Indirizzo: GENOMA - Molecular Genetics Laboratory, Via di Castel Giubileo, Rome, Italy

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1 L IMPORTANZA DI DETERMINARE IL LIMITE DI DETECTION DELLA FRAZIONE FETALE DELLE METODICHE DI SCREENING PRENATALE NON INVASIVO Francesco Fiorentino*, Sara Bono, Francesca Pizzuti, Martina Mariano, Arianna Polverari, Sara Duca, Mariateresa Sessa, Marina Baldi, Laura Diano, Francesca Spinella. La frazione fetale (FF), cioè la quantità di cell free (cfdna) fetale rilevata nel campione di plasma analizzato rispetto al cfdna totale, è un parametro importante da determinare con l'esecuzione dei test NIPT, in quanto a FF molto basse le aneuploidie potrebbero non essere rilevabili, e quindi produrre risultati falsi negativi. Per ridurre tale rischio, alcune metodiche NIPT attualmente in uso utilizzano un cut-off del 4% di frazione fetale. A valori di FF inferiori a tale cut-off, viene refertato un risultato non conclusivo a causa di bassa quantità di DNA fetale e viene richiesto un nuovo prelievo. In questo studio ci siamo proposti di individuare il valore minimo di FF, definito come Limit Of Detection (LOD), a cui una metodologia NIPT basata sul sequenziamento massivo parallelo (Massively Parallel Sequencing, MPS) è in grado di identificare una aneuploidia cromosomica. Per definite il LOD è stato usato un modello sperimentale di campioni contenenti diverse concentrazioni di FF ottenute mescolando campioni di plasma euploidi e aneuploidi a frazioni fetali note. Determinato un LOD di FF> 2% LOD, sono stati analizzati 7103 prelievi ematici di donne che si sottoponevano allo screening per le aneuploidie fetali comuni. I risultati ottenuti hanno dimostrato che la tecnologia adottata è capace di rilevare la presenza di feti con trisomia (T) 21, T 18 e T13 in campioni di sangue con livelli di FF uguale o superiori al 2%. Tra i campioni analizzati 105 erano aneuploidi e di questi 25 (23.8%) avevano una FF compresa tra il 2% ed il 4%. In questi campioni l incidenza delle aneuploidie era significativamente più elevata rispetto a quella dei campioni con FF 4% (23,8% vs. 1.1%; p=0.001). La sensibilità del test sul cfdna per le T21, T18, T13 è stata del 100%, con una specificità del 99.99% per T21 e T18, e del 100% per T13. I risultati di questo studio dimostrano che la definizione di uno specifico LOD permette di identificare un elevato numero di aneuploidie (23.8%) non rivelabili utilizzando un limite arbitrario del 4%. Queste aneuploidie possono essere identificate con un elevato grado di accuratezza, limitando il numero di cancellazioni e/o ripetizioni del test. Lo studio suggerisce di riconsiderare il limite attuale di FF e di calcolarne quello reale per ciascuna specifica metodologia NIPT adottata per lo screening delle aneuploidie fetali. INTRODUZIONE Il test prenatale non invasivo (Non-Invasive Prenatal Testing NIPT), basato sull analisi del DNA di origine fetale libero, (cell-free DNA, cfdna), circolante nel plasma materno è stato rapidamente integrato nella pratica clinica per il rilevamento delle aneuploidie fetali comuni, come la trisomia (T) 21 la T18 e la T13 1. L elevata sensibilità e specificità delle diverse metodologie NIPT, dimostrata da molteplici studi clinici 2 e dall'approvazione al suo uso da parte delle organizzazioni professionali mediche, ha portato all adozione della NIPT come tecnica ordinaria per lo screening delle aneuploidie nelle gravidanze ad alto rischio. 