CENNI DI GENETICA BATTERICA DNA

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1 CENNI DI GENETICA BATTERICA DNA La maggior parte del DNA batterico è raccolto in un singolo cromosoma. Dott. Esin SNT2/4 2009

2 Struttura dei singoli filamenti della doppia elica di DNA

3 Replicazione semiconservativa del DNA Replicazione semiconservativa del DNA Ogni nuova molecola di DNA è formata da un filamento parentale e da uno complementare di nuova sintesi

4 REPLICAZIONE DEL DNA La replicazione del cromosoma batterico ha inizio in un punto prefissato (oric), dal quale procede in direzioni opposte fino all incontro delle due forche replicative e alla formazione di due distinte molecole a doppio filamento. oric

5 TRASCRIZIONE Sequenze degli eventi che portano all inizio della sintesi e all allungamento dell RNA messaggero durante la trascrizione.

6 SINTESI PROTEICA Fasi principali della sintesi proteica Ogni ribosoma presenta tre siti di interazione con i trna: il sito accettore (A), il sito peptidico (P), il sito di uscita (E). Durante la sintesi proteica, il sito P è occupato dal trna che porta il polipeptide nascente, mentre il sito A contiene il trna che porta l aminoacido successivo. Dopo il legame di quest ultimo, il ribosoma si sposta di una tripletta lungo il messaggero e il trna scarico viene rilasciato dal sito E.

7 GENETICA BATTERICA 1) L'organizzazione del genoma batterico La maggior parte del DNA batterico è raccolto in un singolo cromosoma. Una piccola % di DNA (1-2%) ha localizzazione extracromosomica e va a costituire, nel citoplasma, piccole unità circolari di DNA chiamate PLASMIDI. I plasmidi possono moltiplicarsi indipendentemente dalla normale divisione della cellula ospite e trasportano informazione genetiche non indispensabili alla vita del batterio, ma che possono essere importanti per la sua patogenicità. Tra i caratteri legati a geni plasmidici sono da ricordare: u LA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI u LA PRODUZIONE DI ALCUNE TOSSINE

8 2) Origine della variabilità genetica nei batteri I batteri possono variare la loro informazione genetica con due principali meccanismi: a) Mutazione genica (bassa frequenza) b) Ricombinazione: processo mediante il quale due molecole di DNA (DNA della cellula donatrice e DNA della cellula ricevente) si rimescolano o ricombinano per creare delle nuove varianti geniche. + RICOMBINAZIONE DNA del donatore DNA del ricevente

9 3) Meccanismi di scambio di frammenti di DNA tra batteri DNA TRASFORMAZIONE Piccoli frammenti di DNA rilasciati nell'ambiente da cellule batteriche che vanno incontro a lisi possono essere assunti da un'altra cellula batterica ed incorporati nel cromosoma. La cellula ricevente assume nuove proprietà. Questo fenomeno può essere provocato artificialmente in laboratorio ed utilizzato nei processi della tecnologia del DNA ricombinante. donatrice (F+) Virus batterico Fattore F ricevente (F-) CONIUGAZIONE Processo mediante il quale un pilo sessuale posto a formare un ponte o tunnel tra due cellule batteriche permette il trasferimento di plasmidi o di geni cromosomici da una cellula donatrice ad una cellula ricevente. La cellula donatrice per essere tale deve possedere i geni che consentano la formazione del pilo ed il processo coniugativo. Tali geni sono localizzati su un plasmide detto fattore F (F sta per fertilità) Questo tipo di trasferimento genetico seguito da ricombinazione può essere considerato una forma primitiva di sessualità. TRASDUZIONE La trasduzione si verifica quando plasmidi o frammenti di DNA cromosomico vengono trasportati da un batterio all'altro tramite un virus parassita delle cellule batteriche (detto batteriofago o fago). Può quindi seguire ricombinazione genica con acquisizione di nuove proprietà.

