Il controllo microbiologico dei prodotti non obbligatoriamente sterili

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1 Il controllo microbiologico dei prodotti non obbligatoriamente sterili Esecuzione delle analisi e convalida dei metodi secondo la nuova monografia armonizzata Bayer HealthCare Gabriella Galimberti Bayer Healthcare Manuf. Cristina Viganò Intendis Manuf.

2 Convalida di metodo (method suitability) Che cosa richiedevano le Farmacopee precedenti? European Pharmacopoeia Se il prodotto da essere analizzato ha attività antimicrobica, questa deve essere adeguatamente neutralizzata. (Presente anche in ) Se per questo scopo si usano inattivanti, devono essere dimostrate la loro efficacia e la loro non tossicità verso i microorganismi. La scelta di un metodo può essere basata su fattori come la natura del prodotto ed il numero di microorganismi che ci si aspetta di trovare. Ogni metodo scelto deve essere adeguatamente validato. Effectiveness of culture media and validity of the counting method Coltivare i ceppi separatamente in liquido (elenco ceppi, tempi, temperature, esempi di terreni). Diluire in sol. fisiologica tamponata peptonata fino ad ottenere circa 100 ufc/ml. Per il controllo del metodo di conteggio usare le sospensioni separatamente in presenza ed in assenza del prodotto. Per la conta in piastra e per la filtrazione si deve ottenere una conta che non differisca di più di un fattore 5 (= %) da quella del controllo (inoculo). Per l MPN il valore deve collocarsi entro il 95% del limite di confidenza dell inoculo.

3 USP <61> La validità dei risultati dei test descritti in questo capitolo si basa sull adeguatezza della dimostrazione che i campioni, nelle condizioni di test, non inibiscono la moltiplicazione dei microorganismi che possono essere presenti. In preparazione all esecuzione del test, su una base regolare e se le circostanze lo richiedono in seguito, inoculare campioni diluiti del materiale da testare con colture vitali separate di S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e Salmonella. Ciò può essere fatto aggiungendo 1 ml di una diluizione non inferiore a 10 3 di una brodo-coltura di 24 h del microorganismo alla prima diluizione del campione e seguendo la procedura di test. La mancata crescita di uno più microorganismi invalida quella parte di test e necessita di una modifica alla procedura per aumento del volume di diluente, aggiunta di uno o più agenti inattivanti (ad es. lecitina di soia 0.5%, polisorbato %), entrambi, usando il metodo per filtrazione (vedi test di sterilità) se possibile. Se con tutte le modifiche non è comunque possibile ottenere il recupero, si deduce che il prodotto ha attività battericida e che, quindi, non può essere contaminato da quelle specie microbiche. Il monitoraggio deve comunque essere eseguito per valutare quale sia lo spettro di inibizione e l attività battericida del prodotto. Prima della conta fare il test per l assenza di proprietà antimicrobiche.

4 USP <1227> Questo capitolo è una guida per la convalida dei metodi per i capitoli <51> Antimicrobial Effectiveness Tests, <71> Sterility tests e <61> Microbial limit tests. Sottolinea più volte l importanza della neutralizzazione delle proprietà antimicrobiche eventualmente possedute dal prodotto. Fattori influenti Natura del microrganismo usato per la prova (specie, ATCC, ambientale) Preparazione dell inoculo (popolazioni microbiche omogenee, preparazione e conservazione standardizzate) Condizioni del test (riprodurre le condizioni delle analisi - diluenti, temperatura, luce) Condizioni del recupero (terreni, tempi e temperature di incubazione) Metodi di neutralizzazione Inibizione chimica, diluizione, filtrazione su membrana Convalida del metodo di neutralizzazione Efficacia del neutralizzante e sua non tossicità (tre gruppi: prodotto + neutralizzante, diluente + neutralizzante, diluente).