3-7 Per l analisi delle aneuploidie mediante NIPT si utilizzano differenti metodologie basate sulle tecniche di sequenziamento di seconda generazione Next-Generation Sequencing, NGS, che prevedono il sequenziamento dell intero genoma attraverso il Massive Parallel Sequencing, MPS 8-10, o di specifiche regioni o polimorfismi di singoli nucleotidi (SNP) 11,12. Inoltre, negli ultimi anni si è assistito ad una considerevole diminuzione dei costi delle analisi che ha favorito l'ampia diffusione di questi sistemi. I risultati emersi dai diversi trials hanno mostrato un'elevata efficacia della tecnologia nella definizione di queste cromosomopatie, in particolare nella determinazione della trisomia 21 (T21). Queste metodologie si basano sulla capacità di rilevare incrementi proporzionali del cfdna fetale rispetto a quello materno largamente più rappresento. Il plasma materno contiene percentuali variabili di FF, che differiscono nei diversi campioni. La FF media riscontrabile nel plasma di una donna alla X- XX settimana di gravidanza, è di circa il 10% 11-15, e può variare tra <4% ed il 40%. Indipendentemente dalla metodologia applicata, la possibilità di ottenere un risultato valido è principalmente correlato alla proporzione della FF. La FF è un valore determinante dell accuratezza dell analisi In presenza di una gravidanza in cui è presente un feto con una trisomia, il cfdna derivante dal cromosoma in eccesso aumenterà la proporzione del cfdna fetale per quel cromosoma rispetto alla proporzione di cfdna atteso in condizioni di gravidanze normali di riferimento. 1 Indirizzo: GENOMA - Molecular Genetics Laboratory, Via di Castel Giubileo, Rome, Italy

2 La capacità di rilevare l incremento della quantità di cfdna fetale per un determinato cromosoma, e quindi l aneuploidia, è direttamente correlato con la FF Se nel sangue materno è presente una quantità sufficiente di FF, l analisi produrrà una conta accurata dei frammenti circolanti aggiuntivi rilasciati dal cromosoma soprannumerario del feto. La capacità di distinguere gravidanze aneuploidi da quelle euploidi è più elevata nei campioni con quantità maggiore della FF. Nei casi con alti valori della FF il test avrà una migliore performance. Al contrario, se la FF è troppo bassa la presenza di una aneuploidia potrebbe essere mascherata dall eccessiva quantità di cfdna materno euploide, aumentando il rischio di ottenere falsi negativi 16. Per questo motivo, molti degli attuali test clinici richiedono che, per un accurato risultato del test, sia presente nel sangue materno un livello definito di FF. Il valore minimo di FF comunemente adottato è di circa il 4%. Al di sotto di questo valore il risultato non viene considerato attendibile e la risposta viene indicata come fallimento del test 14,17,18 Il valore minimo del 4% è stato definito mediante modelli statistici basati sul numero minimo di letture dei frammenti del cromosoma aneuploide sufficiente per evidenziare l aneuploidia fetale in funzione di diversi livelli di FF 16,17,19. Secondo questo modello, a bassi livelli di FF, le differenze nel cfdna circolante tra gravidanze con trisomie fetali e gravidanze con feti euploidi potrebbero non essere rilevato 13, 20, 21, causando falsi negativi. Nonostante molti test adottino un valore della FF>4% per assicurare una elevata attendibilità ed un ridotto numero di insuccessi o fallimenti, ad oggi non sono stati effettuati studi per verificare il reale limite minimo di rilevamento, limit of detection (LOD), cioè il valore più basso di FF al quale una specifica metodologia possa identificare una aneuploidia fetale. Questo studio si propone di determinare il LOD dell analisi NIPT basata sulla tecnologia MPS e valutarne la specificità e sensibilità in pazienti con una FF<4%. Materiali e metodi Disegno dello studio. Lo studio è stato organizzato in tre fasi. Nella prima, è stato eseguita una analisi retrospettiva su campioni di plasma congelato ottenuto da donne che si erano sottoposte alla diagnosi prenatale invasiva. I campioni sono stati analizzati applicando una metodologia NIPT basata sul MPS. I risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti dall analisi del cariotipo fetale mediante test prenatali invasivi (villocentesi o amniocentesi). Lo scopo è stato quello di definire i parametri NIPT di classificazione dei campioni euploidi ed aneuploidi. Nella seconda fase, è stato realizzato un modello sperimentale di campioni con differenti percentuali di FF, compresi tra 1% e 4%. A questo scopo campioni aneuloidi con una FF nota sono stati diluiti con campioni euploidi con la stessa FF. I campioni ottenuti, contenenti ciascuno una diversa percentuale