica maniera) di esaminare varie funzioni dell organismo. Gli esami del sangue hanno un ruolo importante nella diagnosi e nel trattamento delle malattie. Per esempio, un aumento di enzimi nel sangue, fuoriusciti da cellule muscolari cardiache danneggiate, può diagnosticare un infarto del miocardio. YOUNG_ch _0064.indd 46 22/07/14 13:40

3 Leucociti Nella circolazione sono normalmente presenti cinque tipi di leucociti, a loro volta classificati in due gruppi: Granulociti [(o polimorfonucleati); N.d.C.] Neutrofili Eosinofili Basofili Leucociti mononucleati Linfociti Monociti Granulociti I granulociti sono così chiamati per la presenza di numerosi e caratteristici granuli citoplasmatici. A seconda della colorazione dei granuli predominanti si distinguono in: neutrofili (lilla), eosinofili (rossi) e asofili (lu). I granulociti hanno un nucleo segmentato in più loi che assumono forme variaili, da qui il nome alternativo di leucociti polimorfonucleati o polimorfi. Il termine polimorfonucleato è specialmente usato per indicare i neutrofili, poiché essi sono i più comuni tra i granulociti. I granulociti fanno parte delle cellule mieloidi in quanto originano dal midollo. I granulociti sono componenti importanti delle difese innate contro le infezioni (vedi Cap. 11); tuttavia essi svolgono spesso questo ruolo nei tessuti e non nel sangue. Tutti i leucociti hanno proteine di superficie che si legano a recettori delle cellule endoteliali dei vasi sanguigni (vedi Cap. 8) e, grazie a questo legame, i granulociti aderiscono alle pareti del vaso e migrano all interno dei tessuti mediante movimenti pseudopodiali. A eccezione degli eosinofili, che migrano nella mucosa intestinale, i granulociti non migrano nei tessuti normalmente ma solo in risposta a segnali chemiotattici e a seguito di camiamenti dell espressione di recettori di superficie delle cellule endoteliali indotti da mediatori dell infiammazione acuta. I neutrofili sono dotati di intensa attività fagocitaria. Essi ingloano e uccidono i microrganismi e ingeriscono detriti cellulari e materiale particolato; rilasciano quindi vari importanti segnali pro-infiammatori e regolatori che contriuiscono gloalmente al processo infiammatorio. I granulociti hanno una vita reve ed esauriscono la loro funzione in un solo ciclo difensivo; una volta lasciata la circolazione, muoiono nei tessuti e non ritornano nel circolo sanguigno. Linfociti e monociti I linfociti e i monociti hanno nuclei non loulati e furono quindi inizialmente descritti come leucociti mononucleati per distinguerli dai polimorfonucleati. I linfociti giocano un ruolo chiave in tutte le risposte immunitarie e facilitano e regolano l infiammazione. A differenza degli altri leucociti, la loro attività è diretta verso specifici agenti estranei (antigeni), garantendo una risposta adattativa e specifica, sia anticorpale sia cellulo-mediata. Di norma, i linfociti migrano attraverso i tessuti, poi confluiscono nei vasi linfatici e nei linfonodi, e infine ritornano nella circolazione sanguigna fornendo così una sorveglianza contro antigeni esterni. Essi hanno una vita media prolungata e sono capaci di proliferare. I monociti sono cellule dotate di intensa attività fagocitaria, ingerendo microrganismi, detriti cellulari e materiale particolato. Normalmente migrano in alcuni tipi di tessuto e possono maturare in macrofagi, diventando macrofagi tissutali residenti che hanno una sopravvivenza prolungata. I monociti e le cellule linfoidi producono, secernono ed esprimono recettori per un gran numero di mediatori dell infiammazione. II. Principali tipi di tessuto n Capitolo 3: Sangue, emopoiesi e midollo osseo Conta dei leucociti I leucociti nel sangue rappresentano una popolazione di riserva a disposizione per intervenire nei tessuti sede di infiammazione. In risposta alla stimolazione da parte di chemiotassine e attraverso il legame a recettori per i leucociti esposti sulla superficie delle cellule endoteliali (le cellule che rivestono i vasi sanguigni), i leucociti fuoriescono dal torrente circolatorio e prendono parte a processi infiammatori nei tessuti. Ci si potree aspettare che, a seguito di ciò, il loro numero nel sangue diminuisca; tuttavia, un gran numero di granulociti maturi resta a disposizione rimanendo adeso alla superficie dei piccoli vasi. Essi formano una riserva funzionale che non viene inclusa nella conta dei leucociti circolanti, ma rapidamente moilizzata dai segnali infiammatori delle chemiotassine e delle citochine. Gli stessi segnali chimici stimolano l immissione in circolo di cellule mature e quasi mature dal midollo osseo, fornendo un ulteriore riserva funzionale. Questi segnali stimolano anche una più rapida maturazione dei granulociti immaturi nel midollo, che formano ancora un altra riserva, e stimolano un aumento di produzione cellulare dal midollo a partire dalle cellule staminali; questo è tuttavia un processo più lento. In gran parte degli stati infiammatori e infettivi la conta dei granulociti nel sangue è aumentata. Tra gli esempi possiamo includere: Un aumento della conta dei neutrofili (neutrofilia) è indice d infiammazione acuta, di solito susseguente a infezioni atteriche. Un aumento degli eosinofili (eosinofilia) è associato ad allergie e a infezioni parassitarie. Un alta conta di linfociti (linfocitosi) si riscontra nelle infezioni virali. Una diminuzione transitoria dei neutrofili nel sangue (neutropenia) può essere causata dalle citochine prodotte nelle prime fasi di un infezione virale. Una diminuzione sostenuta nel tempo del numero di cellule della serie ianca (citopenia) implica invece che la richiesta sia più alta della produzione. Ciò può essere dovuto a un aumentato consumo oppure a un insufficiente produzione midollare. Nel caso di infezioni a sviluppo molto rapido e grave, la conta delle cellule del sangue può diminuire poiché le riserve di granulociti vengono esaurite prima che un incremento della loro produzione possa rimpiazzarle. In questi casi può accadere che precursori granulocitari immaturi, quali cellule a anda, metamielociti e mielociti (Fig. 3.8), vengano moilizzati e immessi in circolo. Questo è un fenomeno chiamato left shift [ossia, spostamento a sinistra della formula di Arneth. La formula di Arneth esprime la percentuale delle loature nucleari dei granulociti; in particolare, si usa rappresentarla in un grafico, riportando sull asse delle ascisse il numero dei loi e sull asse delle ordinate la percentuale di cellule corrispondenti. Si parla di deviazione a destra quando aumenta la percentuale dei granulociti con nucleo molto loato; si tratta in genere di elementi maturi/vecchi, prossimi alla loro eliminazione dal circolo. Si ha deviazione a sinistra quando aumentano i granulociti con nucleo poco loato; questi sono elementi giovani/immaturi. N.d.C.]. Una assa conta dei neutrofili (neutropenia) può essere evidenziata nel caso di sepsi grave, specialmente quando si osserva spostamento a sinistra della formula di Arneth. Patologie maligne e premaligne dei precursori leucocitari possono portare alla circolazione di un gran numero di cellule anomale (leucemia) oppure, a causa di un interrotta produzione di cellule normali, possono condurre a citopenia. 47 YOUNG_ch _0064.indd 47 22/07/14 13:40

