ANALISI GENETICHE su DNA FETALE CIRCOLANTE

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Biaggio Giordano
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1 Università degli Studi - Azienda Ospedaliera Padova UOC di GENETICA CLINICA ED EPIDEMIOLOGICA Direttore Prof. Maurizio Clementi ANALISI GENETICHE su DNA FETALE CIRCOLANTE

2 Non Invasive Prenatal Diagnosis (NIPD) 1997

3 Il DNA fetale circolante Placenta Maternal plasma Maternal blood cells Nel plasma materno è presente DNA cell-free di provenienza sia materna che fetale Entrambe le frazioni sono presenti in quantità molto limitate, sono costituite da frammenti di DNA molto corti e rappresentano l intero genoma

4 The cell-free fetal DNA 2004

5 Identificabile dalla 5 Possibile PD dalla 7 Affidabile dalla 9 The cell-free fetal DNA

6 The cell-free fetal DNA

7 Il DNA fetale circolante Il DNA fetale proviene principalmente dalla placenta e costituisce il 5-25% del DNA cell-free totale (in media circa il 10%) E individuabile dalla 4 settimana ma utilizzabile dalla 9-10 sg Clearance completa poche ore dopo il parto

8 Fetal Nucleic Acids nella circolazione materna Year tappe ricercatori 1997 free fetal DNA in maternal blood Lo

9 Applicazioni cliniche. difficoltà Esistono numerosi problemi generali associati alla detection del cffdna nella circolazione materna: 1. la concentrazione è relativamente bassa; frammenti piccoli 2. la quantità del DNA libero totale nel sangue varia enormemente tra gli individui; 3. l elevato background materno; primer 4. il feto eredita metà del suo genoma dalla madre. 5. sesso femminile non facilmente identificabile primer

10 Applicazioni cliniche. difficoltà Esistono numerosi problemi generali associati alla detection del cffdna nella circolazione materna: 1. la concentrazione è relativamente bassa; frammenti piccoli 2. la quantità del DNA libero totale nel sangue varia enormemente tra gli individui; 3. l elevato background materno; 4. il feto eredita metà del suo genoma dalla madre. 5. sesso femminile non facilmente identificabile

11 Applicazioni Determinazione sesso fetale Y facilmente identificabile

12 Mini-sequencing rs : A/G; Het 0.53 rs : C/T; Het 0.53 rs : A/G; Het 0.50 rs741935: A/G; Het 0.38 rs925178: A/G; Het 0.51 rs : C/T; Het 0.52 Het rs : C/T; Het 0.43 rs : A/C; Het 0.36 OmoC EmiT rs : C/G; Het 0.56 rs : G/T; Het 0.52

13 Settimana gestazionale (settimane + giorni) Controlli 1 e 2 Concentrazione DNA libero totale (Genome Equivalents/ml di sangue) Concentrazione cffdna (Genome Equivalents/ml di sangue) Controllo / Controllo (Y) non è stato possibile confermare la presenza del cffdna mediante Real-Time qpcr sul gene SRY nella coppia di controllo 1 rs (madre CC e padre T), rs (madre CC e padre T) rs

14 Applicazioni Determinazione sesso fetale Rh

15 Determinazione del genotipo RhD fetale Legler et al., 2009 Finning et al., 2008

16 cfdna: applicazioni genetiche

17 cfdna: preparazione del campione Vs Estrazione del cfdna (manuale o automatizzata) ma NON separazione delle frazioni materna e fetale

18 Malattie monogeniche 1138G>A (FGRF3); Chitty et al., 2011 (CAG)n (IT-15); Gonzalez-Gonzalez et al., 2003 Arg668Cys, Lys710ter, Tyr1092ter (CFTR); Bustamante-Aragones et al., 2008

19 Settimana gestazionale (settimane + giorni) Casi 1, 2, 3 e 4 Concentrazione DNA libero totale (Genome Equivalents/ml di sangue) Concentrazione cffdna (Genome Equivalents/ml di sangue) Caso Caso Caso Caso Caso 4 Caso 3 Caso 2 Caso 1 wt df508 I risultati ottenuti sono stati confermati dall analisi molecolare su villi coriali.

20 Applicazioni Determinazione sesso fetale Rh Malattia monogeniche Aneuplodie?

21 Tounta et al., 2011 Aneupliodia Chiu et al., 2011

22 de Jong et al., 2011

23 Futuro previsto nel 2012

25 ffdna: metodi di analisi - WG massively parallel sequencing (W-MPS) - Targeted massively parallel sequencing (t-mps) - Single nucleotide polymorphism (SNP)-based

26 SANGER SEQUENCER 1 READ SAMPLE NGS SEQUENCER MULTIPLE READS atgcgta cggtctt atcaggc ggcttgc cttcttc ttattag tctctag atctgta