di FF, sono stati analizzati usando la metodologia NIPT basata su MPS con l obbiettivo di stabilire il LOD per ciascuna aneuploidia fetale. Nell ultima fase il protocollo NIPT è stato applicato per l analisi clinica di 7103 campioni di donne in gravidanza che richiedevano una analisi NIPT su cfdna. Lo scopo è stato quello di stabilire l accuratezza del test in campioni con FF<4%. Preparazione dei campioni, sequenziamento e classificazione dei risultati. I campioni di plasma sono stati processati per l estrazione del cfdna mediante in kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) seguendo il protocollo indicato. Dopo aver ottenuto delle librerie geniche mediante il kit TruSeq nano Kit (Illumina) dal cfdna estratto dal plasma materno, i frammenti di cfdna, sono stati processati usando il sequenziatore HiSeq2500 (Illumina). Lo strumento ha generato una media di 16 milioni di letture per campione su specifiche zone dell intero genoma. Il numero di queste letture è stato confrontato con il valore ottenuto da un genoma euploide di riferimento. I dati sono stati analizzati mediante l algoritmo SAFeRTM (Illumina), che allineando il numero di letture con un cromosoma di riferimento (hg19, ottenuto dal database UCSC) ha prodotto una misura statistica chiamata Normalized Chromosome Value (NCV) per il cromosoma 13, 18 e 21. Il valore NCV è basato sull analisi della ratio (R) cioè del rapporto tra il numero normalizzato di lettura dei frammenti del cromosoma da testare (test) e quello del cromosoma di riferimento (reference), e rappresenta la deviazione standard della differenza dalla media della ratio (R) di un campione diploide. Il valore NCV per ciascun campione (k) e cromosoma (i) viene calcolato come segue 10 : NCV ki = Rki R ui σ ui

3 in cui σ ui è la deviazione standard ottenuta da un set di campioni con soli cromosomi euploidi (u=unaffected). La media della ratio (R ui ) per il valore di un cromosoma euploide viene calcolata dallo stesso campione euploide. Il valore di R ki per i cromosomi 21, 18, 13, X and Y è determinata individualmente per ciascun cromosoma. L NCV minimizza le variazioni presenti all interno e tra le diverse sequenze, ed è stato utilizzato per la successiva classificazione dei campioni clinici in esame in questo studio. Seguendo i criteri comunemente adottati nei laboratori che eseguono NIPT mediante analisi cfdna 22,23 i campioni sono stati classificati in base ai valori di NCV per ciascun cromosoma secondo la seguente classificazione: affetto o aneuploide per un valore di NCV 4; non affetto o euploide per un valore di NCV <3; con sospetta aneuploidia per un valore 3<NCV<4. Per la classificazione del sesso sono stati usati i seguenti parametri22: femmina se per il cromosoma X, il valore è -2.5<NCV<2.5 e per il cromosoma Y, il valore di NCV è <2.5; maschio se, per il cromosoma X, il valore è NCV è <-4 e per il cromosoma Y, NCV è >33; se i valori di NCV per X e Y non rientrano in queste categorie, il campione viene indicato come non classificabile per il sesso. Misurazione della Frazione Fetale La frazione fetale (FF) è stata stabilita in base al conteggio dei frammenti cromosomici ottenuti mediante MPS (MPS tag-count) per il cromosoma X, in campioni con feto maschile, e/o per il cromosoma aneuploide nei campioni con feto aneuploide, come riportato in precedenti studi 24. Per la determinazione della FF nei campioni aneuploidi è stata applicata la seguente formula 24 : FF = 2x R Ai R ui 1 In cui R Ai è la ratio per un cromosoma affetto (non euploide) i e Ru è la ratio per il cromosoma non affetto (euploide) i. Per la determinazione della FF nei maschi, è stata usata la seguente formula: FF = 2x 1 R Ax R ux In cui R Ax è la ratio per il cromosoma X nei campioni maschi (una copia del cromosoma X) and R ux è la ratio per il cromosoma X nelle femmina (2 copie del cromosoma X). Il metodo non può essere usato per la quantificazione della FF per campioni ematici di donne con feti normali femmine 25. Consulenza prenatale Tutti i pazienti che si sono sottoposti a NIPT hanno