4 Emopoiesi Emopoiesi L emopoiesi è il processo mediante il quale si generano le cellule ematiche mature a partire dai rispettivi precursori. Questo è un processo che impegna considerevolmente l organismo, considerando che un uomo adulto produce (cioè cento miliardi) di granulociti ogni giorno. All origine di questo processo vi sono le cellule staminali emopoietiche [da cui originano i vari tipi di progenitori e, a loro volta, da questi originano in gran quantità le cellule mature o differenziate. N.d.C.]. Le cellule staminali costituiscono una riserva che dura per tutta la vita dell individuo poiché la loro popolazione si automantiene (per autorinnovamento) mentre contriuisce alla produzione dei progenitori. [Le cellule staminali sono molto rare nel midollo osseo e sono in maggioranza in uno stato quiescente, che ha la funzione di proteggere il loro genoma dai danni dovuti al metaolismo e alla divisione cellulare. N.d.C.]. Una frazione di queste cellule prolifera e origina i progenitori emopoietici, che hanno alta capacità proliferativa e che, inizialmente da multipotenti, diventano progressivamente indirizzati (committed) a originare uno dei diversi tipi di cellule mature. [Uno dei meccanismi che garantiscono il mantenimento della popolazione di cellule staminali per tutta la vita dell individuo è la divisione cellulare asimmetrica, in cui una cellula staminale produce una cellula staminale figlia identica a se stessa e un progenitore multipotente che darà origine alla progenie di cellule mature del sangue. In questo modo la popolazione di cellule staminali non si esaurisce, dando origine ai progenitori. Le cellule staminali possono però anche effettuare divisioni simmetriche, dando origine ciascuna a due cellule staminali e permettendo così l espansione della popolazione staminale nel corso dell accrescimento o in caso di aumentata richiesta emopoietica in particolari situazioni. N.d.C.]. Le cellule staminali emopoietiche sono generalmente studiate usando modelli di trapianto in animali, mentre i progenitori possono essere studiati con metodiche di coltura in laoratorio a reve e a lungo termine. Molti dei progenitori identificati sono stati denominati unità o cellule formanti colonie (colony-forming unit o colony-forming cell, CFU o CFC) oppure unità formanti colonie a rapida crescita (urst forming unit, BFU) e le molecole che stimolano questi processi sono chiamate fattori stimolanti le colonie (colony stimulating factors, CSF), riferendosi a questo tipo di saggio sperimentale. Altri fattori di regolazione dell emopoiesi sono denominati interleuchine, citochine o fattori di crescita, a seconda dei metodi che hanno portato alla loro identificazione. Le cellule staminali emopoietiche, i progenitori e gli elementi terminalmente differenziati dipendono tutti per la loro crescita, proliferazione e differenziamento da un microamiente complesso. Questo microamiente [(o nicchia); N.d.C.] è determinato da contatti tra tipi cellulari diversi, dalla segnalazione molecolare che passa attraverso tali interazioni e dalla secrezione locale di fattori di crescita. I rapporti tra cellule staminali e microamiente sono stati spesso descritti utilizzando l analogia del seme (la cellula staminale) che cresce nel suolo (il microamiente). Progenitori staminali multipotenti Cellule staminali emopoietiche Progenitori mieloidi comuni Progenitori linfoidi comuni BFU-EMeg CFU-GMEo Cellule NK Linfociti B Linfociti T BFU-Meg BFU-E CFU-GM CFU-Meg CFU-E CFU-M CFU-G CFU-Eo Megacariolasto Eritrolasto Monolasti Mielolasti Mielolasti Mielolasti Megacariocita Glouli rossi Monociti Neutrofili Eosinofili Basofili Piastrine Mastociti Macrofagi FIG. 3.1 Cellule staminali emopoietiche e progenitori Il disegno mostra la relazione tra cellule staminali e alcuni tipi di progenitori identificati nel processo dell emopoiesi. Progenitori staminali multipotenti (multipotent progenitors, MPP) danno origine alle cellule staminali emopoietiche (haematopoietic stem cells, HSC), che a loro volta si indirizzano verso la linea linfoide o mieloide, originando rispettivamente i progenitori linfoidi comuni (common lymphoid precursors, CLP) e i progenitori mieloidi comuni (common myeloid precursors CMP o progenitori eritro-megacariocito/monocito-granulocitari, CFU- GEMM). Da questi ultimi origina una gerarchia di progenitori con progressiva segregazione del potenziale differenziativo verso le diverse linee maturative, passando dai progenitori ipotenti eritro-megacariocitari (BFU-EMeg o MEP) e cominati granulocito-monocitari ed eosinofili (CFU-GMEo o GMP) e arrivando ai progenitori unipotenti per ciascuna linea differenziativa. I progenitori multi- e ipotenti producono una ricca progenie di cellule (centinaia di migliaia di cellule), mentre quelli unipotenti (CFU) danno origine a una progenie di cellule. Ogni lasto riconosciile in uno striscio di midollo osseo produce una media di 16 cellule differenziate. La linea di derivazione dei mastociti non è chiara, ma si pensa che origini precocemente da un progenitore mieloide multipotente. 48 BFU unità formanti colonie a rapida crescita CFU unità formanti colonie E eritroide EMeg eritro-megacariocitario Eo eosinofilo G granulocitario GM granulocito-monocitario GMEo granulocito-monocitario-eosinofilo M monocita Meg megacariocita YOUNG_ch _0064.indd 48 22/07/14 13:40

5 Principali fattori di crescita emopoietici L emopoiesi è regolata dai fattori di crescita e dal microamiente midollare. I fattori di crescita, con la possiile eccezione dell eritropoietina, sono multifunzionali. Un singolo fattore di crescita può influenzare progenitori a diversi stadi di maturazione, agire su più di una linea differenziativa e avere azioni diverse, quali la promozione della proliferazione e/o del differenziamento cellulare, la maturazione, l uscita delle cellule dal midollo e la loro sopravvivenza nei tessuti. Le diverse azioni di un fattore di crescita sono dovute allo stadio di sviluppo della cellula su cui agisce, al grado di differenziamento, alla dotazione di recettori di memrana e alla moltitudine di altri segnali che essa riceve contemporaneamente (Ta. 3.1). La cellula staminale emopoietica (HSC) è particolarmente sensiile al fattore delle cellule staminali (stem cell factor, SCF), alle angiopoietine e al ligando di Flt-3, mentre le cellule stromali di supporto nel microamiente sono sensiili all interleuchina 1 (IL-1) e al fattore di necrosi tumorale (tumor necrosis factor, TNF). Oltre a risiedere nelle nicchie midollari, le cellule staminali emopoietiche sono reperiili in piccola quantità nel sangue dove ricircolano periodicamente e attraverso cui si distriuiscono a occupare le diverse nicchie nel midollo osseo. Questo processo può essere stimolato indirettamente dal fattore stimolante le colonie granulocitarie (G-CSF) che ne favorisce il rilascio in circolo [(un fenomeno noto come moilizzazione, che è sfruttato in clinica per la raccolta di cellule staminali emopoietiche da donatore per l uso nei trapianti); N.d.C.]. Le cellule staminali circolanti migrano nei distretti che esprimono il fattore derivato dalle cellule stromali (stromal-derived factor-1, SDF-1), che è un prodotto del microamiente emopoietico. Altri importanti stimolatori gloali dell emopoiesi sono l interleuchina 3 (IL-3), il fattore stimolante le colonie granulocito-monocitarie (GM-CSF) e l SCF, che agiscono sulla maggioranza delle linee a diversi stadi di maturazione. La tromopoietina, prodotta dal rene e dal fegato, è importante per la produzione di megacariociti e piastrine e inoltre promuove le fasi iniziali della produzione di eritrociti. L eritropoietina, un ormone proteico prodotto principalmente dai reni, promuove soprattutto le ultime fasi della maturazione degli eritrociti (a partire dalle CFU-E) e, a maggiori concentrazioni, agisce anche sui progenitori eritroidi. Il G-CSF e il fattore stimolante le colonie monocitarie (M-CSF) agiscono rispettivamente sulla linea dei granulociti e dei monociti, mentre l interleuchina 5 (IL-5) stimola la produzione degli eosinofili. Le cellule staminali e i diversi tipi di progenitori non sono distinguiili morfologicamente al microscopio. Molte di esse assomigliano a grandi linfociti e sono identificaili solo in ase all espressione di specifiche cominazioni di molecole di superficie (marcatori di superficie cellulare). Le più precoci tra le cellule riconosciili in uno striscio di midollo osseo sono i lasti, come i mielolasti, i proeritrolasti, i monolasti ecc. Questi sono progenitori piuttosto tardivi, vicini a completare la proliferazione e il differenziamento. Una BFU-E impiega circa 7 giorni a originare un gran numero di CFU-E; ogni CFU-E impiega a sua volta circa 7 giorni per diventare una colonia di proeritrolasti riconosciili morfologicamente e ogni proeritrolasto formerà circa 16 eritrociti maturi in 6-7 giorni. Va notato che a un uomo adulto occorrono circa 2,5 miliardi di nuovi eritrociti per kg di peso corporeo al giorno. Molti dei fattori di crescita appena descritti sono ora disponiili [come molecole ricominanti. N.d.C.] e utilizzati in amito terapeutico. II. Principali tipi di tessuto n Capitolo 3: Sangue, emopoiesi e midollo osseo TABELLA 3.1 Principali fattori emopoietici Fattore Sigla Cellule ersaglio e azione iologica Fattore delle cellule staminali SCF Agisce sulle cellule staminali e su molti dei progenitori Fattore stimolante le colonie granulocito-monocitarie GM-CSF Agisce sulla maggior parte delle linee mieloidi Interleuchina 3 IL-3 Agisce sulla maggior parte delle linee cellulari Interleuchina 11 IL-11 Generazione dei megacariociti Interleuchina 5 IL-5 Generazione degli eosinofili Fattore stimolante le colonie granulocitarie G-CSF Generazione dei granulociti Fattore stimolante le colonie monocitarie M-CSF Generazione dei monociti Tromopoietina TPO Generazione dei megacariociti ed eritropoiesi Eritropoietina EPO Eritropoiesi Trapianto di midollo osseo Il trapianto di midollo osseo è in realtà un trapianto di cellule staminali emopoietiche con l oiettivo di generare un nuovo sistema emopoietico e, attraverso lo sviluppo dei linfociti, anche un nuovo sistema immunitario. Le cellule staminali sono raccolte come aspirati midollari non coagulati da varie sedi intraossee oppure come concentrati di leucociti raccolti dal sangue periferico dopo la moilizzazione delle cellule staminali con somministrazione di G-CSF. Prima di effettuare il trapianto, il sistema emopoietico originale del paziente viene eliminato mediante la somministrazione di farmaci citotossici e radioterapia. Il prelievo di midollo arricchito di cellule staminali viene quindi trasfuso e le cellule staminali si localizzano nel microamiente emopoietico dove proliferano e progressivamente rigenerano l emopoiesi e il sistema immunitario. Il donatore di cellule staminali per il trapianto può essere un altro individuo (in tal caso si parla di trapianto allogenico) oppure lo stesso individuo (trapianto autologo). Quando si impiega un trapianto allogenico è importante verificare la compatiilità HLA per minimizzare il rischio di reazione del trapianto verso l ospite (graft versus host disease, GVDH), una grave complicazione in cui le cellule immunitarie mature del donatore riconoscono il paziente come non-self e lo attaccano. Il trapianto di midollo osseo è impiegato per il trattamento di gravi deficit del sistema immunitario o emopoietico, come le immunodeficienze primarie e alcune emogloinopatie. Tra le altre condizioni citiamo l anemia aplastica, un deficit acquisito dell emopoiesi, e le leucemie. Il trapianto di midollo osseo è impiegato nelle leucemie poiché la somministrazione di chemioterapia ad alte dosi non elimina soltanto le cellule leucemiche, ma anche le cellule staminali sane del paziente. In alcuni di questi casi può essere impiegato il trapianto autologo, raccogliendo dal paziente le cellule staminali prima della somministrazione della chemioterapia e infondendole suito dopo, così da consentire la sopravvivenza a una dose elevata di farmaci mielotossici e permettere di somministrare una terapia antitumorale più efficace. 49 YOUNG_ch _0064.indd 49 22/07/14 13:40

