1) Ago Studio in vitro sull'aberrazione cromosomica: attività citotossica (file: TS39)
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- Gregorio Barbieri
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1 Studi sull'attività endotossica e citotossica 1) Ago Studio in vitro sull'aberrazione cromosomica: attività citotossica (file: TS39) Cellule ovariche di criceto cinese (CHO) sono state cresciute in coltura monostrato e senza attivazione metabolica. Il terreno di coltura è stato sostituito con il prodotto in diverse concentrazioni, quindi sottoposto a incubazione. L'attività citotossica è stata monitorata mediante microscopio osservando strutture intracellulari e cromosomi ed eseguendo scansioni per rilevare la presenza di eventuali danni. Nessuna attività citotossica rilevata fino a concentrazioni del 100%. Studi sulla genotossicità 1) Ago Genotossicità: studio sull'aberrazione cromosomica, risultati sui dosaggi (file: TS39) Cellule ovariche di criceto cinese (CHO) sono state cresciute in coltura monostrato e senza attivazione metabolica. Il prodotto è stato aggiunto in diverse concentrazioni al terreno di coltura, che è stato quindi sottoposto a incubazione per 20 ore. Le cellule sono state trattate con colorante, quindi esaminate al microscopio per rilevare la presenza visibile di tossicità o aberrazione cromosomica. Anche a dosi molto consistenti di prodotto (soluzioni al 50%) non sono evidenti danni cromosomici. 2) Dic Genotossicità: studio sull'aberrazione cromosomica in cellule di mammifero (file: TS35) 1
2 Cellule ovariche di criceto cinese (CHO) sono state cresciute in coltura monostrato e senza attivazione metabolica. Il prodotto è stato aggiunto in diverse concentrazioni (fino al 50%) al terreno di coltura, che è stato quindi sottoposto a incubazione per 20 ore. Le cellule sono state trattate con colorante, quindi esaminate al microscopio per rilevare la presenza di gap o break cromatidici, rotture o frammenti cromosomici di più tipi diversi o scambi cromosomici. Una volta determinate le percentuali delle diverse aberrazioni cromosomiche, è stata condotta un'analisi su ciascuna classe di aberrazione. Il prodotto non causa danni ai cromosomi. Spesso l'aberrazione cromosomica riscontrata nelle colture esposte al prodotto è risultata inferiore a quelle delle colture di controllo in acqua salata. Non è stata riscontrata alcuna prova di danni ai cromosomi. 3) Gen Genotossicità: studio sulla retromutazione (file: TS39) Retromutazioni genetiche sono state rilevate in 5 varietà diverse di batteri mutanti appositamente preparati, sensibili a retromutazione genetica in presenza di tossicità. Le colture sono state esposte a concentrazioni diverse, ma elevate, di prodotto e confrontate con colture esposte a controlli negativi e positivi. Il numero di retromutazioni indica la forza dell'effetto mutageno previsto sul DNA da parte del prodotto. Tutti i test sono stati condotti in triplicato. Il prodotto non è un agente mutageno potenziale. Nessuna retromutazione significativa è stata osservata nelle varietà di batteri a prescindere dalla dose. 4) 2005 Analisi dell'espressione genica per la tossicità nei conigli (file: TS22) Affimetrix, Centro di genomica funzionale, Università di Albany Quattro gruppi di conigli bianchi neozelandesi sono stati sottoposti per 3 giorni a iniezioni giornaliere di MDI-P o soluzione salina a concentrazioni diverse. L'attività genetica di oltre geni diversi è stata analizzata su campioni prelevati prima e dopo l'esposizione e su gruppi di controllo. Sulla base di questa analisi sono state misurate le espressioni genetiche di citochine infiammatorie, messaggeri immunitari e altri marker genetici di risposta tossica. 2