10 PRINCIPI DI IMMUNITÀ ANTINFETTIVA Dr. Semih ESIN SNT2/4 2009

11 SISTEMA IMMUNITARIO Insieme dei dei complessi meccanismi con con cui cui l ospite si si difende dall aggressione di di agenti agenti estranei Meccanismi di difesa: IMMUNITA INNATA O ASPECIFICA IMMUNITA ACQUISITA O SPECIFICA Sempre attiva (immediata) Limita la replicazione dei microrganismi invasori con meccanismi analoghi per tutti gli agenti infettivi L efficienza di tali meccanismi non cambia dopo una seconda esposizione Si attiva solo in seguito al contatto con un agente infettivo (richiede più tempo per attivarsi) Elimina gli invasori per mezzo di meccanismi altamente patogenospecifici L efficienza di tali meccanismi aumenta ad una seconda esposizione allo stesso patogeno

12 IMMUNITA INNATA O ASPECIFICA IMMUNITA ACQUISITA O SPECIFICA Barriere cutanee, mucose e microbiologiche; Fattori cellulari (cellule fagocitiche, cellule NK) NK) Fattori solubili presenti nei nei fluidi organici; Fattori cellulari (linfociti T e B); B); Fattori umorali (citochine, anticorpi)

13 L IMMUNITA L IMMUNITA INNATA INNATA ED ED ACQUISITA ACQUISITA INTERVENGONO INTERVENGONO IN IN MANIERA MANIERA SEQUENZIALE SEQUENZIALE IN IN RISPOSTA RISPOSTA AD AD UN UN AGENTE AGENTE PATOGENO PATOGENO INFEZIONE ELIMINAZIONE DELL AGENTE INFETTIVO; NO MALATTIA IMMUNITA INNATA NON SUFFICIENTE; SI MALATTIA IMMUNITA ACQUISITA GUARIGIONE MEMORIA IMMUNOLOGICA SPECIFICA REINFEZIONE NO MALATTIA

14 IMMUNITA INNATA O ASPECIFICA

15 1) BARRIERE CUTANEE, MUCOSE, MICROBIOLOGICHE CUTE Barriera fisica (cute integra) Barriera meccanica (la desquamazione allontana i microbi) Barriera chimica (sudore, sebo) MUCOSE Muco (invischia i microrganismi) Movimento ciliare (dirige verso l esterno i materiali estranei) FLORA INDIGENA Microrganismi residenti in un certo distretto che, di solito, non causano malattia e che per competizione impediscono la colonizzazione da parte di germi più patogeni

16 2) FATTORI SOLUBILI PRESENTI NEI FLUIDI BIOLOGICI Alcuni esempi: LISOZIMA: può scompaginare la parete cellulare dei batteri; PROTEINE CHELANTI DEL SIERO (lattoferrina, transferrina): legano il ferro, elemento indispensabile del metabolismo batterico, rendendolo indisponibile; COMPLEMENTO: insieme di proteine del siero che, una volta attivate, possono portare alla lisi di cellule batteriche o favorire la loro fagocitosi; PEPTIDI CATIONICI PEPTIDI CATIONICI: peptidi prodotti da una varietà di cellule e tessuti con spiccata attività antibatterica, antifungina e/o antivirale es DEFENSINE, ISTATINE, CATELICIDINE ecc..

17 3) FATTORI CELLULARI CELLULE AD ATTIVITÀ FAGOCITARIA: diversi tipi cellulari, appartenenti alla categoria dei globuli bianchi, sono in grado di inglobare e distruggere microrganismi e sostanze estranee: Granulociti Monociti/macrofagi Cellule dendritiche CELLULE NATURAL KILLER (NK): particolare classe di globuli bianchi in grado di lisare cellule infettate dai virus o di produrre fattori solubili (citochine) che aiutano le cellule ad attività fagocitaria ad eliminare i microrganismi. DC

18 LE PRINCIPALI CELLULE AD ATTIVITÀ FAGOCITARIA 1) I MACROFAGI Derivano dai monociti del sangue Abbondanti nei tessuti Vita relativamente lunga Traggono energia dai mitocondri Tre principali funzioni: 1) Fagocitano e distruggono i m.o. 2) Producono citochine (IL-1; IL-8; TNFa; IL-12 ecc.) 3) Presentano gli antigeni ai linfociti T (immunità acquisita) 2) NEUTROFILI O POLIMORFONUCLEATI 2) NEUTROFILI O POLIMORFONUCLEATI Abbondanti nel circolo sanguigno Non hanno mitocondri, ma ricavano energia dalle abbondanti riserve di glicogeno del loro citoplasma (tramite la glicolisi producono energia anche nelle condizioni di anaerobiosi che si stabiliscono nel focolaio infiammatorio) Non si dividono Vita breve (6.5h nel sangue; c.a. 24h nei tessuti)

19 Nomi dei macrofagi Monocita Cellula di Kupffer Cellula della microglia Macrofagi alveolari Istiociti Tessuto od organo dove si ritrovano Sangue Fegato Cervello Polmone Tessuto connettivo ecc..

