Genetica dei microrganismi 2

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1 Genetica dei microrganismi 2

2 Utilità dei mutanti Una mutazione modifica o elimina la funzionalità di un particolare prodotto genico. Si può dedurre la funzione cellulare del prodotto del gene osservando l effetto del cambiamento genotipico sul fenotipo della cellula. L uso dei mutanti ha consentito di determinare le vie di biosintesi degli intermedi metabolici, la regolazione e le risposte all ambiente, la successione di espressione di geni che controllano il ciclo cellulare etc.

3 Fig. 10.1

4 Isolamento di mutanti Screening: mutazione non selezionabile (es. cambiamento colore della colonia) Selezione: mutazione che conferisce al mutante un vantaggio (es. resistenza ad un farmaco)

5 Isolamento di mutanti: selezione positiva

6 Isolamento di mutanti: selezione negativa Fig. 10.2

7 Isolamento di mutanti: selezione negativa

8 Test di Ames Misura il grado di mutagenicità potenziale di una data sostanza. Attualmente in questo test sono stati introdotti due elementi: 1. ceppo batterico che utilizzi esclusivamente una via per il riparo del DNA soggetta ad errori 2. l uso di estratti di enzimi epatici Fig. 10.8

9 Isolamento di ceppi mutanti Espressione fenotipica Dopo la mutagenesi affinché la cellula mutata esprima il corrispondente fenotipo è necessario un periodo di crescita. Questo fenomeno è definito ritardo fenotipico. Questo periodo sarà più breve nel caso di mutazioni dominanti, più lungo nel caso di mutazioni recessive.

10 L arricchimento di cellule mutanti Selezione positiva Selezione negativa

11 L arricchimento di cellule mutanti per la selezione negativa

12 Identificazione dei cloni mutanti Es. 1 - Isolamento di mutanti nel metabolismo: uso del tetrazolio Cellule che fermentano abbassano il ph colonie bianche Cellule che non fermentano colonie rosse Es. 2 - Isolamento di mutanti che accumulano glicogeno: colorazione delle colonie con iodio. Poiché questo trattamento uccide le cellule è necessaria la presenza di una piastra master: la colorazione viene effettuata su una replica.

13 NB: I mutanti condizionali consentono l analisi di geni essenziali in organismi aploidi

14 Selezione e adattamento Le colture pure sono veramente costituite da cellule geneticamente identiche? La crescita dei microrganismi in condizioni di laboratorio li rende leoni o tartarughe?

15 Genetica dei microrganismi scambi genici e ricombinazione Capitolo 10 Brock Capitolo 11 Stanier Capitolo 13 Prescott

16 La ricombinazione genetica La ricombinazione genetica comporta lo scambio fisico tra elementi genetici diversi. La ricombinazione omologa è molto importante e complessa (circa 25 geni in E. coli) che esistono più sistemi ridondanti. Il processo inizia con un taglio, quindi il filamento viene divaricato da proteine con attività elicasica. Il complesso RecBCD contiene sia attività nucleasica che elicasica. Una proteina che lega il DNA a singolo filamento si associa al filamento di DNA (SSB), seguita dalla proteina RecA

17 La ricombinazione genetica Questo complesso facilita il riappaiamento con la sequenza complementare nel duplex adiacente mentre avviene lo scostamento del filamento residente (invasione del filamento). Dopo l appaiamento può avvenire lo scambio con la formazioni di estese regioni eteroduplex, dove ciascun filamento è originato da cromosomi differenti. Infine si ha la risoluzione dell eteroduplex ad opera della nucleasi e ligasi

18 Ricombinazione non reciproca: modello di Fox Nella ricombinazione non reciproca, soltanto una delle due doppie eliche conserva la sua lunghezza originaria. Un pezzo del DNA donatore viene inserito, il resto viene degradato dalle nucleasi. Una ricombinazione non reciproca si verifica durante la trasformazione batterica.