6 Emopoiesi Ep Ep T Ap a Ap FIG. 3.2 Emopoiesi nel fegato e nel midollo osseo (a) EE (MP) () EE (LP) L emopoiesi inizia nelle prime fasi della vita intrauterina in una sede extraemrionaria, ossia nel mesoderma del sacco vitellino (emopoiesi primitiva) [e viene poi sostituita da quella definitiva, quando le prime cellule staminali emopoietiche originano dall endotelio emogenico dell aorta nella regione AGM (aorta-gonadi-mesonefro). N.d.C.]. Le cellule derivate dalla regione AGM si stailiscono poi nei sinusoidi epatici, che sono gli spazi vascolari tra gli epatociti Ep nell immagine (a), dove si distinguono numerose cellule emopoietiche colorate di scuro. Dal terzo al settimo mese di gestazione, questo è il principale sito di emopoiesi. Con lo sviluppo degli aozzi delle ossa, l emopoiesi si instaura negli spazi tra le traecole ossee T di ogni osso. Alla nascita, le ossa forniscono lo spazio sufficiente per accogliere tutto il tessuto emopoietico, ponendo così fine all emopoiesi extramidollare. Durante la crescita del amino, gli spazi midollari si espandono velocemente e così, progressivamente, il midollo viene occupato da adipociti Ap. Il midollo emopoietico è macroscopicamente di colore rosso, mentre il midollo in cui dominano gli adipociti è giallo. Nell adulto, gran parte del midollo delle ossa degli arti è giallo, mentre quello dello scheletro assiale resta rosso ed emopoietico, anche se il 30-60% del suo volume è occupato da adipociti. L immagine () mostra un midollo verterale adulto con un moderato numero di adipociti. Ap S E E S Ap Mk FIG. 3.3 Sinusoidi del midollo osseo EE (HP) Il midollo osseo ha un impalcatura di sinusoidi vascolari rivestiti da cellule endoteliali E e spazi chiamati cordoni midollari, supportati da una rete di firolasti con lunghi e ramificati processi citoplasmatici (detti cellule reticolari) e fire di reticolina (formate da collagene di tipo III). I macrofagi sono numerosi e anch essi possono presentare processi cellulari ramificati. Gli adipociti Ap e le plasmacellule sono presenti in numero significativo. Il risultato è un microamiente che supporta l emopoiesi, e infatti i cordoni midollari sono ricchi di cellule. I megacariociti Mk sono situati in prossimità dei sinusoidi S, cosicché i loro processi citoplasmatici (propiastrine) possano rilasciare questi corpuscoli direttamente in circolo. Anche le isole eritrolastiche si trovano in prossimità dei sinusoidi, dove i precursori eritroidi aderiscono ai lunghi processi citoplasmatici dei macrofagi che direzionano gli eritrociti verso i sinusoidi e ne regolano l immissione in circolo. I precursori mieloidi tendono a essere localizzati lontano dai sinusoidi, ma, poiché granulociti e monociti sono dotati di motilità, una volta mature, queste cellule possono migrare nei sinusoidi. 50 Ap adipocita E nucleo di una cellula endoteliale Ep epatocita Mk megacariocita S sinusoide T traecola ossea YOUNG_ch _0064.indd 50 22/07/14 13:40

7 a c d e FIG. 3.4 Eritropoiesi (a)-(e) Giemsa (HP) Queste immagini di uno striscio di sangue midollare illustrano i vari stadi dell eritropoiesi [nell aspirato midollare usato per gli strisci si trovano sia le cellule ai diversi stadi di differenziamento contenute nei cordoni midollari sia le cellule mature contenute nel sangue dei sinusoidi. N.d.C.]. Questo processo differenziativo prevede: Una progressiva riduzione delle dimensioni del citoplasma e del suo contenuto di organelli, ottenuta attraverso divisioni cellulari che riducono progressivamente il contenuto citoplasmatico nelle prime fasi del processo. L inattivazione e l estrusione del nucleo. La progressiva sintesi di emogloina da parte dei riosomi e il suo accumulo. Il proeritrolasto, mostrato nell immagine (a), è il primo precursore eritroide riconosciile; si tratta di una cellula di dimensioni relativamente grandi con cromatina fine e granulare, contenente uno o più nucleoli chiari. Il citoplasma poco strutturato è spiccatamente asofilo a causa del suo alto contenuto in RNA e riosomi. Una sottile zona di citoplasma più chiaro presente vicino al nucleo corrisponde all apparato di Golgi. I proeritrolasti si dividono e si differenziano, producendo cellule più piccole chiamate eritrolasti asofili o normolasti precoci, mostrati nella fotografia (). Si tratta di cellule di piccole dimensioni dove sono talvolta visiili addensamenti della cromatina. Nello stadio successivo di differenziamento si formano gli eritrolasti policromatici (o normolasti intermedi). In queste cellule il citoplasma sviluppa una colorazione grigiastra dovuta all aumento dell emogloina. Dal momento che sussiste una commistione di asofilia ed eosinofilia, il termine impiegato per descrivere questo aspetto è policromasia. La cromatina nucleare diviene sempre più condensata. Queste cellule non sono più capaci di ulteriori divisioni mitotiche. L immagine (c) mostra eritrolasti policromatici in uno stadio precoce, mentre l immagine (d) mostra eritrolasti policromatici in uno stadio avanzato di maturazione. L ultima forma ancora nucleata, mostrata in figura (e), è l eritrolasto ortocromatico (o normolasto tardivo). Il suo citoplasma è ricco in emogloina ma contiene ancora riosomi che mantengono la sintesi di emoglolina. Gli organelli citoplasmatici sono degenerati. La cromatina nucleare e il nucleo diventano estremamente condensati fino ad arrivare all estrusione del nucleo. Il risultato è una cellula eritroide anucleata, il reticolocita (Fig. 3.5). Il processo di condensazione ed estrusione del nucleo può essere incompleto, lasciando piccoli residui sferoidali di nucleo condensato nell eritrocita. Questi sono noti come corpi di Howell-Jolly e sono normalmente asportati dall eritrocita con la porzione di citoplasma e di memrana circostante dai macrofagi splenici e quindi non sono identificaili nel sangue. Tuttavia, in individui che aiano suito una splenectomia è normale trovare nello striscio di sangue alcuni eritrociti contenenti corpi di Howell-Jolly. Gli eritrociti condividono un progenitore comune con i megacariociti. Il fattore di crescita che stimola la proliferazione e il differenziamento del progenitore verso la produzione di glouli rossi è l eritropoietina, prodotta principalmente dai reni, ma nelle prime fasi del processo partecipano a questo processo anche la tromopoietina e alcune interleuchine. Nell architettura del midollo (e all osservazione di una sua sezione istologica), i precursori eritroidi sono raggruppati in piccoli gruppi sparsi, detti isole eritrolastiche. Ognuna di esse è organizzata attorno a un macrofago che presenta lunghi processi citoplasmatici e invaginazioni della memrana cellulare che accolgono i precursori. I precursori migrano lungo i processi citoplasmatici mentre maturano, raggiungendo così l endotelio dei sinusoidi attraverso cui entrano nella circolazione. Questi macrofagi supportano il differenziamento attraverso contatti cellula-cellula e trasduzione di segnali intracellulari, e controllano il rilascio degli eritrociti maturi nel sangue sinusoidale. Ogni proeritrolasto in genere dà origine a 16 eritrociti in un tempo che varia tra 5 e 7 giorni. In ognuna delle fotografie degli strisci, si vedono numerosi eritrociti maturi, caratterizzati dall assenza di nuclei e spesso da una zona più pallida al centro, dovuta alla forma iconcava della cellula. II. Principali tipi di tessuto n Capitolo 3: Sangue, emopoiesi e midollo osseo Anemia L anemia è una riduzione dell emogloina presente nel sangue al di sotto dei livelli di normalità. Una ridotta produzione di emogloina (e quindi di eritrociti) da parte del midollo può avvenire a causa di una carenza di nutrienti essenziali, quali ferro, vitamina B 12, vitamina B 9 (acido folico); oppure, a causa di un insufficienza midollare primaria, nota anche come anemia aplastica; oppure a causa di anomalie genetiche nel sistema di produzione degli eritrociti (per esempio, la talassemia). In altri tipi di anemie, gli eritrociti normalmente prodotti possono essere distrutti (anemia emolitica) a causa di diversi meccanismi, in genere mediati da autoanticorpi, oppure possono essere persi a causa di emorragie. 51 YOUNG_ch _0064.indd 51 22/07/14 13:40