20 LE CELLULE FAGOCITARIE SI CONCENTRANO NEL SITO DI INFEZIONE PER CHEMIOTASSI Fattori chemiotattici: - alcuni componenti del complemento (es: C5a) - monochine - leucotrieni (prodotti lipidici del metabolismo delle membrane) - componenti batterici I fagociti (neutrofili e macrofagi) sono attratti nel sito dell infiammazione, dove essi possono incontrare ed uccidere i microrganismi. La risposta infiammatoria porta ad una aumentata espressione nei vasi sanguigni locali di molecole di adesione (ELAM-1, ICAM-1) che legano i fagociti, permettendo a queste cellule di passare nel tessuto circostante secondo il processo conosciuto come DIAPEDESI.

21 IL PROCESSO DI FAGOCITOSI

22 IMMUNITÀ ACQUISITA O SPECIFICA

23 Presenta alcune importanti proprietà: SPECIFICITÀ: una infezione causata da un particolare microrganismo provoca una risposta immunitaria diretta unicamente verso quel microrganismo o contro un microrganismo molto simile MEMORIA: Particolare proprietà che fa sì che ad una seconda infezione con lo stesso microrganismo anche dopo anni dalla prima infezione, la risposta immunitaria sia più rapida ed efficace. CAPACITÀ DI RICONOSCERE IL NON SELF : ANTIGENE (Ag): Sostanza riconosciuta come estranea dal sistema immunitario (non-self) e, per questo, capace di indurre una risposta immunitaria. I microrganismi (batteri, virus, funghi, protozoi) portano sulla loro superficie molti tipi di molecole, ciascuna può comportarsi da antigene. SONO MOSAICI DI ANTIGENI.

24 Le cellule responsabili dell immunità specifica, capaci di riconoscere gli Ag, sono speciali globuli bianchi noti come LINFOCITI Esistono due principali classi di linfociti LINFOCITI B LINFOCITI T IMMUNITA UMORALE IMMUNITA CELLULO- MEDIATA

25 I LINFOCITI B E L IMMUNITÀ UMORALE I LINFOCITI B E L IMMUNITÀ UMORALE LINFOCITA B Antigene microbico (Tindipendente) es: LPS o polisaccaridi capsulari I linfociti B, una volta differenziati in PLASMACELLULE, producono anticorpi; Il loro RECETTORE PER L ANTIGENE è rappresentato da Ac fissati alla membrana cellulare LINFOCITI B DI MEMORIA PLASMACELLULA CHE PRODUCE ANTICORPI

26 STRUTTURA DI UN TIPICO ANTICORPO ANTIGENE Fab Catena L (Light) Catena H (Heavy) porzione variabile catena H porzione variabile catena L Fab (frammento di antigen binding ) porzione costante catena L Fc (frammento cristallizzabile) porzione costante catena H

27 ESISTONO DIVERSE CLASSI DI ANTICORPI O IMMUNOGLOBULINE che differiscono per struttura, frequenza relativa nel circolo sanguigno, attività biologiche IgG IgG Le Le più più abbondanti abbondanti nel nel sangue sangue e e nei nei liquidi liquidi tissutali tissutali (80% (80% delle delle Ig Ig totali); totali); passano passano attraverso attraverso la la placenta placenta IgD IgD Rare Rare nel nel sangue sangue e e nei nei tessuti tessuti (1% (1% delle delle Ig Ig totali); totali); sono sono i i recettori recettori di di membrana membrana dei dei linfociti linfociti B B IgA IgA (13% (13% delle delle Ig Ig totali); totali); Abbondanti Abbondanti nel nel muco muco dell apparato dell apparato digerente digerente e e respiratorio, respiratorio, nel nel colostro, colostro, nel nel latte, latte, nelle nelle lacrime lacrime (in (in forma forma dimerica); dimerica); nel nel sangue sangue si si trovano trovano in in forma forma monomerica. monomerica. IgM IgM (6% (6% delle delle Ig Ig totali); totali); Sono Sono formate formate da da 5 5 monomeri monomeri Sono Sono le le prime prime ad ad essere essere prodotte prodotte nel nel sangue sangue in in risposta risposta ad ad un un Ag Ag IgE IgE Presenti Presenti nel nel sangue sangue in in piccolissima piccolissima quantità quantità (0.002% (0.002% delle delle Ig Ig totali); totali); Mediano Mediano reazioni reazioni allergiche; allergiche; Vengono Vengono prodotte prodotte in in risposta risposta ai ai parassiti parassiti

