GAS CROMATOGRAFIA. La GC nasce da una idea di Martin e Synge (1941) (premio Nobel nel 1952) e poi sviluppata da James e Martin (1952)

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1 GAS CROMATOGRAFIA In gascromatografia (Gas Chromatography, GC) la fase mobile è un gas permanente (carrier o gas di trasporto) che fluisce attraverso una colonna in cui è posta la fase stazionaria. All uscita della colonna è posto il rivelatore che fornisce il gascromatogramma La GC nasce da una idea di Martin e Synge (1941) (premio Nobel nel 1952) e poi sviluppata da James e Martin (1952) Archer John Porter Martin Richard Laurence Millington Synge In GC è fondamentale che gli analiti possano essere vaporizzati per via termica e a pressione ambiente (principale limite GC) I componenti della miscela una volta vaporizzati sono separati in seguito alla ripartizione tra una fase gassosa mobile e una fase stazionaria La fase mobile non interagisce con l analita. La sua solo funzione è di carrier. La separazione dipende quindi dalle caratteristiche chimico-fisiche della fase stazionaria e dalla temperatura

2 Classificazione delle tecniche gascromatografiche I criterio (stato fisico fase stazionaria) GC Gas solido Gas liquido II criterio (caratteristiche geometriche colonna ) GC Colonne impaccate Colonne capillari Colonne impaccate: la fase stazionaria è formata da un solido granulare poroso o da un liquido deposto su un supporto costituito da particelle inerti. La colonna è costituita da un tubo di acciaio o vetro di lunghezza da 1 a 6 metri con diametro interno di mm. riempimento ID mm

3 Le prestazioni di una separazione GC vengono valutate in base a: selettività: in GC dipende solo dalla fase stazionaria e dalla sua temperatura. Non esistono differenze tra colonne impaccate e capillari efficienza: Notevoli differenze tra colonne impaccate e capillari: colonne impaccate N 4000, colonne capillari N range (la permeabilità è nettamente superiore nelle colonne capillari e questo permette di raggiungere lunghezze fino anche a 150 m). Per aumentare l efficienza si può agire sulle seguenti variabili: 1. Lunghezza colonna 2. Diametro delle particelle (per colonne impaccate) 3. Liquido di ripartizione: altamente selettivo per l analita e poco viscoso 4. diametro interno della colonna (sia per colonne impaccate sia per quelle capillari) Risoluzione: dato N, è solitamente maggiore per le colonne capillari rispetto a quelle impaccate Asimmetria picchi Fase Mobile: Il gas Carrier Il gas carrier deve avere le seguenti caratteristiche: elevata inerzia chimica verso gli analiti e la fase stazionaria (gas nobili e azoto) elevato grado di purezza. In particolare devono essere assenti umidità (disattivazione fase stazionaria), ossigeno (ossidazione fase stazionaria) e idrocarburi (aumento linea base) Compatibilità con il rivelatore I gas di trasporto più usati sono: idrogeno elio e miscele elio/idrogeno azoto argon Diossido di carbonio

4 La fonte del gas di trasporto può essere rappresentato da bombole di acciaio dotate di riduttore di pressione (un secondo riduttore di pressione è presente nella GC)

5 Fasi stazionarie per GC Fasi stazionarie solide (di uso limitato rispetto alle fasi liquide): Il meccanismo di separazione è per adsorbimento (la separazione dipende dalla forza di legame tra le molecole di analita e i siti attivi della fase stazionaria). Si utilizza tale tecnica per separare gas che non ripartiscono nella fase liquida (azoto, ossigeno, monossido di carbonio) e molecole organiche e in genere composti bassobollenti (metanolo, etanolo, acqua). I materiali più usati come fase stazionaria sono: Gel di silice Allumina Carbone attivo (mediamente polare) Zeoliti (silicati di alluminio e sodio) Silanizzazione con dimetilclorosilano (DMCS) o esametildisilazano (HMDS) Nelle colonne WCOT, la fase stazionaria viene depositata sulle superficie interna della colonna di vetro o di silice fusa Liquidi di ripartizione: Il liquido di ripartizione da depositare sul supporto solido deve soddisfare numerosi requisiti tra cui: Bassa tensione di vapore (per minimizzare la perdita di liquido durante le analisi) (la tensione di vapore aumenta esponenzialmente all aumentare della temperatura) elevata stabilità termica Elevata inerzia chimica Buon effetto solvente sulla miscela Bassa viscosità per diminuire la resistenza al trasferimento di massa Sulla base della polarità i liquidi di ripartizione si possono suddividere nelle seguenti classi: prima classe: apolari (idrocaarburi o siliconi con sostituenti non polari) seconda classe a bassa polarità quali derivati siliconici (polisilossani) con sostituenti polari terza classe: polari (poliglicoli, polialcol e loro esteri) Quarta classe: molto polari (glicoli, glicerina, idrossiacidi)