8 Eritrociti G R M D M R D a E FIG. 3.5 Reticolociti (a) Blu di cresile/eosina (HP) () ME I reticolociti sono glouli rossi immaturi e corrispondono allo stadio in cui vengono rilasciati dal midollo osseo. Essi contengono ancora alcuni mitocondri, riosomi ed elementi di Golgi e continuano a sintetizzare emogloina. La tappa finale di maturazione a eritrociti avviene circa 48 ore dopo il rilascio. Il tasso di rilascio dei reticolociti nella circolazione, in genere, eguaglia il tasso di rimozione degli eritrociti senescenti da parte della milza e del fegato. Dal momento che la vita media degli eritrociti circolanti è di circa 120 giorni, i reticolociti costituiscono poco meno dell 1% degli eritrociti circolanti [il che garantisce il ricamio di quel poco meno di 1% di cellule ormai senescenti che ogni giorno viene rimosso. N.d.C.]. I reticolociti sono leggermente più grandi degli eritrociti maturi e la loro colorazione è deolmente asofila a causa della presenza residuale di riosomi e RNA. Un aumento dei reticolociti può essere sospettato all esame di uno striscio di sangue in ase a un aumentata e variaile asofilia delle cellule, un fenomeno chiamato policromasia (molti colori). Un identificazione e conta affidaile dei reticolociti richiede però tecniche specifiche, quali una colorazione sopravitale, mostrata nell immagine (a). Un campione di sangue fresco viene incuato con un colorante asico, il lu di cresile, che produce un precipitato reticolare R di colorazione lu, dovuto all interazione del colorante con l RNA dei poliriosomi. L identificazione e la conta dei reticolociti a uso diagnostico vengono oggi fatte con metodi automatici come la citometria a flusso. L immagine () mostra l organizzazione ultrastrutturale di un reticolocita e parte di un eritrocita maturo adiacente E, come paragone. La densità del citoplasma del reticolocita è complessivamente minore, dovuta a una più assa concentrazione di emogloina. Sono ancora visiili riosomi sparsi, accanto ad alcuni mitocondri M, occasionali mitocondri in degenerazione D e un piccolo residuo dell apparato di Golgi G. Quando si verifica una massiva perdita di eritrociti, per esempio a seguito di emorragia o emolisi, il tasso di produzione di eritrociti da parte del midollo aumenta e la proporzione di reticolociti nel sangue circolante si eleva (reticolocitosi). Dal punto di vista clinico, una conta di reticolociti elevata indica un midollo funzionale, mentre una conta assa può indicare una produzione insufficiente o compromessa. È utile considerare questo parametro quando si valuta uno stato di anemia. Il complesso dell anchirina Il supporto per i raggi Dimeri di spectrina I raggi Complesso 4.1 Antigeni Il perno che determinano il gruppo sanguigno Anchirina Giunzioni spectrina-spectrina Actina, tropomiosina FIG. 3.6 Citoscheletro dell eritrocita La memrana citoplasmatica dell eritrocita è composta da un doppio foglietto lipidico stailizzato dalla presenza di numerose proteine. Gli elementi caratterizzanti i diversi gruppi sanguigni sono caroidrati e antigeni proteici presenti sulla superficie. La spectrina è un grande dimero proteico con proprietà elastiche, che forma una rete a forma di cupola geodetica suito al di sotto della memrana plasmatica. Le molecole di spectrina si dispongono a raggiera a partire da un centro ancorato alla memrana e contenente, tra le altre, la proteina 4.1, l actina e la tropomiosina. Ogni raggio di questa struttura è ulteriormente supportato per tutta la sua lunghezza da un secondo complesso proteico contenente anchirina. All estremità più distale, i raggi di spectrina formano legami non covalenti spectrina-spectrina. Quando la memrana dell eritrocita si piega, le molecole di spectrina si allungano. Quando la deformazione diventa estrema, le giunzioni dimeriche spectrina-spectrina si separano, consentendo al centro e ai raggi di separarsi e riarrangiarsi, così da riassestare dinamicamente il citoscheletro. L actina fa parte di un segmento contrattile, che proailmente applica tensione alla spectrina. 52 D mitocondrio in degenerazione E eritrocita maturo FM eritrocita con forma a manurio G residui dell apparato di Golgi M mitocondrio P piastrina R precipitato reticolare in reticolocita YOUNG_ch _0064.indd 52 22/07/14 13:40

9 a FIG. 3.7 Eritrociti (a) Giemsa (HP) () ME a scansione 2400 (c) ME 6000 (d) EE (HP) L eritrocita è una cellula altamente specializzata per la sua principale funzione di trasporto dell ossigeno e dell anidride caronica. Esso consiste semplicemente in una memrana citoplasmatica supportata da un citoscheletro proteico e contenente un elevata concentrazione di molecole di emogloina e un numero limitato di enzimi per il mantenimento cellulare. L emogloina è una proteina contenente ferro che lega e rilascia l ossigeno e garantisce la maggior parte del trasporto di ossigeno nel sangue. [L emogloina contenuta nell eritrocita è in soluzione semisatura al 30%. Nei casi di diminuita soluilità dell emogloina (come nel caso dell anemia falciforme, causata da una mutazione della catena β dell emogloina), questa si aggrega e l eritrocita perde flessiilità e si deforma. N.d.C.]. La fotografia (a) mostra il caratteristico aspetto degli eritrociti in uno striscio di sangue periferico. La colorazione più chiara della regione centrale è dovuta alla forma a disco iconcavo, meglio visiile in microscopia elettronica a scansione nell immagine (). La forma a disco iconcavo garantisce una superficie del 20-30% maggiore rispetto a una cellula sferica dello stesso volume, facilitando così gli scami gassosi. Questa forma, assieme alla flessiilità del citoscheletro (Fig. 3.6), consente all eritrocita di deformarsi facilmente. Infatti, gli eritrociti che hanno un diametro medio di 7,2 µm sono capaci di comprimersi e attraversare capillari di diametro di 3-4 µm. La forma a disco iconcavo è determinata non soltanto dal citoscheletro, ma anche dal contenuto di elettroliti e acqua e dalla composizione lipidica della memrana. L immagine in microscopia elettronica a trasmissione (c) mostra gli eritrociti in un capillare. La classica forma a manurio FM è visiile quando il piano della sezione attraversa la sottile zona centrale al centro della cellula. Si notino l assenza di organelli interni e l alta densità agli elettroni dovuta agli atomi di ferro contenuti nell emogloina. Nell immagine è anche visiile una piastrina P. Gli eritrociti hanno un alta affinità per l eosina e appaiono intensamente colorati di arancio-rosso nelle immagini di tessuti in EE, come nella fotografia (d). Negli strisci di sangue la colorazione varia con il tipo di colorante di Romanowsky impiegato, ma è generalmente rosso-runastro, come in figura (a), oppure grigio. Il trasporto di ossigeno da parte dell emogloina non è dipendente dal metaolismo dell eritrocita; gli eritrociti, tuttavia, usano energia per mantenere i gradienti di elettroliti attraverso la memrana plasmatica, [contrastare la pressione osmotica dovuta all alto contenuto proteico. N.d.C.] e proteggersi dal danno ossidativo. L energia richiesta per questi processi deriva dal metaolismo anaeroico del glucosio, in quanto essi non posseggono mitocondri. c d FM P FM La vita media di un eritrocita è di 120 giorni. Essendo privi di organelli, gli eritrociti non sono in grado di ricamiare enzimi e proteine di memrana deteriorate né di riparare i danni. Allo stesso tempo, il metaolismo anaeroico garantisce all eritrocita una vita media relativamente lunga, poiché riduce la produzione di radicali ossidanti che danneggiano i componenti cellulari. Gli eritrociti deformati in modo irreversiile e quelli con un citoscheletro che aia perso flessiilità vengono rimossi dalla circolazione grazie all azione dei macrofagi nella milza e nel fegato. II. Principali tipi di tessuto n Capitolo 3: Sangue, emopoiesi e midollo osseo L esame del sangue aiuta a determinare le cause di anemia Nei casi di carenza di ferro, la produzione di emogloina è difettosa e gli eritrociti prodotti sono di piccola dimensione. Gli eritrociti con questo aspetto sono descritti come ipocromici e microcitici, il che significa, rispettivamente, che hanno una scarsa colorazione e una piccola dimensione delle cellule. Le vitamine B 12 e B 9 (acido folico) sono necessarie per la maturazione e la divisione nucleare. Nel caso di un deficit di queste vitamine, la maturazione del nucleo e le divisioni cellulari restano indietro rispetto allo sviluppo del citoplasma, dando origine a precursori eritroidi di notevoli dimensioni e con nuclei anormemente grandi e cromatina aperta rispetto allo stadio di maturazione citoplasmatica. Queste cellule sono dette megalolasti e il processo patologico che porta alla loro formazione viene definito anemia megalolastica. Gli eritrociti risultanti sono anch essi grandi e denominati macrociti. 53 YOUNG_ch _0064.indd 53 22/07/14 13:40

10 Granulopoiesi a c EO FIG. 3.8 Granulopoiesi (a)-(e) Giemsa (HP) Questa serie d immagini illustra i vari stadi del processo di differenziamento dei granulociti neutrofili. Gli stadi di sviluppo degli eosinofili e asofili sono simili. Il mielolasto (a) è lo stadio più precoce della granulopoiesi identificaile morfologicamente. Questo nome è tuttavia inappropriato e deriva dall erronea assunzione che i granulociti fossero l unico tipo di leucociti prodotto dal tessuto mieloide (ossia dal midollo osseo). I mielolasti sono cellule grandi con cromatina dispersa, vari nucleoli di grandi dimensioni e un citoplasma asofilo. Forme più differenziate di mielolasti (mielolasti II) presentano un piccolo numero di granuli primari azzurrofili (violacei). Nonostante la differenziazione finale di queste cellule a granulociti sia stata provata iologicamente, essa non è visiile fino allo stadio di mielocita, quando la produzione di granuli secondari (specifici) ne consente l identificazione. L immagine mostra anche un eritrolasto ortocromatico EO. I promielociti () sono lo stadio successivo di maturazione e hanno aondanti granuli primari azzurofili. Essi possono mostrare una leggera condensazione della cromatina all interno di una struttura cromatinica altrimenti dispersa. I mielociti (c) sono identificaili dalla comparsa di granuli secondari o specifici e da una progressiva condensazione della cromatina; tale processo continua per varie divisioni cellulari successive. Il numero e la proporzione di granuli primari diminuiscono progressivamente, diluiti dalle successive divisioni del citoplasma, mentre aumenta, di contro, la produzione dei granuli specifici. Il mielocita mostrato in figura è un mielocita neutrofilo, caratterizzato da citoplasma di colorazione rosa a causa della presenza di granuli secondari neutrofili. I mielociti eosinofili avreero invece granuli specifici eosinofili e così per i asofili. Il metamielocita (d) è una cellula terminalmente differenziata, incapace di ulteriori divisioni mitotiche. Esso inizia un processo di segmentazione nucleare, mostrando un nucleo progressivamente indentato e un citoplasma sempre più maturo. I precursori immediati dei granulociti maturi tendono ad avere un nucleo irregolare a ferro di cavallo e perciò sono detti forme a anda (e). I neutrofili immaturi vanno a far parte di un pool di riserva funzionale trattenuto nel midollo e corrispondente al prodotto di circa 5 giorni di attività midollare. Al momento dell immissione in circolo, circa metà di queste forme a anda entra a far parte della circolazione sanguigna, mentre il resto aderisce all endotelio dei piccoli vasi, formando il cosiddetto pool marginato. Questi pool constituiscono un importante riserva che può essere moilizzata all occorrenza (per esempio, in risposta a chemiotassine). Se la richiesta aumenta notevolmente, anche i mielociti e i metamielociti sono moilizzati in circolo e, da qui, nei tessuti; questo fenomeno è noto come left shift (silanciamento a sinistra, ovvero verso i precursori). Al contrario, il fenomeno di aumento delle forme mature è detto right shift (silanciamento a destra), ma non è comunemente osservaile. Il normale processo di sviluppo nel midollo dal mielolasto al mielocita impiega 6 giorni e dal mielocita al rilascio di un neutrofilo maturo nel sangue altri 7 giorni. La produzione è stimolata da una serie di fattori di crescita e citochine, inclusi G-CSF, GM-CSF, IL-3 e IL-5. d e 54 YOUNG_ch _0064.indd 54 22/07/14 13:40