28 ANDAMENTO DI UNA TIPICA RISPOSTA ANTICORPALE ANDAMENTO DI UNA TIPICA RISPOSTA ANTICORPALE RISPOSTAPRIMARIA Fase di latenza (5-10 gg); Fase esponenziale (7-10 gg); Fase di plateau Declino rapido RISPOSTA SECONDARIA O ANAMNESTICA Più rapida (3-5 gg); Quantitativamente maggiore Richiede una qu.tà minore di Ag Persiste più a lungo

29 AZIONE PROTETTIVA DEGLI ANTICORPI (Ac) NELLE INFEZIONI BATTERICHE E VIRALI 1) NEUTRALIZZANTE A) L azione di tossine Legandosi alle tossine batteriche gli Ac impediscono che queste si leghino ai loro recettori cellulari B) L nfettività virale Legandosi ai virus gli Ac impediscono che questi si leghino ai loro recettori cellulari C) L adesione ai tessuti Legandosi alla superficie batterica gli Ac impediscono la fase di adesione e quindi di colonizzazione

30 2) OPSONIZZANTE Un batterio rivestito di Ac viene attivamente fagocitato dai macrofagi che hanno dei recettori superficiali che si legano alla regione Fc delle molecole IgG. Il legame del batterio ricoperto da Ac con questi recettori Fc sul macrofago attiva il processo di fagocitosi

31 3) ATTIVAZIONE DEL COMPLEMENTO Il sistema del complemento Consiste in un insieme molto complesso di proteine sieriche che partecipano in vario modo alla difesa dalle infezioni. I componenti del complemento per poter svolgere le loro funzioni devono essere "attivati" L'attivazione dei componenti del complemento avviene secondo una sequenza "a cascata" Il complemento può essere attivato con due modalità principali:

32 Funzioni effettrici del complemento (ruolo nella difesa dalle infezioni) Rende i microrganismi invasori suscettibili alla fagocitosi anche in assenza di anticorpi (opsonizzante) Lisa direttamente alcuni microrganismi, virus o cellule Alcuni componenti del complemento esercitano un'azione chemiotattica su altre cellule del sangue Promuove la risposta infiammatoria

33 I I LINFOCITI LINFOCITI T E L IMMUNITA L IMMUNITA CELLULO- CELLULO- MEDIATA MEDIATA LINFOCITA T (CD3+) Due classi in base alle molecole espresse sulla loro superficie (CD: cluster of differentiation) I linfociti T comprendono sottopopolazioni distinte che appaiono morfologicamente simili, ma che differiscono nelle loro funzioni e nei loro prodotti proteici. Th1 LINFOCITA T (CD4+) LINFOCITA T HELPER (Th) Th2 LINFOCITA T (CD8+) LINFOCITA T CITOTOSSICO (CTL) Prodotti solubili IL-2, TNF-a, IFN-g IL-4, IL-5, IL-10 Perforine, granzimi AIUTANO AIUTANO I I MACROFAGI MACROFAGI A DISTRUGGERE DISTRUGGERE I I MICROBI MICROBI INTRACELLULARI INTRACELLULARI AIUTANO AIUTANO I I LINFOCITI LINFOCITI B B A PROODURRE PROODURRE ANTICORPI ANTICORPI LISANO LISANO CELLULE CELLULE INFETTATE INFETTATE DA DA VIRUS VIRUS

34 1) 1) I linfociti T riconoscono l antigene solo solo se se è presentato sulla sulla superficie di di una una cellula Cellule presentanti l Ag professionali APC Localizzazione: CELLULE DENDRITICHE Tessuti linfoidi, tessuti connettivi, epiteli MACROFAGI Tessuti linfoidi, tessuti connettivi, cavità corporee LINFOCITI B Tessuti linfoidi, circolo sanguigno