ricevuto una consulenza prenatale da parte di un genetista del nostro centro. Durante la consulenza prenatale sono state analizzate le motivazioni del ricorso dei pazienti allo screening; sono stati fornite le informazioni sul protocollo NIPT, fornendo i dati sulla sensibilità, specificità e valore predittivo del test. I potenziali rischi e benefici del test NIPT sono stati ampiamente esposti offrendo anche le varie opzioni per test alternativi. Inoltre, è stato offerto una consulenza post-test in tutti quei casi in cui è stata evidenziata una aneuploidia cromosomica. Il consenso informato è stato firmato da tutte le pazienti che si sono sottoposte all analisi. Lo studio è stato approvato dalla commissione di revisione interna del laboratorio Genoma. Risultati Definizione dei parametri di classificazione (studio retrospettivo). Per lo studio retrospettivo sono stati analizzati 2006 campioni di plasma, di cui 2000 (99.7%) rispettavano i parametri metrici di qualità e hanno ricevuto un risultato. Le caratteristiche dei pazienti inclusi in questa analisi sono descritte nella tabella supplementare 1. I valori di NCV ottenuti con l analisi NIPT sono stati confrontati con i risultati del follow up delle pazienti. Come mostrato nel grafico della figura 1, 1969 su 2000 campioni diagnosticati con un cariotipo fetale normale avevano un valore di NCV compreso tra -3.5 e Dei restanti campioni diagnosticati con un cariotipo aneuploide (n=31), quelli con trisomia 21 (T21, n=25) mostravano un NCV tra 6.5 e 11.8, quelli con T18 (n=4) mostravano un NCV tra 6.5 and 11,8, e

4 quelli con T13 un NCV di 7.7 e 24.7 (Figura 1). Il 99.8% dei campioni euploidi mostrava un NCV minore di 3, mentre nell 87% dei campioni il valore di NCV era maggiore di 4. Quattro campioni euploidi e 4 aneuploidi avevano un NCV compreso tra 3 e 4. Sulla base dei parametri di classificazione attualmente adottati dai laboratori che eseguono questo tipo di screening, i campioni con NCV>4 sono stati classificati come aneuploidi, e quelli con NCV<3 euploidi. Un attenta analisi di questi risultati ci ha permesso di adattare i valori di soglia euploide/aneuploide, usualmente 2.5<NCV<3, ad un valore compreso tra 3 e 4. Questo ha permesso di mantenere un margine di sicurezza per tutti quei campioni i cui valori ottenuti erano borderline, cioè al limite tra quelli aneuploidi ed aneuploidi. Di conseguenza per quei campioni con un valore di NCV compreso tra 3 e 4, i risultati sono stati riportati come casi con sospetta aneuploidia. Questi tre campi di valori NCV sono stati adottati per la classificazione dei campioni analizzati nello studio prospettico. Determinazione del LOD Per determinare il limite minimo di FF al quale è possibile identificare una aneuploidia, sono stati analizzati una serie di 156 campioni con diversi livelli di FF ottenuti sperimentalmente (Tabella Supplementare 2). I valori di NCV per i cromosomi 21, 18 e 13 ottenuti da ciascun campione sono stati correlati con la percentuale di FF. L analisi ha dimostrato che i valori di NCV e FF correlavano linearmente e che tutti i campioni con una percentuale di FF>2% avevano un valore di NCV>3. In particolare, i risultati hanno evidenziato che il campione con il più basso valore di NCV per il cromosoma 21 aveva una FF di 2%, per il cromosoma 18 una FF di 1.5%, e per il cromosoma 13 di 1,68 (Figure 2). Questi risultati hanno dimostrato che il più basso valore al quale tutte e tre le aneuploidie sono state identificate era del 2%. Questo valore è stato identificato come LOD ed utilizzato nelle analisi successive. Applicazione clinica del LOD (studio prospettico) Per questo studio sono stati analizzati 7103 campioni di plasma materno. Le caratteristiche dei pazienti sono elencati in Tabella 1. L età media dei partecipanti allo studio era di 36.4±4.7 e l età gestazionale era compresa tra 10 settimane e 30 settimane (media 12.8 settimane ±2.3 giorni). Dei 7103 campioni raccolti, 21 (0.3%) non rientravano nei parametri metrici di qualità del test e 7082 sono stati processati e hanno dato un risultato.