6 Regola per la scelta della fase stazionaria: la scelta si basa sulla regola il simile sciogli il simile. es. le colonne apolari sono le migliori per i soluti apolari ecc. Polarità soluti

7 Fasi stazionarie legate: La fase stazionaria liquida, trascinata dal gas di trasporto, si impoverisce inevitabilmente con il passare del tempo (bleeding). Questo fenomeno comporta l aumento del disturbo del segnale di fondo (ad elevate temperature) (deriva) Per ovviare tale problema si lega chimicamente la fase ai gruppi idrossilici della silice di supporto o alle pareti della colonna fase stazionaria legata. Queste trattamento permette inoltre il lavaggio con solvente delle colonne contaminate Sistema di iniezione del campione Il campione viene iniettato (mediante opportuna siringa) attraverso un setto di gomma o silicone nella camera riscaldata in testa alla colonna La camera viene generalmente riscaldata circa 50 C oltre il p.e. del componente meno volatile. Per le colonne impaccate il volume del campione varia da 0.1 a 20 µl. Per le colonne capillari la portata è notevolmente inferiore (almeno un fattore di 100) e richiedono un sistema di ripartizione

8 Iniezione frazionata (split) Le colonne capillari hanno una bassa portata: è quindi necessario che solo una frazione del campione iniettato raggiunga la colonna. Il sistema di ripartizione (split) invia solo una parte del campione alla colonna e la rimanente parte viene scaricata (rapporto di frazionamento da 1:50 a 1:100). Si usa tale tecnica quando gli analiti costituiscono almeno lo 0.1% del campione Iniezione non frazionata (splitless) del campione Per campioni diluiti (gli analiti costituiscono meno dello 0.01% del campione) si utilizza la iniezione non frazionata (splitless)

9 Sistema di termostatazione della colonna La temperatura è cruciale nelle separazioni cromatografiche e pertanto la colonna è alloggiata in forni termostatati. L analisi GC può essere effettuata a T costante (isoterma) o variabile (gradiente di temperatura). Le rampe di temperatura possono essere lineari o asimmetriche con diverse fasi di plateau. Temperatura Isoterma (45 C) Isoterma (145 C) Gradiente (da 30 a 180 C)

10 Rivelatori a conducibilità termica (TCD): Rivelatore storico e ancora adesso diffuso. E un esempio di rivelatore robusto e universale. Il rivelatore dipende da un elemento riscaldato elettricamente (filamento di tungsteno o platino), la cui temperatura dipende dalla conducibilità termica del gas che lo circonda. He e H 2 buona conducibilità termica. La presenza di analiti (organici e inorganici) riduce la conducibilità termica del gas con conseguente temperatura filamento (segnale) Vantaggi: detector semplice e robusto, universale, range dinamico Svantaggi: bassa sensibilità

11 Rivelatori a cattura di elettroni (ECD): Risponde in maniera selettiva a composti organici contenenti alogeni. Il gas che entra nel rivelatore viene ionizzato da elettroni ad alta energia (radiazioni β) emessi da una lamina contenente 63 Ni radioattivo. La ionizzazione del gas di trasporto (solitamente N 2 ) genera un flusso di elettroni attratti dall anodo (corrente stazionaria). Quando le molecole dell analita ad elevata affinità elettronica entrano nel rivelatore, catturano gli elettroni riducendo la corrente Vantaggi: sensibilità elevata per composti alogenati Svantaggi: non sensibile per ammine, alcoli e idrocarburi