3 Non è stata riscontrata alcuna espressione genica indicante una risposta tossica a MDI- P. È stata osservata una significativa sottoregolazione (fattore di 2) delle famiglie geniche SOCS2, segno di una riduzione dell'infiammazione, e una significativa sovraregolazione (fattore di 7) dei geni TIA1, che comportano la morte cellulare programmata delle cellule danneggiate. Studi di tossicità acuta 1) Giu Studio di quattordici giorni sulla tossicità acuta intravenosa del prodotto nei topi (file: TS6) Biological Test Center, Irvine, California Il prodotto è stato iniettato in 4 gruppi di 5 topi, 4 volte il primo giorno e, per i 14 giorni successivi, una volta al giorno. I 4 gruppi hanno ricevuto diverse dosi fino a 8 ml/kg di massa corporea (oltre 50 volte il quantitativo equivalente previsto nel sangue di un soggetto umano adulto). I topi sono stati sottoposti a stretto monitoraggio per rilevare qualsiasi segno di tossicità quali decesso, irritazione, malattia e comportamenti anormali. Quantitativi considerevoli nel sangue non causano segni di malattia o variazioni comportamentali nei topi. 2) Gen Studio sulla tolleranza a dosi crescenti di prodotto somministrato a cani (file: TS10) WIL Research, Ashland, Ohio Il prodotto è stato iniettato ogni due giorni in due esemplari di Beagle di sesso maschile e due di sesso femminile, in dosi crescenti di 10, 20, 40 ml/kg nei primi 3 giorni e 20 ml/kg (pari a oltre 300 volte il quantitativo massimo previsto nel sangue di un soggetto umano adulto) per i restanti 4 giorni. Prima e dopo ciascuna somministrazione, sono stati registrati i valori relativi a pressione ematica, peso corporeo, frequenza cardiaca (ECG). Lo studio ha incluso inoltre analisi complete del sangue nonché un attento monitoraggio quotidiano per rilevare eventuali segni di tossicità o anomalie comportamentali. Su nessun animale sono stati osservati elementi di anormalità. Pressione ematica, ECG e analisi del sangue hanno presentato valori normali sotto tutti gli aspetti. 3
4 La presenza di quantitativi considerevoli di prodotto nel sangue dei cani non causa comportamenti anormali negli indicatori vitali né perdita di peso, alterazione della chimica ematica o sintomi di patologie o variazioni comportamentali negative su un periodo di 7 giorni. 3) Feb Studio di quattro settimane sulla tossicità del prodotto nei cani (file: TS11) WIL Research, Ashland, Ohio Il prodotto è stato iniettato quotidianamente per ventotto giorni in quattro gruppi composti da tre esemplari di Beagle di sesso maschile e tre di sesso femminile, in dosi comprese tra i 5 e i 20 ml/kg (pari a svariate centinaia di volte il quantitativo massimo previsto nel sangue di un soggetto umano adulto). Prima e dopo ciascuna somministrazione, sono stati registrati i valori relativi a pressione ematica, peso corporeo, frequenza cardiaca (ECG). Lo studio ha incluso inoltre analisi complete del sangue e delle urine, nonché un attento monitoraggio quotidiano per rilevare eventuali segni di tossicità o anomalie comportamentali. Su nessun animale sono stati osservati elementi di anormalità. Pressione ematica, ECG e analisi del sangue/delle urine hanno presentato valori normali sotto tutti gli aspetti. Su ciascun animale sono stati raccolti consistenti quantitativi di informazioni. La presenza di quantitativi considerevoli di prodotto nel sangue dei cani non causa comportamenti anormali negli indicatori vitali né perdita di peso, alterazione della chimica ematica/delle urine o sintomi di patologie o variazioni comportamentali negative su un periodo di 28 giorni. 4) Gen Studio dei micronuclei nel sangue periferico dei topi: risultati sui dosaggi (file: TS40) Il prodotto è stato iniettato una volta al giorno per 3 giorni in 4 gruppi di 10 topi in diverse dosi fino a 20 ml/kg (50 volte il quantitativo massimo equivalente previsto nel sangue di un soggetto umano adulto). Peso corporeo e comportamento sono stati attentamenti osservati. Durante il test, il comportamento e il peso corporeo di tutti gli animali è rimasto normale. Concentrazioni di prodotto estremamente elevate nel sangue dei topi non causano variazioni comportamentali anomale o negative né variazioni di peso corporeo. 4