5 USP <1227> Conteggio su agar: recupero > 70% - almeno tre repliche con più repliche è possibile effettuare una valutazione statistica dei risultati. Conteggio per filtrazione: fa riferimento al Test di sterilità. L inoculo viene posto nel terzo risciacquo. Consigliano di verificare la tossicità della membrana e l eventuale aderenza dei m.o. sulle pareti del dispositivo di filtrazione. Recupero di microrganismi stressati I test prescrivono l uso di ceppi ATCC, ma i m.o. eventualmente presenti nei prodotti spesso sono stressati, o, al contrario, adatati al ambiente ostile. Consigliano di fare alcune prove per verificare la sopravvivenza dei m.o. nel prodotto ed il lororecupero dopo l esposizione in terreni differenti. Accettabilità per terreni alternativi: max. 0.5 log di errore. Stima del numero di ufc Il numero corretto è per batteri e lieviti, 8-80 per le muffe (ceppi prescritti da USP). Per conte su membrana e per altri ceppi si dovrebbe calcolare il range con il metodo fornito. Conte molto basse hanno una percentuale di errore elevata (es. per 3 ufc nella dil. 1:10 la conta di 30 ufc ha un errore del 58%.

6 Che cosa prevede la nuova armonizzata (<61>) Deve essere stabilità la capacità del test di rilevare microorganismi in presenza del prodotto. L adeguatezza deve essere confermata se vengono introdotti dei cambiamenti che possono interferire con l esito del test. Inoculo e diluizione Aggiungere al campione preparato e ad un controllo (senza prodotto) un volume di sospensione microbica tale da ottenere un inoculo di non più di 100 ufc. Il volume del inoculo non deve eccedere l 1% del volume del prodotto diluito. Per dimostrare un recupero accettabile è necessario utilizzare per il test il fattore di diluizione più basso possibile. Se ciò non fosse possibile a causa del atività antimicrobica del campione o di una scarsa solubilità, si possono usare protocolli differenti. Se non è possibile in alcun modo evitare l inibizione dela crescita microbica da parte del campione, l aliquota di sospensione microbica può essere aggiunta dopo la neutralizzazione, diluizione o filtrazione.

7 Neutralizzazione/rimozione dell attività antimicrobica Confrontare il numero di microorganismi recuperati dal campione con quelli del controllo. Si ha inibizione se il recupero è ridotto di un fattore maggiore di 2 (= 50%). In questo caso modificare la procedura, ad esempio: aumentando il volume del diluente o del brodo colturale aggiungendo un agente neutralizzante specifico o generico (vedi tabella) usando il metodo per filtrazione combianando i tre metodi sopra descritti. Se non è possibile trovare un adatto metodo di neutralizzazione, si deve assumere che il prodotto abbia attività microbicida. Questa informazione serve ad indicare che il prodotto non è a rischio di contaminazione da parte di quella data specie microbica. Comunque è sempre possibile che il prodotto inibisca anche altre specie microbiche qui non considerate. Perciò eseguire il test alla massima diluizione compatibile con la crescita microbica e con lo specifico criterio di accettazione.

8 Interpretazione dei risultati La conta di ogni microorgansimo non deve differire per più di un fattore 2 da quella del controllo. Per l MPN il valore deve collocarsi entro il 95% del limite di confidenza dell inoculo. Se i criteri non sono soddisfatti per uno o più microorganismi per l analisi bisogna usare il metodo e le condizioni di test che più si avvicinano ai criteri. Messa a punto del metodo Nelle precedenti Farmacopee questa parte era inclusa in quella dell analisi. Generalmente per la messa a punto del metodo si usa 1 g diluito 1:10. Diluenti suggeriti: soluzione fisiologica tamponata peptonata ph 7.0, tampone fosfato ph 7.2, TSB. Se necessario correggere il ph in modo che si collochi tra 6 e 8. Per i prodotti insolubili in acqua aggiungere dei tensioattivi Attenzione all indice HLB! (Hydrophylic/Lypophylic Balance). <10: lipofilo >10: idrofilo

9 (<62>) Se il prodotto da essere esaminato possiede attività antimicrobica, questa deve essere se possibile rimossa o neutralizzata come descritto al capitolo (<61>). Se sono utilizzati dei tensioattivi per la preparazione del campione, deve essere dimostrata la loro assenza di tossicità verso i microorganismi e la loro compatibilità con eventuali inattivanti usati, come descritto in (<61>).