12 Derivatizzazione in GC La derivatizazzione è un processo che permette di modificare chimicamente un composto (es. altobollente) al fine di ottenere un nuovo composto le cui proprietà chimico-fisiche sono compatibili con l analisi GC La derivatizzazione permette le seguenti modifiche: - aumento la volatilità (elimina la presenza di gruppi polari come OH, SH, NH) - riduzione volatilità (permette l analisi di composti volatili a basso peso molecolare difficili da maneggiare e che coeluiscono con il solvente) - aumenta la stabilità - aumenta la sensibilità (inserimento di gruppi alogenati per ECD) Le principali reazioni di derivatizzazione sono: Silanizzazione Alchilazione acilazione Derivatizzazione mediante silanizzazione La reazione di silanizzazione produce composti volatili e stabili termicamente. In tale reazione l H attivato viene sostituito con un gruppo trimetilsililico mediante una reazione di attacco nucleofilo (SN2; la reazione è guidata dal gruppo uscente) L agente silanizzante più semplice è il trimetilclorosilano (CH 3 ) 3 -Si-Cl (TMS-Cl). -OH -SH -COOH -NH 2 -NH CONH 2 TMS-Cl -OTMS -STMS -COOTMS -NHTMS, N(TMS) 2 -NTMS CONHTMS La reattività del gruppo funzionale verso la silanizzazione il seguente: Alcoli (primario> secondario>terziario) > fenolo > carbossile > ammina> ammide

13 Dato che i reattivi reagiscono con H 2 O, è necessario usare solventi anidri (la piridina è il solvente più utilizzato) Le colonne caratterizzate da idrogeni attivi (CARBOVAX) non sono compatibili con questi derivatizzanti principali agenti silalizzanti (CH3) 3 -Si-Cl (TMS-Cl). TMS-Cl TRIMETILCLOROSILANO (CH 3 ) 3 Si-imidazolo TMSIM (trimetilsililimidazolo) NB selettivo per OH, non reagisce con ammine (CH 3 ) 3 -Si-O-C(CH 3 )=N-Si(CH 3 ) 3 BSA (N,O-bis-trimetilsilil-acetamide) (CH 3 ) 3 -Si-N(C2H5)2 TMS-DEA (N-trimetilsilil-dietilamina) NH OH Anidride trifluoroacetica

14 Applicazione gas-cromatografia Analisi qualitativa Analisi quantitativa Conferma presenza/assenza di un composto in una data miscela (necessità dello std.)

15 Analisi quantitativa in gas-cromatografia La gascromatografia è ampiamente usata per l analisi quantitativa: l altezza o l area dei picchi è proporzionale con la quantità dei diversi componenti la miscela analizzata Esistono diversi metodi di misura della concentrazione tra cui: 1. Normalizzazione interna: è il metodo usato per determinare la composizione percentuale quando tutti i componenti della miscela sono rappresentati nel cromatogramma 2. Metodo della standardizzazione esterna: consente di determinare la concentrazione di uno o più componenti utilizzando lo std. e allestendo la curva di calibrazione 3. Aggiunta singola o multipla In GC si preferisce l uso di uno std. interno che consente analisi quantitative più accurate: tale tecnica prevede l aggiunta di una molecola alla miscela da analizzare in quantità nota. Curva di calibrazione: l asse delle y non fa riferimento all area del picco dell analita ma al rapporto tra l area del picco dell analita e quella dello std. interno Lo std. interno deve soddisfare i seguenti requisiti: - Non essere presente nella miscela da analizzare - Essere ben risolto dagli altri componenti - Avere un TR simile a quello dell analita - Avere una concentrazione simile a quella dell analita - Non contenere impurezze - Non reagire con il campione