27 BIOINFORMATIC ALIGNMENT ctgactacgtagcctatcctaggacga atcgatagactgactacgtagcctatcctaggacga tgctcggcgactcgatcgata cgtagcctatcctaggacga agactgactacgtagcctatcctag cgatcgatagactgactacgtag ctcggcgactcgatcgataga ctacgtagcctatcctaggacga tcgatagactgactacgtagc ctcggcgactcgatcgatagact cgactcgatcgatagactgactacgt ctacgtagcctatcctaggacga attgctcggcgactcga agcctatcctaggacga cgatagactgactacgtagcctat attgctcggcgactcgatcgataga atcgatagactgactacgtagcctatccta attgctcggcgactcgatcgatagactgactacgtagcctatcctaggacga READS REF. Sequence

28 COVERAGE 2X 9X 5X ctgactacgtagcctatcctaggacga atcgatagactgactacgtagcctatcctaggacga tgctcggcgactcgatcgata cgtagcctatcctaggacga agactgactacgtagcctatcctag cgatcgatagactgactacgtag ctcggcgactcgatcgataga ctacgtagcctatcctaggacga tcgatagactgactacgtagc ctcggcgactcgatcgatagact cgactcgatcgatagactgactacgt ctacgtagcctatcctaggacga attgctcggcgactcga agcctatcctaggacga cgatagactgactacgtagcctat attgctcggcgactcgatcgataga atcgatagactgactacgtagcctatccta attgctcggcgactcgatcgatagactgactacgtagcctatcctaggacga READS REF. Sequence

29 NIPT methods: MPS Milioni di frammenti di DNA libero sia materno che fetale vengono sequenziati simultaneamente ed, essendo noto l intero genoma umano, ogni frammento può essere assegnato al cromosoma di provenienza. In presenza di un aneuploidia ci sarà un eccesso o un difetto relativo di DNA libero per il cromosoma in questione.

30 NIPT methods: MPS Per esempio, per la trisomia 21: - 20% DNA fetale, di questi il 5% dal cromosoma 21 - I frammenti di DNA che derivano dal cr 21 fetale sono 33% in più rispetto all atteso

31 NIPT methods: MPS - Il metodo deve individuare questa differenza considerando che l 80% dei frammenti da cr 21 saranno materni: - L aumento relativo di DNA da cr 21 sarà solo del 10%

32 13/05/15 NIPT methods: SNPs-based

33 FALSI POSITIVI NIPT: cause di FP e FN MOSAICISMO PLACENTARE VANISHING TWIN SYNDROME: 15% DI TUTTI I FALSI POSITIVI PATOLOGIA MATERNA NON NOTA, COME MOSAICISMO (8-9% DEI FALSI POSITIVI) o NEOPLASIA MODIFICHE DELLA QUANTITÀ DI DNA CIRCOLANTE: OBESITÀ, GEMELLARITÀ FALSI NEGATIVI INSUFFICIENTE QUANTITÀDI cfdna FETALE NEL CAMPIONE MOSAICISMO FETALE-PLACENTARE

34 NIPT: cause di FP e FN Essendo DNA di origine placentare mostra gli stessi limiti del CVS vs LA, in particolare per quanto riguarda i mosaicismi placentari.

35 NIPT: cause di FP e FN Gravidanze gemellari: Difficile assegnazione della possibile aneuploidia La quota eccedente in presenza di trisomia di un feto può essere mascherata dall altro gemello normale Possibili effetti di un Vanishing twin sui risultati dello screening (15% dei FP)

36 NIPT: cause di FP e FN Infezione Cancro Trasfusioni di sangue Mosaicismo latente Immunoterapia 13/05/15 Donne trapiantate

37 NIPT in commercio NIPT

38 NIPT: comparazione -1 Trisomia 21 Trisomia 13 Trisomia 18 Aneuploidie Cromosomi sessuali Sensibilità >99% >97% >96% ± 95% Specificità >99% >99% >99% >96% FP <0,1% <0,1% <0,1% FN <0,001% <0,001% <0,001% No call / resampling <2% <2% <2%

39 NIPT: comparazione -2 S.G. Tempi referto gg lavorativi Dove viene eseguito Costo medio Consulenza genetica pre/post G-Test Italia 750 Si Harmony 10 7 USA 450 Si Maternity T USA 1000 Si Panorama USA Praenatest Germania Si Demandata all inviante Prenataltest Italia 420 Pre Tranquillity 10 5 Svizzera 600 Demandata all inviante Verifi 10 5 USA n.a. Demandata all inviante

40 NIPT: microdel/dup G-Test Harmony 1p36, 2p33.1, 5p15.2 (in validazione) no Maternity T21 1p36, 5p, 4p, 8q, 11q, 15p11, 22q11 (vers. plus) Panorama 1p36, 5p15.2, 22q11 Praenatest No Prenataltest No Tranquillity 5p15, 15p11, 22q22 + tutte > 10 Mb Verifi 1p36, 4p, 5p, 15p11, 22q11

41 NIPT: microdel/dup A causa dei numeri non ancora elevati di microdel/dup riscontrati in NIPT, la sensibilità e specificità di questo test è bassa (Valore predittivo positivo: 5-20%), con una percentuale elevata di falsi positivi (aumento ingiustificato di procedure invasive NON necessarie)

42 Prospettive future NIPT - Anomalie degli altri autosomi (??) - Miglioramento performance di cromosomi sessuali e micro del/dup - Mosaicismi - Traslocazioni - Triploidie

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