5 Dall analisi dei dati si evince che il 99.9% dei campioni con un cariotipo fetale normale avevano un NCV compreso tra -3 e +3, mentre il 100% dei campioni aneuploidi avevano un NCV>3. In particolare, i campioni con una Trisomia 21 (T)21 (n=77) avevano un NCV compreso tra 3.18 e 33, quelli con T18 (n=21) avevano un NCV compreso tra 6.5 e 11.8, e quelli con T13 (n=9) avevano un NCV compreso tra 7.7 e Inoltre, sono stati identificati 10 campioni con 3<NCV<4 classificati come casi con aneuploidia sospetta. I risultati dell analisi del cariotipo molecolare ottenuti dalla diagnosi prenatale invasiva, hanno confermato che 8 di questi casi con aneuploidia sospetta erano aneuploidi. Mentre due casi con aneuploidia sospetta, uno con T21 ed uno con T18 con un valore di NCV rispettivamente di 5.2 e 5.03, sono stati diagnosticati dall analisi invasiva non-affetti (Figura 3). In totale 105 campioni su 107 trisomici sono stati confermati dai risultati del cariotipo fetale ottenuto mediante analisi prenatale invasive. a cariotipo fetale mediante diagnosi prenatale invasiva Tra i campioni con un risultato, 79 (1.1%) sono stati cancellati per insufficiente quantità di cfdna fetale (FF<2%) (Tabella 2). I valori di NCV ottenuti dal test per il cromosoma 21, 18 e 13 sono mostrati in Figura 3. b età >35 anni

6 a, Fallimento dei criteri metrici del test; b Cariotipo fetale confermato da test prenatali invasivi. Nessun falso negativo è stato rilevato. La sensibilità del test è stata del 100% per T21, T18 e T13. La specificità è stata del 99.98% per T21 e T18 e del 100% per T13 (Tabella 3). Calcolo dell accuratezza del test in campioni con bassa livelli di FF Per analizzare l influenza dei campioni con bassi livelli di FF nella performance del test basato sul rilevamento del cfdna, i campioni aneuploidi sono stati divisi in base ai livelli di FF. Come mostrato nella figura 4A, delle 105 aneuploidie confermate, 25 (23.8%) avevano una FF compresa tra il 2% ed il 4% (Tabella 2 e Figura 4). In particolare, 17 aneuploidie sono state identificati come T21, 3 come T18 e 5 come T13 (Tabella 2 and Figure 4). Queste aneuploidie non sarebbero state rilevate se il test avesse usato come limite minimo il valore di FF>4%. L analisi statistica di questi dati ha dimostrato che esiste un incremento di circa 6-volte (p>0.001) dell incidenza delle aneuploidie nei campioni con una 2%<FF<4% versus quelli con una FF>4% (Tabella 4). All interno del gruppo con 2%<FF<4%, sono stati identificati 2 falsi positivi, un caso con T18 ed un caso con T21 (Tabella 4 e Figura 4). Per calcolare l incidenza delle aneuploidie nel gruppo di pazienti con una FF<4% rispetto a quelle con una F>4%, l analisi è stata limitata ai pazienti con feti maschi. Tra questi il 93% aveva una frazione fetale >4% e 310 (8.5%) una FF<4% di cui 231 (6.4%) con una 2%<FF<4% e 79 (2.2%) FF<2% (Tabella 4 e Figura Supplementare 1A). Per tutti questi campioni con una FF<2% è stato effettuato un secondo prelievo e tutti sono stati correttamente diagnosticati normali. L incidenza delle aneuploidie tra i campioni con una FF>4% era dell 1.1% (36/3318), mentre quella dei campioni con 2%<FF<4% era 6.9% (16/231) (Tabella 4 e Figura Supplementare 1B)

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8 Discussione Un potenziale limite alla prospettiva di offrire lo screening delle principali aneuploidie autosomiche mediante NIPT, come metodo routinario nella pratica clinica, è rappresentato dalla possibilità di ottenere un fallimento del test, dovuto principalmente alla presenza di bassi livelli di frazione fetale nel sangue materno. Infatti, mentre i metodi convenzionali di screening riportano solo rari casi di fallimento, le metodologia basate sul rilevamento del cfdna riportano nell 1-8% dei casi un fallimento o cancellazione del test dovuto ai bassi livelli di cfdna fetali. La frazione fetale tipicamente aumenta con l età gestazionale ed è negativamente correlata con il peso materno 15,16,26. La probabilità di insuccesso, o fallimento, del test dipende dalla possibilità del metodo di misurare o meno la FF dal limite minimo della FF applicato dalla metodologia e in parte, dalla profondità di lettura adottata dal metodo. 