11 a c d FIG. 3.9 Neutrofili (a) Giemsa (HP) () EE (HP) (c) EE (MP) (d) Giemsa (HP) MT II. Principali tipi di tessuto n Capitolo 3: Sangue, emopoiesi e midollo osseo I neutrofili rappresentano dal 40 al 60% dei leucociti circolanti nel sangue, con una concentrazione tra 1 e /L. Il loro diametro varia tra 12 e 14 µm. La vita media di un neutrofilo è di pochi giorni, e infatti queste cellule sono raramente visiili nei tessuti normali. Durante la maturazione i neutrofili mostrano una progressiva segmentazione del nucleo, con le cellule più giovani che hanno 2 loi, quelle intermedie da 3 a 4 loi e le cellule più mature 5 loi. Il citoplasma è rosa, granulare e leggermente puntinato a causa di numerosi piccoli granuli (di diametro da 0,2 a 0,8 µm) circondati da memrana, come nella fotografia (a). Questi granuli includono i granuli primari azzurrofili (violacei), i granuli secondari specifici, i granuli terziari e i granuli secretori. Nelle colorazioni di routine, i granulociti mostrano un citoplasma rosa o rosso chiaro, come nell immagine (). I neutrofili aandonano i vasi in risposta a stimoli chemiotattici generati dall infiammazione. Sono cellule ad alta motilità che fagocitano i atteri e li uccidono fondendo il fagosoma con i granuli primari e producendo radicali ossidanti. In alcune condizioni essi possono degranulare rilasciando all esterno il contenuto dei granuli ricco in mediatori dell infiammazione, enzimi antiatterici ed enzimi che degradano la matrice tissutale. Ammassi di neutrofili e oro detriti sono riconosciili nel pus, come mostrato nell immagine (c). [I neutrofili riconoscono la presenza di microrganismi e/o di danno tissutale attraverso recettori di memrana (pattern recognition receptor PRR, appartenenti alla famiglia dei recettori toll-like TLR) che legano alcuni tipi di molecole tipicamente prodotte da certe famiglie di patogeni (pathogen-associated molecular pattern, PAMP) o derivate da danno cellulare (damageassociated molecular pattern, DAMP). Se lo stimolo è elevato, il neutrofilo può espellere il proprio DNA che, grazie alla natura di polimero anionico viscoso, va a costituire la cosiddetta trappola extracellulare dei neutrofili (NET o rete) che intrappola i patogeni e contriuisce alla consistenza gelatinosa del pus. N.d.C.]. I neutrofili extravasati non rientrano nella circolazione sanguigna, ma vanno incontro a lisi o apoptosi nei tessuti. Nei neutrofili del sangue di individui di sesso femminile, il cromosoma X inattivato può essere visiile sotto forma di una piccola appendice nucleare a mazza di tamuro MT nel 3% circa dei neutrofili, come in immagine (d). [Questa appendice è nota anche come corpo di Barr. N.d.C.]. TABELLA 3.2 Prodotti funzionali dei granuli dei neutrofili Tipo di granuli Principali componenti attivi Azioni iologiche Granuli primari Granuli secondari specifici Granuli terziari Granuli secretori Mieloperossidasi Defensine dei neutrofili Lisozima, gelatinasi, collagenasi, lactoferrina, catelicidine, transcoalamina I Gelatinasi Molecole di adesione Proteine di memrana Enzimi, fosfatasi alcalina ecc. Distruzione e degradazione dei microrganismi fagocitati Sostanze antimicroiche e degradazione della matrice extracellulare Degradazione della matrice extracellulare Esposizione sulla memrana plasmatica Esposizione sulla memrana plasmatica; recettori per il legame alla memrana delle cellule endoteliali Degradazione dei tessuti EO eritrolasto ortocromatico MT appendice a mazza di tamuro 55 YOUNG_ch _0064.indd 55 22/07/14 13:40

12 Granulociti P N N S S P P FIG Neutrofilo ME In microscopia elettronica, i neutrofili presentano tre aspetti caratteristici. Il primo è rappresentato dai numerosi loi nucleari N, con cromatina condensata; questi loi appaiono separati nelle sezioni sottili in ME. Come secondo aspetto, il citoplasma contiene molti granuli rivestiti da memrana. I granuli primari P sono grandi, sferoidali ed elettrondensi. I granuli secondari o specifici S sono più numerosi e piccoli, hanno spesso forma di acchetta e sono di densità variaile. I granuli terziari e i granuli secretori non sono facilmente distinguiili da altre vescicole rivestite da memrana. Il terzo aspetto è che gli altri organelli citoplasmatici sono scarsi. In aggiunta, il citoplasma è particolarmente ricco in granuli di glicogeno dispersi. Il neutrofilo maturo ha pochi organelli deputati alla sintesi proteica e ha una capacità limitata di rigenerare le proteine secrete; esso tende a degenerare dopo una stimolazione che ne aia attivato fagocitosi e degranulazione. La scarsità di mitocondri e l aondanza di glicogeno nei neutrofili riflettono l importanza del metaolismo anaeroico. La produzione di energia via glicolisi permette ai neutrofili di funzionare anche nell amiente poco ossigenato di un tessuto danneggiato. I neutrofili sono dotati di alta motilità, capaci di attraversare gli spazi extracellulari con un movimento ameoide guidato da uno pseudopodio ondulante, generalmente proiettato in avanti a orientare la direzione del movimento. La motilità e l attività fagocitaria sono dimostrate dall alta presenza di proteine contrattili, actina e miosina, ma anche da tuulina e proteine associate ai microtuuli. Funzioni dei neutrofili I neutrofili circolanti sono attratti da fattori chemiotattici (chemiotassine) rilasciati dai tessuti danneggiati o generati dall interazione di anticorpi con gli antigeni di superficie dei microrganismi (vedi Cap. 11). Le chemiotassine stimolano i neutrofili e li inducono a fondere i granuli secretori con la memrana cellulare, così da esporre proteine di adesione che permettono al neutrofilo di aderire all endotelio vascolare e di iniziare a muoversi all interno dei tessuti. [Il processo di uscita dal vaso (extravasazione) inizia con il rotolamento (rolling) della cellula, mediato da lectine sulla memrana delle cellule endoteliali dei piccoli vasi attivati dall infiammazione, e prosegue con l arresto mediato dal legame alle caderine e l attraversamento della parete (diapedesi). Il riconoscimento di un microrganismo attraverso un TLR di memrana o degli anticorpi a esso legati stimola la fagocitosi da parte del neutrofilo. N.d.C.]. Come prima tappa della fagocitosi, il microrganismo è avvolto da pseudopodi che progressivamente si fondono tra loro, racchiudendolo in una vescicola endocitica detta fagosoma. Il fagosoma si fonde quindi con i granuli citoplasmatici, in particolare i granuli primari, che scaricano il loro contenuto esponendo il microrganismo a una potente miscela di proteine antimicroiche, in un amiente acido. L uccisione del microrganismo è favorita dalla generazione di perossido d idrogeno e anione superossido, prodotti dalla riduzione enzimatica dell ossigeno (urst ossidativo). L attività fagocitaria dei neutrofili (e dei monociti) è favorita dal rivestimento del microrganismo da parte di anticorpi ed elementi del complemento (opsonine). I neutrofili hanno recettori di superficie per la porzione Fc (costante) delle immunoglouline e per varie proteine del complemento. Questi recettori si legano alle opsonine e stimolano l internalizzazione mediante fagocitosi. Questo stimolo alla fagocitosi è noto come opsonizzazione. Se si verifica un sufficiente stimolo dei recettori del neutrofilo, esso può esocitare il contenuto dei suoi granuli per degranulazione, che si verifica attraverso la fusione della memrana dei granuli con la memrana citoplasmatica e l espulsione del contenuto. I granuli terziari sono i primi a essere rilasciati, seguiti dai granuli specifici (secondari) e, raramente, anche dai granuli primari. 56 N loo nucleare P granulo primario S granulo secondario YOUNG_ch _0064.indd 56 22/07/14 13:40