16 Applicazioni della GC in EU V ed. Determinazione titolo Identificazione e analisi quantitativa di droghe Determinazione quantitativa e semiquantitativa di impurezze Solventi residui Pesticidi CHOLESTEROL Cholesterolum C 27 H 46 O M r DEFINITION Cholesterol contains not less than 95.0 per cent of cholest-5-en-3β-ol and not less than 97.0 per cent and not more than per cent of total sterols, calculated with reference to the dried substance. ASSAY Examine by gas chromatography (2.2.28), using pregnenolone isobutyrate CRS as the internal standard. Internal standard solution. Dissolve g of pregnenolone isobutyrate CRS in heptane R and dilute to ml with the same solvent. Test solution. Dissolve 25.0 mg of the substance to be examined in the internal standard solution and dilute to 25.0 ml with the same solution. Reference solution. Dissolve 25.0 mg of cholesterol CRS in the internal standard solution and dilute to 25.0 ml with the same solution. The chromatographic procedure may be carried out using: a fused-silica column 30 m long and 0.25 mm in internal diameter coated with poly(dimethyl)siloxane R (film thickness 0.25 µm), helium for chromatography R as the carrier gas with a split ratio of 1:25 at a flow rate of 2 ml/min, a flame-ionisation detector, maintaining the temperature of the column at 275 C, that of the injection port at 285 C and that of the detector at 300 C. Inject 1.0 µl of each solution. The assay is not valid unless the resolution between the peaks due to pregnenolone isobutyrate and cholest-5-en-3β-ol in the chromatogram obtained with the reference solution is at least Calculate the percentage content of cholest-5-en-3β-ol, using the declared content of cholest-5-en-3β-ol in cholesterol CRS. Calculate the percentage content of total sterols by adding together the contents of cholest-5-en-3β-ol and other substances with a retention time less than or equal to 1.5 times the retention time of cholest-5-en-3β-ol. Disregard the peaks due to the internal standard and the solvent.

17 RRR-α-TOCOPHEROL RRR-α-Tocopherolum C 29 H 50 O 2 M r DEFINITION (2R)-2,5,7,8-Tetramethyl-2-[(4R,8R)-4,8,12-trimethyltridecyl]-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-6-ol. Content: 94.5 per cent to per cent. Related substances. Gas chromatography (2.2.28): use the normalisation procedure. Internal standard solution. Dissolve 1.0 g of squalane R in cyclohexane R and dilute to ml with the same solvent. Test solution (a). Dissolve g of the substance to be examined in 10.0 ml of the internal standard solution. Test solution (b). Dissolve g of the substance to be examined in 10 ml of cyclohexane R. Reference solution (a). Dissolve g of α-tocopherol CRS in 10.0 ml of the internal standard solution. Reference solution (b). Dissolve 10 mg of α-tocopherol R and 10 mg of α-tocopheryl acetate R in cyclohexane R and dilute to ml with the same solvent. Column: material: fused silica; size: l = 30 m, Ø = 0.25 mm; stationary phase: poly(dimethyl)siloxane R (film thickness 0.25 µm). Carrier gas: helium for chromatography R. Flow rate: 1 ml/min. Split ratio: 1:100. Temperature: Time (min) Column Injection port 290 Detector 290 Temperature ( C) Detection: flame ionisation. Injection: 1 µl of test solution (b) and reference solution (b). System suitability: reference solution (b): resolution: minimum 3.5 between the peaks due to α-tocopherol and α- tocopheryl acetate. Limits: total: maximum 4.0 per cent;

18 STAR ANISE OIL OIL Anisi stellati aetheroleum DEFINITION Essential oil obtained by steam distillation from the dry ripe fruits of Illicium verum Hook. fil. Chromatographic profile. Gas chromatography (2.2.28): use the normalisation procedure. Test solution. Dissolve 200 µl of the substance to be examined in 1.0 ml of hexane R. Reference solution. To 1.0 ml of hexane R, add 20 µl of linalol R, 20 µl of estragole R, 20 µl of α-terpineol R, 60 µl of anethole R and 30 µl of anisaldehyde R. Column: material: fused silica, size: l = 30 m, Ø = 0.25 mm, stationary phase: macrogol R (film thickness 0.25 µm). Carrier gas: helium for chromatography R. Flow rate: 1.0 ml/min. Split ratio: 1:100. Detection: flame ionisation. Injection: 0.2 µl. resolution: minimum 1.5 between the peaks due to estragole and α-terpineol. Using the retention times determined from the chromatogram obtained with the reference solution, locate the components of the reference solution in the chromatogram obtained with the test solution and locate cis-anethole and foeniculin using the chromatogram shown in Figure (disregard any peak due to hexane). Determine the percentage content of these components. The percentages are within the following ranges: linalol: 0.2 per cent to 2.5 per cent, estragole: 0.5 per cent to 6.0 per cent, α-terpineol: less than 0.3 per cent, cis-anethole: 0.1 per cent to 0.5 per cent, trans-anethole: 86 per cent to 93 per cent, anisaldehyde: 0.1 per cent to 0.5 per cent, foeniculin: 0.1 per cent to 3.0 per cent.