10 Agenti inattivanti Sostanza inibente Glutaraldeide, mercuriali Fenolici, alcoli, aldeidi, sorbato Aldeidi Composti dell ammonio quaternario, parabeni, bi-guanidi Composti dell ammonio quaternario, iodio, parabeni Mercuriali Mercuriali, alogeni, aldeidi Sodio EDTA Metodo - Neutralizzante Sodio idrogeno solfito (sodio bisolfito) Diluizione Glicina Lecitina Polisorbato (Tween) Tioglicolato Tiosolfato Ioni calcio o magnesio

11 Inoculation and dilution Q: What is the sufficient volume of the microbial suspension of not more than 100 CFU? What does 100 CFU refer to? A: The micro-organisms are to be added to the diluted/suspended product at the end of the preparation o after the neutralisation (in the last fraction of the rinsing fluid in the case of filtration or simultaneously with the preparation in/on the Petri dish in the case of the plate count method). The 100 CFU refers to the inoculum (e.g. what will be on the filter or on the plate). Q: If I am going to validate a TAMC: should I use both C. albicans and A. niger for my qualification? And if I am validating for yeast and mould count should both C. albicans and A. niger be used for the qualification? A: Yeast and moulds must be recovered on both CSA and SDA. Yes, you must validate with C. albicans and A. niger.

12 Neutralisation/removal of antimicrobial activity Q: Why is it necessary to demonstrate the efficacy of neutralising agents? Has this to be performed by comparison of buffer solutions with and without neutralising agents? From our point of view it is not necessary, if recovery of micro-organisms in the presence of product is given. It is very time consuming to test different combinations of neutralising agents prior to the validation test. A: It is good practice to test the efficacy and the absence of toxicity of the neutralising agent. Effectiveness is checked by performing incubation of the product with and without neutralising agent, absence of toxicity is performed on a blank with neutraliser and without product. This can be done in parallel.

13 Suitability of the test method Q: Does it mean that for each test strain, individual suitability tests have to be performed, or is it possible to use a mixed inoculum of all 4 strains? A: The method states that the strains are inoculated individually. No mixed inoculum is permitted. Q: Test strains must be inoculated individually using a number of micro-organisms equivalent to not more than 100 CFU, could you clarify if this means that only the specific microorganism under detection in the test method is inoculated into the growth medium or if each of the 4 micro-organisms are added individually to the growth medium for each of the specific test methods? A: It is only the specified micro-organism under detection which is inoculated.

14 APPROCCIO ALLA CONVALIDA / SUITABILITY DEL METODO Convalida di metodo

15 In microbiologia Convalida del metodo? Chiarimento. I capitoli della USP con il numero fino a <1000> (compendial chapters) per definizione sono validati. Quindi, in realtà, noi non possiamo validare i metodi, ma solo dimostrare la correttezza del recupero (method suitability). Quindi, lo scopo di uno studio di correttezza del metodo (method suitability) in microbiologia non è quello di validare il saggio, ma di dimostrare che il nostro metodo analitico è corretto, o adatto, ovvero che lo schema utilizzato permetta il recupero dei microorganismi vivi, ovvero ancora che la crescita dei microorganismi non sia inibita dal atività antimicrobicaresidua del prodotto. Pertanto: Suitability del metodo

16 Da Allegato 15 al Vol. IV delle EU GMP: Tute le convalide dovrebbero essere pianificate; gli elementi chiave di un programma di Convalida dovrebbero essere chiaramente definiti e documentati in un Validation Master Plan o documento equivalente Pianificazione mediante: VMP

17 Definizione del ValidationMaster Plan (VMP) Documento di riferimento: definisce lo scopo le attività nelle varie fasi della Convalida la loro sequenza cronologica le responsabilità il team la formazione del personale e le procedure necessarie documentazione

18 Attività descritte nel VMP: FASE I: Convalida terreni Terreni di coltura oggetto di convalida Scelta dei fornitori dei terreni di coltura Test Conformità dei terreni di coltura FASE II: Convalida/Suitability dei metodi dei prodotti finiti delle materie prime dei materiali confezionamento primario