5 5) 2005 Studio tossicologico: studio di quattordici giorni sulla tossicità acuta del prodotto nei conigli (file: TS27) Dott. James Clagett, Snohomish, Washington Quattro gruppi di conigli bianchi neozelandesi sono stati sottoposti per 3 giorni a iniezioni di diverse concentrazioni di prodotto o soluzioni saline. Sono state eseguite analisi del sangue complete, comprensive di conta cellulare di leucociti e misurazione di ALT, GLU, BUN, albumina ed ematocrito. È stato eseguito un controllo al microscopio per rilevare eventuali anomalie e istopatologie di colon, esofago, occhi, cuore, reni, intestini, fegato, polmoni, organi riproduttivi, muscoli, milza, stomaco e lingua. Dopo l'esposizione a MDI-P, il rapporto AST:ALT è risultato inferiore del 60% mentre il livello di proteine sieriche e albumina era calato del 48%. Non è stato rilevato alcun segno di tossicità. Concentrazioni di prodotto estremamente elevate nel sangue dei conigli non causano effetti negativi né danni ai tessuti degli organi principali. Le variazioni nella composizione del sangue sono risultate potenzialmente benefiche. 6) Gen Effetti sul comportamento e sul sistema nervoso centrale in topi esposti al prodotto per via nasale (file: TS41) Dott. James Clagett, Snohomish, Washington Quattro gruppi di 5 topi sono stati esposti per un periodo di 28 giorni a vapori nebulizzati del prodotto mediante cono nasale. Il monitoraggio dei volumi respirati e del tasso di respirazione è stato eseguito 3 volte la settimana. Ogni due giorni, per un periodo compreso tra le 15 e le 17 ore, sono stati eseguiti ogni tre minuti campionamenti telemetrici dei movimenti del corpo e della temperatura corporea, per misurare il normale funzionamento del sistema nervoso centrale. Sono stati esaminati campioni di sangue/urina e condotte osservazioni al microscopio su organi selezionati. Il contatto prolungato di vapori del prodotto non ha prodotto alcuna irritazione nei tessuti molli di naso, bocca, gola e occhi. Non è stata rilevata alcuna variazione nella frequenza e nei volumi respiratori, nei marker di sangue/urina o negli organi principali. Non è emersa alcuna prova di danni al sistema nervoso centrale. L'esposizione prolungata al prodotto nebulizzato non provoca irritazione ai tessuti molli di naso, bocca, gola, occhi o polmoni nei topi. La respirazione di prodotto nebulizzato non ha prodotto reazioni tossiche né infiammazioni o danni ad alcun organo principale. 5
6 7) Mar Effetti tossici cardiovascolari, polmonari e residui in cani esposti al prodotto per via nasale (file: TS21, TS32) MPI Research, Mattawan, Michigan Mediante maschera, il prodotto nebulizzato è stato somministrato quotidianamente per periodi di circa 5 ore e per 28 giorni a 1 gruppo di controllo e 3 gruppi di trattamento composti da 4 esemplari di Beagle di sesso maschile e 4 di sesso femminile. Prima, dopo e durante la somministrazione è stata monitorata l'attività cardiovascolare (ECG) e polmonare. Ogni settimana sono state condotte batterie di test per sangue e urine, con emogasanalisi completa. Tutti gli organi e gli apparati principali sono stati sottoposti ad analisi istopatologica completa. Durante la procedura i cani hanno spesso dormito tranquillamente. L'esposizione prolungata al prodotto nebulizzato non provoca irritazione ai tessuti molli di naso, bocca, gola, occhi o polmoni nei cani. Non è stato osservato alcun danno macroscopico o microscopico, né la presenza di marker in sangue o urine o di gas nel sangue. Studi di tossicologia di lungo termine 1) Gen Studio di tossicologia semestrale cronico del prodotto nei topi (file: TS30) Dott. James Clagett, Snohomish, Washington Il prodotto è stato iniettato una volta la settimana per 28 settimane in 4 gruppi di 4 topi in diverse concentrazioni (50 volte il quantitativo massimo equivalente previsto nel sangue di un soggetto umano adulto). Peso corporeo e comportamento sono stati attentamenti osservati. Durante il test, il comportamento e il peso corporeo di tutti gli animali è rimasto normale. L'esame istopatologico di cuore, fegato, reni, milza, intestino e polmoni non ha evidenziato nessuna anomalia per alcun animale. Sul lungo termine, concentrazioni elevate di prodotto nel sangue dei topi non causano variazioni comportamentali anomale o negative né determinano l'insorgere di segni di tossicità o danni ai tessuti. 6
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