Studi di tossicita acuta
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- Battista Sole
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1 Gli studi tossicologici hanno lo scopo di evidenziare i limiti di tossicità del farmaco e di prevedere i suoi eventuali effetti dannosi o indesiderabili alle condizioni di impiego previste nell uomo. Principali risposte che la tossicologia deve fornire: 1) Definire la minima dose tossica la massima dose non tossica la relazione tra dose terapeutica e dose tossica le caratteristiche degli effetti tossici del farmaco e dei suoi metaboliti 2) Individuare la struttura cellulare, l organo o il sistema bersaglio 3) Stabilire la reversibilità o meno degli effetti tossici le differenze legate al sesso Studi di tossicita acuta DEFINIZIONE: Effetti collaterali insorgenti dopo breve tempo dall assunzione di una dose singola di sostanza assunta nell arco di 24 ore Somministrazione unica (acuta) del principio attivo su due o più specie di mammiferi. Dosi somministrate: - ci si riferisce a parametri già noti quando possibile - se si tratta di una sostanza non nota o complessa si procede per tentativi Vie di somministrazione: due diverse vie di somministrazione una delle quali identica o simile a quella proposta nell uomo, mentre l altra deve garantire il completo assorbimento sistemico del farmaco (e.v). Range di dosi: che assicuri la comparsa di effetti tossici. Periodo di osservazione: 14 giorni o fino a quando persistono i segni di tossicità. Durata dello studio: è circa 14 gg e comunque mai inferiore a 7 gg e può proseguire per tutto il tempo in cui persistono gli effetti tossici. 176
2 Il periodo di osservazione deve essere adeguato a mettere in luce i danni ai tessuti e agli organi, oppure il ritorno alla norma delle condizioni dell animale. Determinazioni: - segni clinici di tossicità - mortalità a determinati intervalli - esame autoptico degli animali deceduti e di quelli sacrificati - esame istopatologico degli organi Finalità del test: Ottenere dati su relazione dose/effetto e dose/mortalità per la valutazione quantitativa della Dose letale 50 (DL 50 ). Definire le dosi con cui partire negli studi di tossicità ripetuta. DL 50 = quantità di farmaco, in unità di peso o volume per unità di peso corporeo (es mg/kg), che somministrata ad un gruppo di animali per una determinata via ed in definite condizioni sperimentali, produce la morte del 50% degli animali. Per motivi etici (minore sofferenza per gli animali) spesso si determina la DL 10 al posto della DL 50. Guideline n. OECD 423 per gli studi di tossicità acuta: 177
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5 Classificazione degli xenobiotici in base alla DL50: 180
6 Confronto tra sostanze in base alla loro DL50: Studi di tossicita ripetuta DEFINIZIONE: Effetti collaterali insorgenti dopo l assunzione di almeno 3 dosi della sostanza (SUBACUTA) o dopo somministrazioni ripetute (CRONICA). Subacuta: fino a 3 mesi Subcronica: fino a 6 mesi Cronica: oltre 6 mesi Valuta le alterazioni funzionali e/o anatomo-patologiche conseguenti alla somministrazione ripetuta del farmaco, le eventuali differenze dovute al sesso/specie e la tendenza o meno ad un accumulo. Il grado di purezza del farmaco non deve essere maggiore di quello che sarà commercializzato. Due specie di mammiferi, entrambi i sessi, stessa numerosità, selezionate sulla base della somiglianza all uomo per gli aspetti farmacodinamici e metabolici relativi al composto da saggiare. La via di somministrazione è quella prevista in terapia. Trattamento per 28 giorni che serve ad individuare le dosi da utilizzare. Tre livelli di dose: la dose bassa deve essere sufficiente a produrre un effetto farmacodinamico, la dose alta deve provocare effetti tossici (a non più del 10% degli animali), la dose intermedia è la media geometrica tra le due. Poi si aggiunge un gruppo di controllo (animali non trattati). Le prove di tossicità per somministrazioni ripetute devono mettere in evidenza le soglie di tossicità, le alterazioni funzionali e/o anatomo-patologiche conseguenti alla somministrazione ripetuta del farmaco o dell associazione e stabilire le condizioni della comparsa di tali alterazioni in funzione della posologia. La valutazione degli effetti tossici viene effettuata in base al rilievo della mortalità, all esame del comportamento, dell accrescimento, della crasi ematica e di prove funzionali a carico di diversi organi (cuore, fegato, rene, milza etc.) nonché in base a reperti autoptici con relativi esami istologici. VIE DI SOMMINISTRAZIONE: quella che sarà usata nell uomo Orale 181
7 Inalatoria Dermica DETERMINAZIONI: Comportamento e stato di salute dell animale (peso corporeo, consumo di cibo, test comportamentali) Parametri ematologici, biochimici ed urinari Peso degli organi e valutazioni istopatologici FINALITA DEI TEST SUBCRONICI O CRONICI: stabilire il NOAEL o no-observed-adverse-effect level ovvero la dose che non induce nessun effetto nella specie animale presa in esame per poi calcolare la dose iniziale per la prima somministrazione clinica negli studi di fase I. Spesso si calcola anche il LOAEL quando non è stato possibile identificare il NOAEL. Il LOAEL è low-observed-adverse effect level ovvero la dose più bassa che induce effetto tossico. 182