19 Destino dei marcatori genetici Nell eteroduplex si possono avere degli appaiamenti difettosi. Il destino di un eteroduplex può seguire due vie: 1 - la regione eteroduplex viene duplicata dando luogo a due omoduplex ovvero, le sequenze segregano l una dall altra. 1 - un filamento dell eteroduplex viene eliminato e rimpiazzato da un nuovo filamento di DNA (riparazione dell appaiamento difettoso = mismatch repair).

20 Genetica batterica

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22 Trasformazione batterica

23 La trasformazione avviene in natura, ma non tutti i batteri possono essere trasformati naturalmente

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25 Trasformazione naturale in Streptococcus pneumoniae Il fattore di competenza viene sintetizzato durante la fase di crescita esponenziale. Affinché la trasformazione avvenga, il DNA donatore deve essere di grandi dimensioni (0,3/8X10 6 Dalton) e a doppia elica. L idrolisi di uno dei due filamenti di DNA fornisce l energia per far penetrare il filamento intatto. Streptococcus pneumoniae assorbe DNA di qualsiasi origine, ma solo DNA che trova una regione di omologia con il cromosoma verrà integrato nell ospite.

26 Trasformazione naturale Nella maggior parte dei batteri la competenza è regolata e vi sono proteine specifiche che hanno il compito di prelevare e processare il DNA. Uno dei meccanismi di attivazione della competenza in Bacillus fa parte di un sistema quorum-sensing regolato da un sistema a due componenti. Le cellule producono un peptide che, quando si accumula, agisce su un sensore (ComP) che trasmette il segnale ad una proteina regolatrice (ComA) che attiva i geni della trasformazione.

27 Formazione dell eteroduplex

28 Fase di eclissi del DNA trasformante Se si usa il DNA di un ceppo trasformato per un ulteriore trasformazione, solo dopo un certo periodo di tempo questo DNA assume la capacità trasformante. Spiegazione: per ottenere la trasformazione è necessario utilizzare DNA a doppia elica. In un primo momento il DNA si trova all interno della cellula in forma di singolo filamento e quindi perde la sua capacità di trasformare un altra cellula.

29 Trasformazione naturale in Haemophilus E indispensabile la presenza di una sequenza di DNA di 11 basi (5 AAGTGCGGTCA3 ) presente 600 volte nel genoma (una ogni 4000bp). Per questo motivo si può ottenere la trasformazione solo con DNA omologo. Dopo l aggiunta del DNA omologo le vescicole all esterno scompaiono e ne compaiono alcune all interno delle cellule. Queste vescicole vengono definite trasformasomi influenzae

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31 Trasformazione artificiale Young cells are incubated with a CALCIUM CHLORIDE SOLUTION for approximately 30 min on ice. In some cases magnesium is also present. The cells are concentrated and suspended as a thick suspension in the calcium solution. The cells may be mixed with reagents like glycerol and stored at -80oC for later use or they may be used immediately. Cell-free DNA is then mixed with these competent cells on ice for approximately 30 min followed by a brief mild heating (42 C 3 ). The transformed cells are incubated in a rich medium for approximately 1 to 1.5 hr. and then plated on medium containing materials that will detect the presence of the transformed genes.

32 Trasformazione artificiale L elettroporazione è una tecnica che consiste nell esporre la cellule a campi elettrici pulsanti, in modo da aprire piccoli pori nella membrana, attraverso i quali possono entrare molecole di DNA presenti al di fuori delle cellule. Viene usata per procarioti, eucarioti, Archaea e batteri

33 Coniugazione batterica

34 Coniugazione batterica Nella coniugazione lo scambio dipende dal contatto fisico tra cellule, avviene anche in presenza di DNasi ed è polarizzato