13 a FIG Basofili (a) Giemsa (HP) () ME I asofili, nell immagine (a), sono la forma di leucociti meno comune e rappresentano <0,5% dei leucociti del sangue. Hanno dimensioni intermedie (diametro µm) tra i neutrofili e gli eosinofili. Un asofilo maturo ha un nucleo iloato che però è spesso coperto da numerosi granuli specifici fortemente asofili (lu scuro), che sono più grandi ma in numero minore rispetto a quelli degli eosinofili. Il contenuto dei granuli è altamente soluile in acqua e possono quindi dissolversi durante la preparazione istologica. I asofili originano nel midollo osseo emopoietico, condividono un precursore comune con gli eosinofili e si sviluppano attraverso stadi differenziativi analoghi a quelli descritti per i neutrofili e gli eosinofili. I asofili migrano nei tessuti in risposta a uno stimolo infiammatorio e a chemiotassine. Si ritiene che non possano rientrare in circolo e la durata della loro vita media nei tessuti è incerta. Dopo colorazione con lu di toluidina, un colorante asico, i granuli dei asofili legano il colorante ma appaiono di colore S viola. Il fenomeno per cui una struttura fa virare il colore del colorante legato è noto come metacromasia (vedi anche Fig. 4.20). In microscopia elettronica, come nell immagine (), il asofilo mostra i granuli specifici (secondari) di forma ovale e di grandi dimensioni, ripieni di materiale elettrondenso. All interno dei granuli sono anche individuaili (non in questa immagine) cristalloidi, lipidi spiraliformi e inclusioni dense. I granuli hanno un nucleo di glicosaminoglicani solfati, in particolare condroitin solfato e, in minore quantità, eparan solfato, che sono responsaili della loro caratteristica colorazione. Funzionalmente, i granuli contengono istamina, altre sostanze vasoattive ed enzimi (Ta. 3.3). I mastociti sono cellule residenti nei tessuti con varie analogie con i asofili; anch essi derivano dal midollo emopoietico ma vanno considerati una linea cellulare distinta (vedi anche Fig. 4.20). S II. Principali tipi di tessuto n Capitolo 3: Sangue, emopoiesi e midollo osseo TABELLA 3.3 Prodotti funzionali dei asofili Prodotti Proteina asica maggiore Proteina di Charcot-Leyden Istamina e altre ammine vasoattive Triptasi Carossipeptidasi Leucotrieni e prostaglandine Interleuchina (IL)-4, IL-13, exotassine Fattore di crescita dell endotelio vascolare (VEGF) Azioni Stesso prodotto degli eosinofili Tossicità per alcuni parassiti Come per gli eosinofili ma prodotta in minore quantità Modulazione della permeailità e del tono vascolare Congestione ed edema Enzima; utilizzato come marcatore per l attività di asofili e mastociti Enzima Mediatori di natura lipidica Rilascio di citochine Rilascio di fattori di crescita Funzioni dei asofili e dei mastociti I asofili e i mastociti hanno recettori ad alta affinità per la porzione Fc delle IgE; pertanto sono capaci di legare IgE, una classe di immunoglouline coinvolte nei fenomeni allergici. Il legame di questi recettori alle IgE complessate con l antigene stimola la degranulazione della cellula causando una reazione di ipersensiilità immediata (anafilattoide). Appartengono a questo tipo di reazioni la rinite allergica (fere da fieno), l asma ronchiale, l orticaria cutanea e lo shock anafilattico (antigeni comuni che possono scatenare tali reazioni includono antigeni delle arachidi, il veleno delle api, la penicillina). I asofili e i mastociti prendono anche parte alla risposta immunitaria innata alle infezioni (vedi Cap. 11) e facilitano il reclutamento dei neutrofili prima dell innesco di una risposta immunitaria adattativa. Essi svolgono anche un ruolo nella difesa dai parassiti, come nella risposta alle larve di alcune specie di vermi che migrano attraverso la cute (larva migrans cutanea). Un aumento del numero dei asofili nel sangue si riscontra frequentemente in pazienti affetti da lesioni premaligne del midollo emopoietico, come la mielodisplasia, e da leucemia mieloide cronica (LMC). 57 YOUNG_ch _0064.indd 57 22/07/14 13:40

14 Granulociti a FIG Eosinofili (a) Tessuto, EE (HP) () Striscio di sangue, Giemsa (HP) Gli eosinofili rappresentano dall 1 al 6% dei leucociti circolanti nel sangue; il loro numero suisce variazioni circadiane, essendo maggiore al mattino e più asso nel pomeriggio. La produzione di eosinofili dal midollo è controllata dalla citochina interleuchina 5 (IL-5) e, in misura minore, dall interleuchina 3 (IL-3) e dal fattore stimolante le colonie granulocito-monocitarie (GM-CSF). Gli eosinofili circolano nel sangue per circa 18 ore, dopodiché fuoriescono dai capillari per entrare nei tessuti, dove risiede la maggioranza (>95%) degli eosinofili. In condizioni normali, gli eosinofili tissutali sono identificaili nella mucosa del tratto gastrointestinale, specialmente nell intestino. Un asso numero di eosinofili, proailmente in transito, si trova anche nella milza e nei linfonodi. Gli eosinofili entrano in altri tessuti in risposta a segnali chemiotattici generati dalla mucosa infiammata o nel corso di una reazione allergica; questi segnali includono le chemochine eotassina-1 ed eotassina-2, IL-5 e alcuni leucotrieni. Il processo di extravasazione attiva parzialmente gli eosinofili, che vengono poi ulteriormente attivati dai mediatori rilasciati nel corso di una risposta immunitaria di tipo T helper 2 (T H 2), quali IL-5, IL-3 e GM-CSF. Una stimolazione adeguata causa il rilascio di granuli e dei mediatori. A differenza dei neutrofili, gli eosinofili non sono cellule fagocitarie. Si pensa che gli eosinofili possano sopravvivere a lungo nei tessuti (8-12 giorni o anche di più), ma i dati sperimentali a riguardo sono ancora pochi. Gli eosinofili in genere non ritornano in circolo; nell intestino migrano nel lume del viscere o vanno incontro a lisi. Un eosinofilo (diametro µm) è più grande di un neutrofilo e facilmente riconosciile per l aondanza di grandi granuli specifici, che si colorano di rosso rillante con l eosina, come nella fotografia (a), e di un rosso mattone con i metodi di Romanowsky, come nell immagine (). La maggioranza delle cellule presenta un nucleo iloato, ma, con il procedere della maturazione nel tessuto, il nucleo può segmentarsi ulteriormente. I granuli citoplasmatici, densamente impaccati, possono parzialmente oscurare il nucleo. I granuli specifici sono circondati da memrana, hanno dimensioni uniformi e contengono una matrice e un cristalloide a reticolo cuoidale (Fig. 3.13). Essi contengono proteine estremamente alcaline (cioè asiche), in particolare la proteina asica maggiore (major asic protein, MBP). Altre proteine sono la proteina cationica degli eosinofili (eosinophil cationic protein, ECP), la neurotossina derivata dagli eosinofili (eosinophil-derived neurotoxin, EDN) e una perossidasi eosinofila (eosinophil peroxidase, EPO). Queste proteine esercitano azione tossica su molti parassiti, alcuni virus a RNA e in certi casi anche sui tessuti. TABella 3.4 Prodotti funzionali degli eosinofili Prodotti Proteina asica maggiore Neurotossina degli eosinofili (EDN) Proteina cationica degli eosinofili (ECP) Perossidasi degli eosinofili (EPO) Istaminasi, fosfolipasi, fosfatasi acida, arilsulfatasi, catepsina Leucotrieni e prostaglandine Interleuchina (IL)-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-13, fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) Fattore di crescita trasformante β (TGF-β), fattore di crescita dell endotelio vascolare (VEGF), fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) Proteina cristallina di Charcot-Leyden (galectina-10) Funzioni Tossicità per alcuni parassiti Degranulazione di mastociti e asofili Rionucleasi con attività antivirale Danni alle memrane cellulari Degranulazione dei mastociti Generazione di radicali ossidanti dall ossigeno, incluso l anione superossido, e di acido iporomico (da ioni romuro) Enzimi Mediatori di natura lipidica Citochine Fattori di crescita Non nota, forma cristalli nei tessuti 58 M mitocondrio N nucleo R riosomi REl reticolo endoplasmatico liscio REr reticolo endoplasmatico rugoso S granuli specifici YOUNG_ch _0064.indd 58 22/07/14 13:40

15 a S REr R REr M REl S R II. Principali tipi di tessuto n Capitolo 3: Sangue, emopoiesi e midollo osseo N R FIG Eosinofilo (a) Uomo, ME () Topo, ME In microscopia elettronica queste cellule sono caratterizzate dai granuli specifici S grandi e ovoidali, ognuno contenente un cristalloide allungato. Nell uomo, come mostrato in immagine (a), i cristalloidi sono relativamente elettrontrasparenti e di forma irregolare; in molti altri mammiferi, hanno invece una forma discoidale più regolare. La fotografia () mostra un eosinofilo all interno di un tessuto di topo; anche in questa specie, i cristalloidi sono relativamente elettrontrasparenti. Gli eosinofili contengono pochi mitocondri, un esteso reticolo endoplasmatico liscio REl e tracce di reticolo endoplasmatico rugoso REr. Si notano anche riosomi R lieri e il nucleo N iloato. Eosinofili in patologia Gli eosinofili sono cellule infiammatorie multifunzionali. Essi hanno un ruolo centrale nella difesa dai parassiti, specialmente i vermi (elminti), e nell induzione e mantenimento della risposta infiammatoria allergica; esempi di quest ultima sono le riniti allergiche (fere da fieno) e l asma. Gli eosinofili svolgono anche un ruolo nelle infezioni virali e, in misura minore, in vari processi infiammatori, nonché un ruolo secondario come cellule presentanti l antigene. [Grazie all azione immunomodulatoria delle sostanze contenute all interno dei granuli, gli eosinofili possono contriuire ad attenuare la risposta immunitaria ad alcune popolazioni di flora atterica residente (per esempio, la flora atterica intestinale). Gli eosinofili possono, in alcuni casi, espellere il loro DNA mitocondriale al fine di creare una rete extracellulare viscosa (NET) che intrappola i microrganismi, come accade per i neutrofili, che però utilizzano il DNA nucleare. N.d.C.]. I processi infiammatori che coinvolgono gli eosinofili risultano spesso in un aumento del numero di queste cellule nel sangue (>0, /L), una condizione nota come eosinofilia, che può essere dovuta a parassitosi e/o condizioni allergiche. 59 YOUNG_ch _0064.indd 59 22/07/14 13:40