19 1. Linalol 3. α-terpineol 5. trans-anethole 7. foeniculin 2. estragole 4. cis-anethole 6. anisaldehyde 5.4. RESIDUAL SOLVENTS SOLVENTS LIMITING RESIDUAL SOLVENT LEVELS IN ACTIVE SUBSTANCES, EXCIPIENTS AND MEDICINAL PRODUCTS The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) has adopted Impurities Guidelines for Residual Solvents which prescribes limits for the content of solvents which may remain in active substances, excipients and medicinal products after processing. This guideline, the text of which is reproduced below, excludes existing marketed products. The European Pharmacopoeia is, however, applying the same principles enshrined in the guideline to existing active substances, excipients and medicinal products whether or not they are the subject of a monograph of the Pharmacopoeia. All substances and products are to be tested for the content of solvents likely to be present in a substance or product.

20 Class 1 solvents: Solvents to be avoided Known human carcinogens, strongly suspected human carcinogens, and environmental hazards. Solvent Table 1. Class 1 solvents in pharmaceutical products (solvents that should be avoided) Concentration limit (ppm) Concern Benzene 2 Carcinogen Carbon tetrachloride 4 Toxic and environmental hazard 1,2-Dichloroethane 5 Toxic 1,1-Dichloroethene 8 Toxic 1,1,1-Trichloroethane Class 2 solvents: Solvents to be limited Non-genotoxic animal carcinogens or possible causative agents of other irreversible toxicity such as neurotoxicity or teratogenicity. Solvents suspected of other significant but reversible toxicities. The concentration limits in ppm stated in Table 2 can be used. They were calculated using equation (1) below by assuming a product mass of 10 g administered daily.

21 Solvent Table 2. Class 2 solvents in pharmaceutical products PDE (mg/day) Acetonitrile Chlorobenzene Chloroform Cyclohexane ,2-Dichloroethene Dichloromethane ,2-Dimethoxyethane N,N-Dimethylacetamide N,N-Dimethylformamide ,4-Dioxane Ethoxyethanol Ethyleneglycol Concentration limit (ppm) Formamide Hexane Methanol Methoxyethanol Methylbutylketone Methylcyclohexane N-Methylpyrrolidone Nitromethane Pyridine Sulfolane Tetrahydrofuran Tetralin Toluene ,1,2-Trichloroethene Xylene* *usually 60 per cent m-xylene, 14 per cent p-xylene,9 per cent o-xylene

22 Class 3 solvents: Solvents with low toxic potential Solvents with low toxic potential to man; no health-based exposure limit is needed. Class 3 solvents have PDEs of 50 mg or more per day. Class 3 includes no solvent known as a human health hazard at levels normally accepted in pharmaceuticals. However, there are no long-term toxicity or carcinogenicity studies for many of the solvents in Class 3. Available data indicate that they are less toxic in acute or short-term studies and negative in genotoxicity studies. It is considered that amounts of these residual solvents of 50 mg per day or less (corresponding to 5000 ppm or 0.5 per cent under Option l) would be acceptable without justification. Higher amounts may also be acceptable provided they are realistic in relation to manufacturing capability and good manufacturing practice. Table 3. Class 3 solvents which should be limited by GMP or other quality-based requirements Acetic acid Acetone Anisole 1-Butanol 2-Butanol Butyl acetate tert-butylmethyl ether Cumene Dimethyl sulphoxide Ethanol Ethyl acetate Ethyl ether Ethyl formate Formic acid Heptane Isobutyl acetate Isopropyl acetate Methyl acetate 3-Methyl-1-butanol Methylethylketone Methylisobutylketone 2-Methyl-l-propanol Pentane 1-Pentanol 1-Propanol 2-Propanol Propyl acetate

23 residui solventi Il metodo di determinazione dei solventi residui prevede una analisi in spazio di testa Impurezze di solventi in una cefalosporina analizzata mediante spazio di testa (glicole etilenico come solvente)