19 Convalida terreni (FASE I) 1) Terreni di coltura oggetto di convalida: Terreno coltura Proprietà Crescita Proprietà Indicative Proprietà Inibitorie EEB E.coli ATCC 8739 P.aeruginosa ATCC 9027 / S.aureus ATCC 6538 VRBGA E.coli ATCC 8739 P.aeruginosa ATCC 9027 E.coli ATCC 8739 P.aeruginosa ATCC 9027 / MCB E.coli ATCC 8739 / S.aureus ATCC 6538 MCA E.coli ATCC 8739 E.coli ATCC 8739 / RVSV S. typhimurium ATCC / S.aureus ATCC 6538 XLDA S. typhimurium ATCC E.coli ATCC 8739 / CTA P.aeruginosa ATCC 9027 / E.coli ATCC 8739 MSA S.aureus ATCC 6358 S.aureus ATCC 6358 E.coli ATCC 8739

20 Convalida terreni (FASE I) 2) Scelta dei fornitori dei terreni di coltura: selezione di due fornitori per ciascun terreno sulla base della corrispondenza della composizione riportata in Ph. Eur

21 Esempio: MacConkey Agar Richieste Ph Eur Fornitore 1 Fornitore 2 Pancreatic digest of gelatin 17,0 g Peptone from casein) 17,0 g Pancreatic digest of gelatin 17,0 g Peptone (meat and casein) 3,0 g Peptone from meat 3,0 g Peptone (meat and casein) 3,0 g Sodium chloride 5,0 g Sodium chloride 5,0 g Sodium chloride 5,0 g Lactose monohydrate 10,0 g Lactose 10,0 g Lactose 10,0 g Bile salt 1,5 g Bile salt mixture 1,5 g Bile salt 1,5 g Neutral red 30 mg Neutral red 30 mg Neutral red 30 mg Crystal violet 1 mg Crystal violet 1 mg Crystal violet 1 mg Agar 13,5 g Agar-agar 13,5 g Agar 13,5 g Purified Water 1000 ml Purified Water 1000 ml Purified Water 1000 ml ph 7,1± 0,2 ph 7,1± 0,2 ph 7,1± 0,2

22 Convalida dei terreni ( FASE I) 3) Test Conformità dei terreni di coltura: valutazione delle proprietà crescita, indicative e di inibizione Inoculo 100 UFC Inoculo 100 UFC Ripetizione test su 3 lotti per ciascun terreno di coltura

23 RISULTATI (FASE I) Tutti i terreni selezionati presentano buone proprietà di crescita, indicative e di inibizione ad eccezione di XLDA e MSA PROBLEMI EMERSI E.Coli (germe indicativo) - non cresce su XLDA E.Coli (germe inibitorio) - parzialmente inibito su MSA

24 Convalida del metodo (FASE II) 1. Convalida /Suitabilitydei metodi per l analisi microbiologica dei prodotti finiti delle materie prime dei materiali di confezionamento primario Ripetizione su 3 lotti

25 Operazioni preliminari: Verifica del ph Convalida metodo (FASE II) presenza/assenza di attività antimicrobica Neutralizzazione del atività antimicrobica Diluizione Agenti inattivanti Filtrazione su membrana Scelta del metodo

26 Total aerobic microrganism count (TAMC) / Total yeasts and moulds count (TYMC) Il volume dell inoculo non deve eccedere l 1% del volume del prodotto diluito. 90 ml NAPP 10 gr prodotto 10ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml A. niger C. albicans B. subtilis S. aureus P. aeruginosa E. coli UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml SABA CSA 5-7 gg C 3-5 gg C CSA 3-5 gg C UFC/piastra

27 Ricerca microrganismi specifici Bile-Tolerant, Gram-Negative Bacteria (Absence/Presence) 1 ml 10 gr prodotto E. coli 10 gr prodotto UFC/ml 1 ml P. aeruginosa UFC/ml 90 ml CSB 90 ml CSB 10 ml 10 ml h C EEB da 100ml h C EEB da 100 ml Subcoltura VRBGA Subcoltura VRBGA h C h C

28 Ricerca Microrganismi specifici E. coli 10 gr prodotto 90 ml NAPP 10 ml 1 ml E. coli UFC/ml 90 ml CSB 18-24h C 1 ml 100ml MCB h C Subcoltura MCA h C