35 2) 2) I linfociti T riconoscono l antigene solo solo se se è presentato sulla sulla superficie di di una una cellula in in associazione con con molecole del del complesso maggiore di di istocompatibilità 1) fagocitosi o endocitosi: 2) Processazione : 3) Presentazione in associazione con le molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC): MHC II: MHC I: Molecole espresse su tutte le APC e sui linfociti T attivati. Presentano antigeni microbici prodotti nel compartimento fagosomiale/endocitico (antigeni ESOGENI) Molecole espresse su tutte le cellule nucleate (cellule presentanti l antigene non professionali). Presentano antigeni microbici prodotti nel citoplasma (antigeni ENDOGENI)

36 3) I linfociti T possono essere classe I o classe II ristretti 3) I linfociti T possono essere classe I o classe II ristretti Batterio,tossina o altri Ag esogeni Virus MHC II I linfociti T CD4+ sono classe II ristretti cioè riconoscono gli Ag presentati in associazione all MHC II TCR MHC I I linfociti T CD8+ sono classe I ristretti cioè riconoscono gli Ag presentati in associazione all MHC I

37 3) 3) I linfociti T riconoscono l antigene tramite un un eterodimero di di superficie chiamato T T CELL RECEPTOR (TCR) Il TCR è composto da due glicoproteine trans-membrana: la catena alfa e la catena beta. Le due catene sono unite da un ponte disolfuro e sono ancorate alla membrana citoplasmatica del linfocita mediante una regione idrofobica trans- membrana. Ciascun TCR si lega ad un solo Ag Ciascun linfocita T presenta una sola specificità antigenica

38 PARTECIPAZIONE DEI DEI LINFOCITI LINFOCITI T ALL IMMUNITA ALL IMMUNITA ANTINFETTIVA ANTINFETTIVA

39 I LINFOCITI T Th1 CD4+: svolgono un ruolo centrale nell attivazione dei macrofagi e nella risposta immune ai patogeni intracellulari. Attivano i macrofagi mediante la produzione di citochine (es: INF-g) ) che rendono tali cellule più efficienti nelle loro capacità battericide. TCR Th1 MHC II IFN-g ATTIVAZIONE Aumento della fagocitosi Aumento degli enzimi lisosomiali e della produzione dell NO e dei radicali dell O 2 Aumento dell espressione dell MHCII Secrezione di molte monochine quali TNFa che si comporta da fattore di crescita autocrino e sinergizza con l IFN-g prodotto dalle cellule Th1

40 I LINFOCITI T Th2 CD4+: cooperano con i linfociti B nella risposta anticorpale alla maggior parte degli Ag (antigeni T-dipendenti). Determinano la proliferazione e la differenziazione dei linfociti B in plasmacellule produttrici di Ac, mediante la liberazione di citochine (IL-4; IL-5, IL-6, IL-10) Ag T-dipendente es: tossina batterica LINFOCITA B TCR Th2 I linfociti B Ag-specifici legano gli Ag proteici mediante le Ig di membrana ed internalizzano, processano e presentano i peptidi associati all MHCII ai linfociti Th2 CD4+ specifici MHC II LINFOCITI B DI MEMORIA PLASMACELLULA CHE PRODUCE ANTICORPI

41 I LINFOCITI T CD8+: uccidono le cellule che esprimono sulla loro superficie antigeni virali (infettate da un virus) o batterici (infettate da batteri patogeni intracellulari. CELLULA INFETTATA DA UN VIRUS TCR MHC I CTL Proteine virali Una volta attivato dal riconoscimento dell Ag il CTL rilascia a livello del sito di contatto il contenuto di granuli citoplasmatici che contengono molecole che portano ad APOPTOSI (morte cellulare programmata) delle cellule target. una cellula morta non può più sostenere la replicazione del virus!!! granuli citotossici CONTENUTO DEI GRANULI Perforina: polimerizza per formare dei pori nella membrana della cellula target Granzimi: serine proteasi che attivano l apoptosi una volta nel citoplasma della cellula target Granulisina: proteina ad attività antibatterica