35 Coniugazione batterica Caratteristiche del plasmide F rep: geni che ne permettono la replicazione inc: geni per l incompatibilità (IncF1) phi: inibizione dei fagi finp: inibizione della fertilità tra: geni (13) necessari per il trasferimento (occupano circa 30 kbp). I geni tra del plasmide F sono sempre derepressi. Tra questi ci sono geni che codificano la sintesi dei pili F (pili sessuali). I pili F si legano alla proteina OmpA situata sulla membrana esterna delle cellule F -, dando inizio alla coniugazione OriT: punto in cui viene prodotta una rottura (Origine del Trasferimento); successivamente ha inizio la replicazione tramite il meccanismo del cerchio rotante. La molecola di DNA potrebbe passare all interno del pilo o in un altro punto di contatto All interno della cellula F - la molecola di DN A viene replicata e ricircolarizzata geni Tra B C F H G S D K E L A J finp OriT IS3 Plasmide F inc rep γδ phi IS3 IS2

36 Coniugazione batterica I pili F si legano alla proteina OmpA In F viene prodotta una rottura nel sito OriT e la replicazione avviene con il meccanismo del rolling circle

37 Coniugazione batterica F viene replicato e ricircolarizzato nella cellula ricevente Le due cellule sono ora entrambe F +

38 Ceppi Hfr (High frequency of recombination) In questi ceppi il plasmide F è integrato nel cromosoma batterico Durante la coniugazione vengono trasferiti anche geni cromosomici I ceppi Hfr si formano a causa di un crossing-over tra regioni omologhe presenti nel cromosoma batterico e nel plasmide F (sequenze d inserzione IS) I ceppi riceventi divengono F + solo se rimangono in contatto un tempo sufficiente per il trasferimento dell intero cromosoma (100 min circa). La porzione che entra nella cellula ricevente può essere degradata oppure incorporata nel genoma dell F - per ricombinazione.

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41 Esperimento di incrocio interrotto Poiché il trasferimento del DNA avviene a velocità costante (40kbp/min), la coniugazione Hfr può essere usata per mappare le posizioni dei geni batterici Per questo motivo sulla mappa genetica di E. coli la posizione dei geni è espressa in minuti. Si possono mappare i geni che si trovano nel primo terzo di cromosoma. Utilizzando diversi ceppi Hfr in cui il plasmide F è integrato in diversi siti, si possono mappare tutti i geni

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44 Coniugazione F A volte, quando il plasmide F si stacca dal cromosoma batterico, si possono avere degli errori e alcuni geni cromosomali vengono trasferiti (excisione imperfetta). In un trasferimento il ricevente diventa parzialmente diploide (merodiploide). La coniugazione F è importante perché 1 - il comportamento del diploide parziale mette in evidenza se una mutazione è dominante o recessiva 2 - è utile nella mappatura: se due geni vengono inseriti in un fattore F devono essere vicini. Questo tipo di trasferimento viene anche chiamato sexduzione.

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46 Trasferimento di altri plasmidi mediato da F Il plasmide F è capace di promuovere il trasferimento di altri plasmidi incapaci di trasferimento autonomo (es. ColE1) con un meccanismo simile al trasferimento di se stesso. La capacità di un plasmide di essere mobilizzato dipende dalla presenza di una regione specifica del DNA chiamata mob.

47 Altri sistemi coniugativi nei batteri Gram - Il plasmide F può replicarsi in tutti i batteri enterici. In altri batteri Gram - esistono comunque plasmidi coniugativi. A volte la frequenza di trasferimento è molto bassa e viene aumentata dalla presenza di una sequenza di inserzione. Es R68: ha la capacità di replicarsi in molti batteri (ampio spettro di ospiti); si trasferisce con alta frequenza e con bassa frequenza mobilizza il cromosoma batterico o altri plasmidi. R68.45 mobilizza il DNA cromosomico di P. aeruginosa con frequenza 10 5 superiore rispetto a R68. La differenza tra i due è la presenza di una sequenza d inserzione IS21 di 2,1 kb. Le sequenze IS21 non sono presenti sul cromosoma quindi la ricombinazione omologa non è alla base del meccanismo di mobilitazione del cromosoma; si tratta piuttosto di un meccanismo di trasposizione che genera un integrazione transitoria di R68.45 nel cromosoma.