16 Piastrinopoiesi N I a E E Mk c FIG Piastrine e megacariociti (a) Giemsa (HP) () EE (MP) (c) ME 6000 I megacariociti sono responsaili della produzione delle piastrine e sono le cellule più grandi reperiili nel midollo osseo ( µm). Negli strisci, come nella fotografia (a), mostrano grandi nuclei poliloati contenenti sparsi aggregati di cromatina e nucleoli poco cospicui e un aondante citoplasma ricco di granuli fini e asofili. Nelle preparazioni istologiche colorate in EE, come nell immagine (), i megacariociti Mk sono facilmente riconosciili per la loro dimensione, i nuclei loulati e il citoplasma aondante, chiaro ed eosinofilo. Lo sviluppo e la maturazione dei megacariociti sono complessi e i precursori precoci non sono riconosciili in modo affidaile in microscopia ottica. Il precursore del megacariocita nel midollo è detto megacariolasto. Le cellule mature sono poliploidi, essendo andate incontro a vari cicli di replicazione del DNA non seguiti da divisione citoplasmatica (endomitosi). Una cellula matura può andare incontro fino a sette duplicazioni successive dei componenti nucleari e citoplasmatici senza divisione cellulare; da qui originano le grandi dimensioni e il nucleo multiloato. Mentre le cellule maturano, il citoplasma si riempie di fini granuli asofili che riflettono una profusione di organelli citoplasmatici, granuli, vescicole e tuuli. C è anche un esteso sistema di memrane di demarcazione, complesse invaginazioni della memrana plasmatica che sono alla ase della frammentazione del citoplasma, che dà origine alle piastrine. I megacariociti si trovano adiacenti ai sinusoidi del midollo osseo e, quando sono maturi, estrudono pseudopodi, noti come propiastrine, verso il lume del sinusoide. Questi pseudopodi poi si frammentano rilasciando le piastrine. Un megacariocita può entrare per intero nel lume dei sinusoidi, e infatti queste cellule sono occasionalmente reperiili nei capillari polmonari, dove presumiilmente rilasciano piastrine. La proporzione di piastrine rilasciate in questi due siti non è nota, nonostante si pensi che il rilascio midollare sia predominante. Ogni megacariocita genera da 2000 a 4000 piastrine. Una persona adulta necessita di circa 100 milioni di megacariociti (10 8 ) per produrre nuove piastrine ogni giorno. Al microscopio elettronico le cellule mature mostrano, come nell immagine (c), una zona perinucleare N con i classici organelli (apparato di Golgi, reticolo endoplasmatico liscio e rugoso, granuli in maturazione e centrioli), una zona intermedia I con un esteso sistema di memrane di demarcazione interconnesse e una zona esterna E ancora più ricca di memrane e filamenti del citoscheletro. I megacariociti e gli eritrociti hanno un precursore comune. La produzione, il differenziamento e la maturazione dei megacariociti sono in parte regolati dalla tromopoietina, un fattore di crescita prodotto principalmente dal fegato, assieme a interleuchine (IL-3 e IL-11) e ad altri fattori di crescita. 60 E piastrine in formazione e mature (zona esterna) I zona intermedia Mk megacariocita N zona perinucleare Pi piastrina YOUNG_ch _0064.indd 60 22/07/14 13:40

17 a FIG Piastrine (a) Giemsa (HP) () ME L immagine (a) mostra alcune piastrine Pi. Le piastrine (tromociti) sono piccoli frammenti anucleati di citoplasma, prodotti dai megacariociti. Le piastrine hanno forma tonda, ovale o a disco iconvesso, con diametro compreso tra 1,5 e 3,5 µm. Negli strisci di sangue hanno un aspetto granulare colorato di viola al centro, a causa dei numerosi organelli, mentre la parte periferica risulta pallida e poco visiile. Il numero di piastrine circolanti nel sangue varia da 150 a /L, e la loro vita media va da 5 a 10 giorni. Le piastrine posseggono la maggior parte degli organelli delle altre cellule, a parte il nucleo. I granuli en visiili in ME () possono essere classificati come segue: Granuli a, di dimensioni e forma variaili, contenenti numerose proteine dell adesione cellulare, fattori della coagulazione e fattori di crescita per la riparazione tissutale. Granuli densi, altamente elettrondensi, contenenti serotonina, ADP, ATP, Ca 2+ e Mg 2+. Lisosomi, come in ogni cellula contenenti gli usuali enzimi litici (vedi Cap. 1). Le piastrine sono sorprendentemente complesse. Esse presentano una anda marginale di microtuuli alla periferia del citoplasma, associata ad aondanti proteine contrattili, actina e miosina, che costituiscono un apparato contrattile. All interno della anda marginale di microtuuli e diffuso per tutto il citoplasma, si trova il sistema tuulare denso (dense tuular system, DTS), costituito da sottili tuuli memranosi dal contenuto elettrondenso. Questi tuuli contengono Ca 2+ e gli enzimi necessari alla sintesi dei mediatori lipidici dell attivazione piastrinica, in particolare la cicloossigenasi e la tromossano sintetasi. Pi Le piastrine contengono anche un sistema di canali di memrana interconnessi, il sistema canalicolare connesso alla superficie (SCCS), che è in continuità con l amiente esterno tramite invaginazioni della memrana citoplasmatica. I granuli si fondono con questo sistema per rilasciare il loro contenuto all esterno. Le piastrine sono complesse anche dal punto di vista funzionale e presentano più di 50 tipi diversi di recettori di superficie. Esse rispondono al danno vascolare per loccare il sanguinamento, partecipano alla coagulazione del sangue e promuovono la riparazione tissutale. Quando l endotelio viene danneggiato, le piastrine aderiscono al collagene esposto e ad altre proteine della memrana asale sottostante tramite i loro recettori di memrana. Ne segue l attivazione che porta alla contrazione del sistema di microtuuli e alla degranulazione con il rilascio del contenuto dei granuli, serotonina e ADP. Le piastrine attivate producono anche il mediatore lipidico tromossano. Questi segnali richiamano altre piastrine e ne stimolano l adesione, portando così alla formazione di un tappo piastrinico. Le piastrine attivate assumono una forma stellata con lunghi pseudopodi. La successiva contrazione dei citofilamenti riduce il diametro del coagulo, attraverso un fenomeno noto come retrazione del coagulo. Le piastrine rilasciano anche una serie di fattori di crescita che simulano la riparazione tissutale, tra cui il fattore di crescita derivato dalle piastrine (platelet-derived growth factor, PDGF) e il fattore di crescita trasformante (transforming growth factor, TGF-). Molti dei prodotti delle piastrine sono ereditati dal megacariocita di origine, ma alcuni sono captati dal plasma via endocitosi mediata da recettore e poi accumulati nei granuli, come, per esempio, la 5-HT (serotonina). II. Principali tipi di tessuto n Capitolo 3: Sangue, emopoiesi e midollo osseo Malattie delle piastrine Un ridotto numero di piastrine è una condizione nota come tromocitopenia. Livelli assi, in particolare < /L, sono associati a spontaneo sanguinamento dei piccoli vasi (con formazione di petecchie), in genere a livello della cute e della parete intestinale; questa è una condizione potenzialmente letale. Vi sono diverse malattie genetiche dovute alla mutazione di varie proteine che compromettono la funzionalità delle piastrine. La più comune di esse è la malattia di von Willerand, dovuta a difetti del fattore di von Willerand (FVIII-vWF), un complesso fattore di adesione prodotto dall endotelio e dai megacariociti. Anche alcuni farmaci possono compromettere l attività delle piastrine. L aspirina (acido acetilsalicilico) locca l enzima cicloossigenasi, iniendo la produzione di tromossano e quindi la funzionalità delle piastrine. 61 YOUNG_ch _0064.indd 61 22/07/14 13:40

18 Monociti M G a G M M d Gr P c Fig Monociti (a)-(c) Giemsa (HP) (d) ME La monocitopoiesi, cioè il processo di formazione dei monociti, si distingue in tre stadi morfologici successivi. Il primo è lo stadio di monolasto, illustrato nella fotografia (a). Queste cellule in seguito maturano, sviluppando granuli citoplasmatici che iniziano a conferire al citoplasma un aspetto a vetro smerigliato; in questo stadio, la cellula è detta promonocita, come mostrato nell immagine (). I promonociti proliferano e maturano a monociti, visiili nel campione (c). Un tipico promonocita effettua due divisioni cellulari successive per produrre quattro monociti in un processo che impiega circa 60 ore. I monociti sono i più grandi tra i leucociti (possono raggiungere i 20 µm di diametro) e costituiscono dal 2 al 10% dei leucociti circolanti nel sangue periferico. Essi circolano nel sangue in media da 3 a 4 giorni prima di migrare nei tessuti. Queste cellule hanno alta motilità e attività fagocitaria e possono maturare nei tessuti a macrofagi residenti tissutali, dove possono sopravvivere a lungo, proliferare e assumere forma e funzioni diverse. Tra le cellule di origine monocitaria si annoverano anche le cellule dendritiche della milza e dei linfonodi, le cellule di Langherans della cute, le cellule di Kupffer del fegato, gli osteoclasti e la microglia del sistema nervoso. Anche se tutte queste cellule originano dal compartimento mieloide e condividono alcuni progenitori con i monociti, la loro migrazione nei tessuti avverree solo in certe fasi precoci dello sviluppo e il loro mantenimento saree garantito in condizioni normali dalla proliferazione in situ. I monociti, nella fotografia (c), sono caratterizzati da un grande nucleo eccentrico che si colora meno intensamente degli altri leucociti a causa di una cromatina meno addensata. La forma del nucleo è variaile, ma in genere presenta una profonda indentatura nella parte del nucleo rivolta verso il centro della cellula, avendo così l aspetto tipico di un ferro di cavallo. Possono essere evidenti due o più nucleoli. Il citoplasma è aondante e si colora di grigio-lu pallido con il metodo di Romanowsky. Si vedono anche numerosi piccoli granuli lisosomali colorati di viola e vacuoli citoplasmatici che conferiscono l aspetto a vetro smerigliato. In microscopia elettronica, immagine (d), è evidente che il citoplasma contiene vari riosomi, poliriosomi e un po di reticolo endoplasmatico rugoso. L apparato di Golgi G è en sviluppato e localizzato, con il centrosoma in prossimità dell indentatura del nucleo. Sono evidenti anche molti piccoli mitocondri M di forma allungata. Brevi pseudopodi P si estendono dalla cellula, riflettendone l attività fagocitaria e i movimenti ameoidi. I granuli citoplasmatici Gr dei monociti sono elettrondensi e omogenei. Metà di essi assomiglia ai granuli primari (azzurrofili) dei neutrofili e contiene mieloperossidasi, fosfatasi acida, elastasi e catepsina G. L altra metà è costituita da granuli secretori contenenti proteine del plasma, proteine di adesione di memrana e fattore di necrosi tumorale α (tumor necrosis factor alfa, TNF-α). I monociti sono in grado di espletare fagocitosi e digestione lisosomale in modo continuativo grazie alla capacità di rigenerare i propri componenti e di utilizzare un metaolismo aeroio oppure anaeroio a seconda della disponiilità di ossigeno nel tessuto. Funzioni dei monociti I monociti circolano nel sangue e rispondono a segnali chemiotattici provenienti dai tessuti danneggiati, dai microrganismi e dai focolai di infiammazione migrando nei tessuti e differenziandosi in macrofagi. Grazie alla loro attività fagocitaria e al ricco contenuto di enzimi idrolitici, essi incorporano e degradano i detriti dei tessuti e i corpi estranei. I monociti sopravvivono e proliferano nei tessuti come macrofagi se vengono adeguatamente stimolati da fattori di crescita, come l M-CSF, il GM-CSF e l IL-3, ma non rientrano nella circolazione sanguigna. I macrofagi presentano recettori per molte citochine e chemiochine, tra cui l interferone γ (IFN-γ), una citochina prodotta dai linfociti T (vedi Cap. 11). Essi possono processare gli antigeni e presentarli alle cellule T per promuovere la risposta immunitaria adattativa. Possono anche secernere numerose chemiochine, citochine e fattori di crescita implicati nell infiammazione, nella riparazione e rigenerazione dei tessuti. 62 G apparato di Golgi Gr granuli L linfolasto Lc linfocita M mitocondrio P pseudopodio YOUNG_ch _0064.indd 62 22/07/14 13:40