8 Calcolo della prima dose per studi clinici nell uomo NOAEL = HED (human equivalent dose) fattore di conversione (BSA) HED/fattore di sicurezza = starting dose o prima dose per studi clinici Studi tossicologici sulla riproduzione OBIETTIVI: valutazione dell effetto tossico della sostanza in esame sulle varie fasi della riproduzione. - Mettere in rilievo le modifiche della fertilità o procreazione anomala dovuta a danni dei gameti maschili e o femminili - Interferenze con le fasi di impianto del feto e del suo sviluppo - Effetti tossici sull embrione - Effetti tossici sul feto (teratogenesi) - Interferenze con il parto - Effetti sullo sviluppo postnatale - Effetti tardivi sulla discendenza ANIMALI UTILIZZATI: 2 specie animali MODALITA : somministrazione del composto a maschi e femmine prima dell accoppiamento, durante la gravidanza e l allattamento. Viene seguito lo sviluppo dei nuovi nati fino al loro nuovo accoppiamento per giungere ad una successiva generazione. 183
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10 Studi di cancerogenicità OBIETTIVI: - Registrare l incidenza dei tumori soprattutto quelli che colpiscono determinati tessuti. - Registrare il periodo di latenza prima della loro manifestazione DURATA DEGLI STUDI: dai 18 mesi (per il topo) ai 24 mesi (per il ratto). ANIMALI UTILIZZATI: due specie animali somministrando il farmaco per la stessa via proposta per l uomo. gruppi sperimentali di almeno 100 animali per livello di dose e gruppo di controllo (sacrificio di animali ai diversi end points) oppure studi con micropet con esiguo numero di animali. SCELTA DELLE DOSI: La dose massima deve esercitare un minimo effetto tossico (riduzione del peso corporeo del 10% = dose massima tollerata = MTD) oppure una tossicità minima a livello di un organo bersaglio. La dose minima deve produrre un effetto farmacologico ma non tossico nell animale. La dose intermedia è la media tra la massima e la minima Analisi con MicroPET (tomografia a emissione di positroni) è una tecnica di medicina nucleare per evidenziare la presenza di tumori Procedura: iniezione e.v. nel ratto di marcante radioattivo come il glucosio marcato con fluoro radioattivo. Le cellule tumorali in continua proliferazione incorporano elevate quantità di glucosio per cui si osserverà un aumento di radioattività (colorazione tendente al rosso) nella zona dove è localizzato il tumore. 185
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12 TEST DI MUTAGENESI 187
13 Tests di mutagenesi Altri studi da effettuare sono quelli di mutagenesi che riguardano gli effetti indotti dall impatto di un composto nuovo sul patrimonio genetico. Con il test di Ames si evidenziano mutazioni puntiformi in procarioti (ceppi di Salmonella thyphimurium e di Escherichia coli). Con il test di aberrazioni cromosomiche su linfociti umani si valuta l effetto clastogeno (addizione, riarrangiamento di cromosomi) della molecola in studio sui cromosomi. Il test del mouse lymphoma (preferito in USA) ha due end points: valutazione dell induzione di mutazioni geniche + effetto clastogeno (= mutazioni più estese o rotture del DNA). Una sostanza mutagena è potenzialmente responsabile dell induzione di cancerogenesi e/o di malformazioni fetali. 188
14 Tests di mutagenesi indicati dalle guideline Test di Ames E un test di mutagenesi in vitro ampiamente utilizzato per determinare se un composto è carcinogeno o mutante ovvero in grado di indurre una mutazione revertente in un microrganismo costituito dal ceppo mutato della Salmonella thiphymurium. La mutazione impedisce ai microorganismi di poter sintetizzare l'amminoacido istidina che è uno dei 20 amminoacidi utilizzati dalle cellule per costruire le proteine. I microorganismi vengono fatti crescere in un terreno di coltura dove l'istidina è presente in quantità limitanti (vi è abbastanza istidina da permettere solo un certo numero di divisioni cellulari). Quindi lo scopo del test è di appurare se un composto con sospetta attività mutagena possa indurre mutazioni in grado di invertire la mutazione che rende impossibile al microrganismo di sintetizzare l'istidina. Quindi se la sostanza che si ritiene cancerogena, rende il microorganismo capace di poter sintetizzare nuovamente l'istidina (proliferazione esponenziale della colonia), viene considerata mutagena. Si prepara una coltura per ogni mutageno che si vuole analizzare e si effettua anche un controllo con una sostanza neutra. Inoltre se si vuole testare la mutagenicità anche dei metaboliti della sostanza in esame, si introdurrà nel terreno di coltura anche un estratto di fegato di ratto in modo tale da poter favorire la metabolizzazione della sostanza in esame, ad opera degli enzimi del fegato. Ci sono proprietà aggiuntive nei batteri utilizzati per il test di Ames: hanno una mutazione aggiuntiva che rende la membrana esterna facilmente permeabile alle grandi molecole da saggiare e hanno una mutazione che elimina alcuni meccanismi di riparazione del DNA. 189
15 Proliferazione delle colonie poiché l agente saggiato è mutageno ed ha invertito la mutazione dei ceppi batterici che così possono moltiplicarsi 190
16 Test del Mouse linfoma Test dei micronuclei (procedura OECD N. 474) E un test di mutagenesi che consente di osservare eventuali errori che avvengono durante la mitosi, causati da agenti mutageni, sia in vitro che in vivo. In questo caso descriviamo la metodica in vivo. Consiste nel prelevare, 24-36h dopo il trattamento con sostanza mutagena in esame, da un organismo (topo o ratto), cellule (eritrociti) durante la mitosi, e osservarne un discreto numero (almeno un centinaio) al microscopio, dopo aver effettuato una colorazione differenziale che evidenzi il materiale genetico: in caso di errori (provocati dal mutageno), 191
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