2,11,13,14,22,23, In molti laboratori il valore minimo di FF richiesto per un rilevamento accurato del test su cfdna è il 4% 16,17. I risultati ottenuti in campioni con valori di FF inferiori del 4% sono considerati non attendibili e vengono riportati come risultato non informativo o fallimento del test. In questo studio la validazione e applicazione clinica del protocollo NIPT con un valore limite della FF del 2%, ha permesso di identificare 25 (23.8%) aneuploidie in cui la FF era compresa tra il 2 ed il 4% con alti livelli di accuratezza del test. Queste pazienti con un alto rischio di aneuploidie non sarebbero state identificate utilizzando il limite del FF>4%. Questi risultati indicano che con la metodologia NIPT è possibile eseguire il test anche su campioni con bassi livelli di cfdna fetale senza ridurre l accuratezza dello screening delle aneuploidie fetali basato sul cfdna circolante. Infatti, dall applicazione clinica del test non è stato ottenuto nessun falso negativo. Inoltre i valori di sensibilità e specificità del test non sono stati influenzati dalla presenza di campioni con bassi livelli di FF. L applicazione di un protocollo NIPT capace di analizzare con accuratezza anche campioni con bassi livelli di FF offre numerosi vantaggi. Uno dei più importanti è quello di poter ridurre il numero delle cancellazioni del test e di conseguenza abbassare l incidenza delle ripetizioni del prelievo del sangue materno. Infatti, l 8.5% dei campioni con una FF<4% analizzati in questo studio, sarebbero stati riportati

9 senza alcun risultato se si fosse adottato il limite comunemente usato da altri laboratori. Applicando il limite ottenuto dagli esperimenti di LOD, è stato possibile ridurre al 2.2% il numero dei casi con nessun risultato e di conseguenza delle ripetizioni del test. Nonostante la ripetizione del test rappresenti una delle scelte a cui il paziente può rivolgersi in caso di fallimento del test dovuto a bassi livelli di FF, questo potrebbe allungare i tempi dello screening e ritardare la diagnosi di una eventuale aneuploidia. In considerazione del fatto che solo nel 50-60% dei casi la ripetizione del test garantisce un risultato 3,15,27,29,31, un fallimento del test potrebbe ridurre le potenzialità riproduttive del paziente. Una metodologia NIPT capace di ottenere accurate risultati anche a basse livelli di frazione fetale potrebbe rappresentare una valida strategia per quelle pazienti in sovrappeso 15,17,26. Infatti uno dei fattori associati alle basse percentuale di cfdna fetale, con la conseguente possibilità di fallimento del test, è un aumentato peso corporeo materno. L aumentata quantità del cfdna materno in donne obese potrebbe, infatti, mascherare la frazione fetale rendendo difficoltoso lo screening delle aneuploidie. Quindi, nelle donne in forte sovrappeso l utilizzo di una metodologia NIPT capace di rilevare anche basse FF, potrebbe ridurre le possibilità di un fallimento del test mantenendo un alto grado di accuratezza e rappresentare quindi una opzione alle comuni metodologie di screening basate su cfdna fetale maggiore del 4%. In quei casi in cui è stato registrato un fallimento del test a causa dei bassi livelli di frazione fetale è stato osservato un significativo aumento dell incidenza delle aneuloidie fetali. Recentemente Norton et al. 29 hanno riportato la presenza di aneuploidie cromosomiche nel 4.7% delle gravidanze che a causa dei livelli di FF<4% non avevano dato un risultato, mentre nei campioni in cui era stato riportato un risultato i casi con aneuploidia