19 L Lc a c Fig Linfociti (a-c) Giemsa (HP) (d) ME d II. Principali tipi di tessuto n Capitolo 3: Sangue, emopoiesi e midollo osseo I linfociti hanno un ruolo fondamentale nei meccanismi di difesa immunologici e saranno descritti in dettaglio nel Cap. 11. La produzione di linfociti da parte della cellula staminale emopoietica inizia nel midollo. La più precoce cellula riconosciile è il linfolasto L, illustrato nella fotografia (a), con un linfocita Lc adiacente. Il linfolasto è più grande del linfocita e presenta cromatina nucleare fine e dispersa, piccoli nucleoli pallidi e scarso citoplasma. Alcuni linfolasti maturano nel midollo diventando linfociti B, altri raggiungono il timo dove maturano in linfociti T, mentre altri ancora differenziano in cellule natural killer (NK) nel midollo. I linfociti circolano attraverso i vari tessuti linfoidi e gli altri tessuti del corpo attraverso i vasi sanguigni e linfatici. Essi transitano continuamente attraverso i tessuti e ritornano nella circolazione come parte del processo di sorveglianza immunitaria. Le cellule linfoidi hanno una vita media variaile da alcune settimane a un tempo indefinito e, a differenza dei granulociti, non sono cellule terminali; essi possono infatti proliferare, e infatti la maggior parte della loro proliferazione avviene proprio nei tessuti. La linfopoiesi è un attività costante del midollo, ma proporzionalmente minoritaria. I linfociti costituiscono dal 20 al 40% dei leucociti circolanti, variando da 1 a 4, /L. I linfociti sono i più piccoli tra i leucociti, solo leggermente più grandi degli eritrociti. Essi presentano in genere un nucleo rotondo, oppure ovale, densamente colorato con cromatina addensata e relativamente scarso citoplasma chiaro, asofilo e agranulare, come si nota nel leucocita del campione (a). Questi piccoli linfociti sono forme inattive. Una parte dei linfociti normali è più grande e con nuclei più grossi, più citoplasma e un piccolo numero di granuli citoplasmatici. Queste forme sono dette grandi linfociti granulari (large granular lymphocytes, LGL) e rappresentano le cellule natural killer o linfociti T citotossici nell immagine (). Lo stato del nucleo e la quantità di citoplasma sono dipendenti dall attività della cellula. Quando si trovano in fase di attivazione o proliferazione, i linfociti aumentano la loro dimensione e presentano nuclei più grandi, con cromatina dispersa, nucleoli grandi e visiili e citoplasma più aondante. Alcune di queste cellule reattive possono circolare nel sangue, in particolare durante i processi infiammatori; i linfociti B attivati possono stailirsi nei tessuti e maturare a plasmacellule che vivono più a lungo e secernono aondanti anticorpi. L immagine ultrastrutturale in (d) mostra un piccolo linfocita circolante all interno di un capillare polmonare. Il nucleo è rotondo ma leggermente indentato e la cromatina moderatamente addensata; non sono presenti nucleoli. Il citoplasma sparso contiene pochi mitocondri, un rudimentale apparato di Golgi, poco reticolo endoplasmatico e, di contro, un gran numero di riosomi lieri. La memrana plasmatica mostra piccole proiezioni citoplasmatiche che semrano piccoli microvilli. Malattie dei linfociti La mononucleosi infettiva è un infezione virale dovuta al virus di Epstein-Barr. Tra i suoi sintomi vi sono linfoadenopatia (ingrossamento dei linfonodi) e, spesso, un notevole incremento della conta di linfociti ematici (linfocitosi). Nei linfociti circolanti sono evidenti una marcata attivazione e camiamenti reattivi, da cui il nome della patologia. Un aumento di piccoli linfociti di piccola taglia e forma omogenea è invece evidenziaile nel sangue di pazienti affetti da leucemia linfatica cronica (LLC), una patologia oncoematologica più frequente nell anziano. 63 YOUNG_ch _0064.indd 63 22/07/14 13:40

20 Riepilogo RIEPILOGO L esame del sangue (esame emocromocitometrico, areviato più comunemente in emocromo) generalmente prevede la conta delle cellule nel sangue e informazioni sulla dimensione degli eritrociti e delle piastrine. Questi parametri variano in diverse condizioni. I valori di normalità nel neonato variano con l età e possono camiare da un giorno al successivo. I valori di normalità del amino sono diversi da quelli dell adulto e i valori nell uomo e nella donna sono diversi a partire dall adolescenza e fino alla menopausa. Vi sono anche differenze legate all etnia, piccole differenze dovute alla tecnologia di conta impiegata e differenze dovute alla calirazione del singolo strumento. Per tutte queste ragioni, i numeri delle conte ematiche riportati in Ta. 3.5 sono semplicemente indicativi. Per facilitare l interpretazione dell emocromo, ogni laoratorio di analisi fornisce appropriati intervalli di normalità di ogni parametro calirati sulla demografia dei pazienti. Le informazioni riguardanti le dinamiche cellulari, quali la vita media e il tasso di produzione, non sono parte dei normali esami ematologici. TABella 3.5 Caratteristiche dei principali tipi cellulari del sangue Eritrociti Neutrofili Eosinofili Basofili Linfociti Monociti Piastrine Dimensioni 6,7-7,7 µm µm µm µm 5-20 µm µm 1,5-3,5 µm Numero in circolo 3, /L 1,5-7, /L 0,04-0, /L <0, /L 1, /L 0,2-0, /L /L Percentuale dei leucociti totali 40-75% 1-6% <1% 20-50% 2-10% Durata media del differenziamento 5-7 giorni dallo stadio di proeritrolasto 7 giorni dallo stadio di mielocita 6-9 giorni dallo stadio di mielocita 6-9 giorni dallo stadio di mielocita 1 giorno dallo stadio di precursore maturo 2-3 giorni dallo stadio di promonocita 4-5 giorni dallo stadio di megacariocita precoce Tasso giornaliero di produzione dal midollo per kg di peso corporeo Tempo medio di permanenza in circolo , , , , piastrine da ~10 6 megacariociti 120 giorni 8-12 ore 18 ore 3 giorni In transito 30 ore 7-10 giorni Vita media dopo rilascio dal midollo 120 giorni 3-4 giorni 3-12 giorni Giorni: più a lungo nei tessuti(?) Variaile Giorni: anche anni come macrofago tissutale 7-10 giorni TABella 3.6 Funzioni dei principali tipi cellulari del sangue Tipo cellulare Funzione Altre informazioni Glouli rossi (eritrociti) Neutrofili Eosinofili Basofili Monociti Linfociti Piastrine (tromociti) Trasporto di ossigeno e anidride caronica Infiammazione e difesa antiatterica Infiammazione e difesa da parassiti Infiammazione, allergie e difesa da parassiti Infiammazione e difesa dalle infezioni Risposta immunitaria adattativa Coagulazione del sangue (emostasi) Cellule terminali anucleate; specializzate per flessiilità meccanica; vita media 120 giorni; contengono alte concentrazioni di emogloina Cellule terminali differenziate; migrano nei tessuti e non ritornano in circolo; contengono numerosi granuli con funzioni pro-infiammatorie e antimicroiche; fagocitano e distruggono i atteri Cellule terminali differenziate; migrano nei tessuti e non ritornano in circolo; contengono numerosi granuli con funzioni pro-infiammatorie e antiparassitarie Cellule terminali differenziate; migrano nei tessuti e non ritornano in circolo; contengono numerosi granuli con funzioni pro-infiammatorie Migrano nei tessuti e maturano in macrofagi; possono diventare cellule residenti a lungo termine nei tessuti con forma e funzioni specializzate; fagocitano microrganismi e detriti; principale fonte di produzione di citochine Dopo maturazione negli organi linfoidi primari possono proliferare nei tessuti e ricircolano attraverso il sangue Corpuscoli cellulari anucleati prodotti dalla frammentazione del citoplasma dei megacariociti; principale fonte di fattori di crescita nei siti di danno vascolare e tissutale 64 YOUNG_ch _0064.indd 64 22/07/14 13:40