29 Ricerca microrganismi specifici P. aeruginosa, S. aureus 1 ml 18-24h 10 ml P. aeruginosa UFC/ml C Subcoltura CTA h C 90 ml CSB 10 gr prodotto 90 ml NAPP 1 ml S. aureus UFC/ml 18-24h C Subcoltura MSA h C 90 ml CSB

30 Ricerca microrganismi specifici S. typhimurium Trasferimento diretto con pre-arricchimento 10 gr prodotto 1 ml S. typhimurium UFC/ml 90 ml CSB 18-24h C 0,1 ml 10 ml RVSB 18-24h C Subcoltura XLDA h C

31 Valutazione e interpretazione dei RISULTATI Conta totale Confrontare il numero di microrganismi recuperati dal campione con quelli del controllo e calcolare il fattore di Recovery: La conta di ogni microorgansimo non deve differire per più di un fattore 2 da quella del controllo, questo significa che, Per es. con un inoculo di 100 CFU, sono accettabili conte da 100/2 = 50 CFU a 100 x 2 = 200 CFU con un FR tra 2 e 0.5 calcolato come CFU controllo CFU campione Microrganismi specifici Crescita

32 Esempio Prodotto 1 ( assenza di inibizione) Microrg. Tests Test in ASSENZA Test in PRESENZA di prodotto Fattore recovery di prodotto TAMC (CSA ) Lotto 1 Lotto 2 Lotto 3 S. aureus ATCC /70 62/70 71/75 62/66 1 0,9-1 P. aeruginosa ATCC /95 86/96 97/99 98/ ,9 0,9 E. coli ATCC /31 35/30 37/38 33/35 1,1 0,9-1 B. subtilis ATCC /62 47/52 44/51 50/51 1,1-1,2 1,1 C. albicans ATCC /40 32/40 36/48 27/33 0,9 0,8 1,1 A. niger ATCC /38 40/38 36/36 30/36 0,9 1 1,1 TYMC (SABA) C. albicans ATCC /36 32/38 42/44 39/42 1-0,8 0,9 A. niger ATCC /45 42/45 35/43 60/65 1 1,1-0,7 Microrganismi specifici : crescita

33 Esempio Prodotto 2 (antibiotico) Microrg. Tests Test in ASSENZA Test in PRESENZA di prodotto Fattore recovery di prodotto TAMC (CSA) Lotto 1 Lotto 2 Lotto 3 S. aureus ATCC / P. aeruginosa ATCC / E. coli ATCC / B. subtilis ATCC / C. albicans ATCC /33 26/23 20/28 25/35 1,2 1,2-1 A. niger ATCC /30 40/41 34/36 32/34 0,8 0,9-1 TYMC (SABA) C. albicans ATCC /50 57/60 50/58 50/46 0,8 0,9-1 A. niger ATCC /39 36/37 30/39 39/44 1 1,1 0,9 Microrganismi specifici : nessuna crescita

34 Sulla base dei dati di Suitability: Conclusioni Stesura metodi relativi a ciascun prodotto per utilizzo del test di routine In caso di recovery > 2 per un dato microrganismo o Nessuna crescita per i microrganismi specifici Se non è stato possibile trovare un adatto metodo di neutralizzazione, si deve assumere che il prodotto abbia attività antimicrobica. Questa informazione serve ad indicare che il prodotto non è a rischio di contaminazione da parte di quella data specie microbica. Comunque è sempre possibile che il prodotto inibisca anche altre specie microbiche qui non considerate. Per la conta microbica totale - eseguire test alla massima diluizione compatibile con il criterio di accettazione Per la ricerca di microrganismi specifici - Non eseguire il test - Eseguire comunque il test allo scopo di rilevare gli eventuali ceppi resistenti

35 Messa a punto del metodo Valutare le caratteristiche del prodotto: liquido, solido, acquoso, grasso, idrosolubile, ph, Aw, filtrabilità, pericolosità, ecc Studi di ricerca e sviluppo sulla molecola? Prove di preparazione del campione in modo non sterile.