fetali erano dello 0.4%, riportando un incremento di circa 10 volte dell incidenza delle aneuploidie. Risultati simili sono stati ottenuti da Pargament et al. 27, i quali riportano che nei campioni con bassi livelli di FF le possibilità che siano presenti delle aneuploidie è 4 volte superiore rispetto ai campioni con una FF>4%. In questo studio è stato rilevato un incremento dell incidenza delle aneuploidie pari a 6 volte (6.8% vs 1.1%, p<0.001) nei campioni con 2%<FF<4% in confronto ai campioni con una FF>4%. Questi risultati confermano che una bassa frazione fetale è associata ad un aumentato rischio di aneuploidie fetali e sottolineano l importanza di analizzare anche quei campioni con una FF<4%, adottando metodologie NIPT accurate anche in presenza di casi con bassi livelli di frazione fetale. I risultati riportati da questo studio sottolineano anche l importanza di come gestire le gravidanze che presentano queste caratteristiche 3-5,32. Infatti la decisione delle strategie da adottare nei casi in cui non si ottengano risultati a causa della bassa FF, sono diverse e dipendono da una serie di fattori come l età materna, le risposte dei test dei markers plasmatici, cosi come dalla preferenza del paziente. In ogni caso prima di procedere con un secondo prelievo, considerando le basse probabilità di successo, nei comuni protocolli viene offerta, alle donne che non hanno avuto nessun risultato dalla NIPT, l opzione di un test diagnostico invasivo. Un alternativa potrebbe essere quella di usare la metodologia NIPT con relativo LOD applicando una maggiore profondità di sequenziamento 19. É importante notare che la performance della maggior parte dei protocolli NIPT è calcolata sui campioni che hanno una minima quantità di FF. La dimostrazione di una aumentata incidenza delle aneuploidie fetali in quei campioni con FF<4% suggerisce che questi campioni dovrebbe essere inclusi nel calcolo della performance di un test. Infatti, se i casi esclusi perché con bassa FF fossero stati considerati nella valutazione dell accuratezza del protocollo NIPT, avrebbero abbassato l incidenza di rilevamento del test, riportando un risultato più reale del calcolo della performance del test 30. Bibliografia 1. Chitty LS, Bianchi DW. Noninvasive prenatal testing: the paradigm is shifting rapidly. Prenat Diagn 2013;33: Gil MM, Quezada MS, Revello R, et al. 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11 Tabella Supplementare 1. Caratteristiche dei pazienti (studio retrospettivo) Caratteristiche n N. dei campioni analizzati 2006 Età materna- anni - Media ±DS 36.9±4.4 - Minimo-massimo Età gestazionale al prelievo -settimana - Media ±DS 12.9±2.3 - Minimo-massimo Campioni con un risultato n Cancellazioni del test (%) a 6 (0.3) N. dei campioni aneuploidi (%) 31 (1.6) - T T T 13 2 Indicazioni per la NIPT a - Ansietà Età materna avanzata b Screening prenatale positivo Positività a test ecografici 20 - Precedente gravidanza con feto aneuploide 30 - Più di una delle precedenti indicazioni 610

12 Tabella Supplementare 2. Campioni sperimentali usati per la determinazione del LOD FF T 13 T 18 T 21 N. dei campioni N. dei campioni N. dei campioni 0% % % % % % Totale

13 FF >4% 93,5% FF<4% 8,7% 2% < FF < 4% 6,5% FF < 2% 2,2% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% FF >4% 1,1% FF<4% 5,1% *** 2% < FF < 4% 6,8% FF < 2% 0,0% 0,0% 2,0% 4,0% 6,0% 8,0% Figura Supplementare 1. Distribuzione campioni clinici maschi in base alla FF (A) Il grafico mostra la frequenza relative dei campioni euploidi ed aneuploidi in base alla percentuale di FF. (B) Il grafico rappresenta l incidenza delle aneuploidie nei campioni in base alla loro percentuale di FF. L analisi ha rilevato un incremento statisticamente significativo (***p<0.001) di circa 6-volte dell incidenza delle aneuploidie nei campioni con una 2%<FF<4% rispetto a quella con una FF>4%.