36 Water activity Indice della presenza di acqua realmente utilizzabile da parte dei m.o. Rapporto tra la pressione di vapore acqueo del prodotto e la pressione di vapore del acqua pura a w = P/P o. È uguale a 1/100 della RH generata dal campione in un sistema chiuso. P. aeruginosa: 0.97 Halobacterium halobium: 0.75 S. aureus: 0.86 Rhodotorula mucilaginosa: 0.92 Aspergillus niger: 0.77 Zygosaccharomices rouxii: 0.62

37 Esempio 1: materia prima (antimicotico) Problema: difficilmente solubile in acqua 1 a soluzione del problema: Preparazione del prodotto: 2 g + 10 g PEG 400 monoricinoleato + TSB (dil. 1:300). Non si scioglie. 2 a soluzione del problema: Preparazione del prodotto: 10 g + 15 g di sol. 0.1% di sodio tiosolfato + sol. fis. tamp. pept. (dil. 1:10) sciolto completamente.

38 Esempio 2: materia prima in polvere (inibente) Problema: difficilmente solubile in acqua 1 tentativo: Diluizione 1:10 con TSB + Tween 80: non si scioglie. 2 tentativo: Il ph è acido (3.44) tentiamo di correggerlo anche per eliminare l inibizione 7 ml di NaOH 1N: ph 7.46 Si scioglie completamente.

39 Metodo degli aloni (Par-Test, test di Kirby Bauer) Rapida valutazione della presenza di attività inibitoria Risultati non precisi, ma indicativi.

40 Accettabilità del recupero La correttezza dei limiti 70%, 50%, % per il recupero è sempre un acceso dibattito. Sutton ha dimostrato con studi pratici e statistici che se i tecnici hanno una buona manualità una variabilità entro il 75% è ampiamente ottenibile. Oltre il 130% può avere senso se è indice di un metodo migliore. Comunque dopo lunghe discussioni si è scritto il 50% perché sembra (senza prove scientifiche) più raggiungibile da tutti. Questo, però, non vuol dire che sia valido per tutti i test (ad es. se non è prescritto alcun limite).

41 Qualche consiglio: Attenzione agli agenti inattivanti ed emulsionanti: spesso creano più danno che beneficio (es. il sodio tiosolfato, il PEG 400 monoricinoleato, il TTC sono tossici verso i Gram +). Attenzione ai tempi di crescita dei m.o. nella fertilità dei terreni selettivi (coincide con quelli della convalida?). Attenzione al gap tra convalida ed analisi di routine (non sempre è il caso di fare i primi dela classe ).

42 Qualche dubbio:?qual è il punto esato in cui aggiungere l inoculo?? Per i test preliminari posso usare un campione <10 g, ma per le tre prove?? È utile usare un numero di piastre >2?

43 Proposte alternative : Il lavoro di convalida è lungo ed oneroso e se il metodo va anche registrato... Insieme al metodo base si può convalidare qualche alternativa. Ad esempio: Permanenza dei brodi per le ricerche per più gg in incubatore. Utilizzo di metodi differenti (più di un terreno per le ricerche o per le conte, più di un metodo di conteggio ). Skip testing (ICH Q6A).

44 Esempio 1: prodoto topico per l acne Principio attivo inibente (soprattutto verso i Gram +) e ph basso (4.8) 1 a soluzione del problema: Preparazione del prodotto: dil. 1:20 in TSB con inattivanti* Ricerche: TSB con inattivanti dil. 1:200 (= 2 litri!) LB con inattivanti dil. 1:300 (= 3 litri!). 2 a soluzione del problema: Preparazione del prodotto: 10 g + 30 g di sol. fis. tamp. pept., correzione del ph con 4 ml di NaOH 4N, dil. 1:10. Ricerche: 10 ml in TSB. * 3% Tween 80, 0.5% sodio tiosolfato, 0.3% lecitina.

45 Esempio 2: detergente per l acne Principio attivo inibente (soprattutto verso i Gram +) Problema: S. aureus non cresce. Conta: Prodotto diluito 1: e 10 4 cellule: nulla Prodotto diluito 1: e 10 4 cellule: crescita scarsa (<20%). Ricerca: Prodotto diluito 1: cellule: nulla Prodotto diluito 1:1000: crescita. Conclusione: Il prodotto non è a rischio microbico per S. aureus. La conta si esegue comunque, la ricerca non si esegue.

46 Esempio 3: prodotto solido antinfiammatorio Principio attivo inibente (soprattutto verso i Gram +) Preparazione del campione: dil. 1:10 con sol. fis. tamp. pept. Prova con Par test: dil. 1:10 inibente, dil. 1:100 no. Conta: Prodotto diluito 1:10 + ceppi: recupero nullo dei Gram + Prodotto diluito 1:100 + ceppi: OK. Ricerca: Nessuna inibizione Conclusione: Il problema si è risolto con la diluizione.

47 Esempio 4: antisettico ad uso vaginale Problema: inibizione verso S. aureus Metodo di conta scelto: filtrazione su membrana Risultati delle varie prove: N LAVAGGI Totale lavaggio Recovery PT Recovery PT + Tween 1% Recovery riferimento 3 aliquote da 100 ml 300 ml aliquote da 100 ml 400 ml aliquote da 100 ml 500 ml Soluzione: uso di un inattivante (Tween 80).

48 Bibliografia - 1 HABERER K.: New Microbiological Chapters of the European Pharmacopoeia - Internationally Harmonized Methods for Microbiological Examination of Non-sterile Products. Presentata al 2 simposio AFI/BioMerieuxL innovazionetecnologica nei controlli microbiologici delle produzioni farmaceutiche - Firenze S. SUTTON: Microbial Recovery Studies - 50% or 70%?. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter - Vol. 13 (9). Gruppo di Studio di Microbiologia del A.F.I: Metodi di controlo dela contaminazione microbica: verifiche, valutazioni e suggerimenti). Poster presentato al Simposio A.F.I. del 1992 a Riva del Garda. Gruppo di Studio di Microbiologia del A.F.I: L analisi microbiologica dei prodoti farmaceutici non obbligatoriamente sterili: corretto approccio per la definizionee la convalida dei metodi. Poster presentato al Simposio A.F.I. del 1995 a Riccione. Gruppo di Studio di Microbiologia del A.F.I: Contributo ala convalida dei metodi per il controlo microbiologico (Prodotti farmaceutici non obbligatoriamente sterili). Poster presentato ala conferenza I rischi microbiologici del 2000 nel settore alimentare, organizzata da Oxoid a Bologna nel Gruppo di Studio di Microbiologia del A.F.I: Contribution to the validation of microbiological analysis methods. Control of non-sterile pharmaceutical products. S.T.P. Pharma pratiques 7 (1)

49 Bibliografia - 2 FARMACOPEA UFFICIALE DELLA REPUBBLICA ITALIANA XII ed Requisiti microbiologici delle preparazioni farmaceutiche. - I suppl Requisiti microbiologici delle preparazioni farmaceutiche. EUROPEAN PHARMACOPOEIA Microbiological examination of non-sterile products: total viable aerobic count Microbiological examination of non-sterile products: test for specified micro-organisms Microbiological quality of pharmaceutical preparations Alternative methods for control of microbiological quality. THE UNITED STATES PHARMACOPOEIA 32 - <61> Microbial limit tests. - <61> Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests. - <62> Microbiological examination of non-sterile products: test for specified micro-organisms. - <1111> Microbiological quality of pharmaceutical preparations. - <1227> Validation of microbial recovery form pharmacopoeial articles. W. MANU-TAWIAH, B.A. BRESCIA, E.R. MONTGOMERY: Setting threshold limits for the significance of objectionable microorganisms in oral pharmaceutical products. J. Pharm Sci. Technol May-Jun; 55(3): ICH - Specifications: test procedures and acceptance criteria for new drug substances and new drug products. Q6A

50 Bibliografia The Harmonization of the Microbial Limits Tests. Dec 2, 2006 By S. Sutton - Pharmaceutical Technology. European Directorate for the Quality of Medicines. Help desk: US Food and Drug Administration, Bacterial Analytical Manual Online. US Food and Drug Administration, Guide to Inspections of Microbiological Pharmaceutical Quality Control Laboratories. 7/