Corso di Laurea in Biotecnologie per la Salute. Biochimica clinica

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1 Corso di Laurea in Biotecnologie per la Salute Biochimica clinica Argomenti della lezione Infiammazione Risposta metabolica al trauma Risposta delle proteine della fase acuta Valutazione laboratoristica delle proteine dalla fase acuta

2 Infiammazione L organismo reagisce agli eventi dannosi attivando una risposta infiammatoria, dapprima locale e in seguito sistemica e metabolica. L'infiammazione è una risposta protettiva il cui obiettivo finale è l'eliminazione della causa iniziale dei danno cellulare (microrganismi, tossine) e delle sue conseguenze (ad esempio cellule e tessuti necrotici).

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4 I diversi tipi di reazioni infiammatorie Le reazioni infiammatorie sono differenziabili in base a: agente scatenante, Componenti reclutati nella difesa immunitaria, Mediatori prodotti, Cellule accumulate al sito della reazione Tipo Componenti scatenanti Cellule Infiammatorie Mediatori Meccanismi Presentazioni cliniche Risposta Acuta Complemento (via alternativa) Macrofagi e neutrofili Complemento Rilascio di citochine Infezioni batteriche, (aspecifica) traumi Risposta Acuta (da Ag-Ac) IgM e IgG (via classica del complemento) Macrofagi e neutrofili Complemento Rilascio di citochine Malattie Auto immunitarie Allergica IgE Mast cellule, basofili, eosinofili Istamina, Leucotrieni Attivazione delle mast cellule Orticaria, anafilassi Cellulomediata Linfociti T Linfociti e macrofagi Citochine Attivazione dei macrofagi Tubercolosi, sarcoidosi

5 Danno tissutale Infezione Reazione autoimmunitaria Reazione locale Attivazione di macrofagi, piastrine, monociti Produzione di TNFα, IL-1, IL-6 (IL-8, GM-CSF, PLA 2) Reazione sistemica Ipotalamo Ipofisi Fegato Midollo osseo Sistema immunitario Febbre ACTH cortisolo Proteine Fase acuta Leucocitosi anemia Proliferazione linfocitaria

6 Risposte sistemiche Le risposte sistemiche possono essere: 1) Attivate da IL1, IL6 e TNFa: Alterazione della temperatura corporea (mediante sintesi di PGE2) Secrezione di ACTH Effetto sul sistema emopoietico: riduzione dell eritropoiesi, aumentata produzione di neutrofili e trombociti 2) Attivate da varie citochine: Attivazione epatica della risposta della fase acuta

7 I diversi tipi di risposte sistemiche al trauma Comprendono: 1) Attivazione del complemento 2) Citochine 3) I derivati dell acido arachidonico 4) La chemiotassi

8 1) Attivazione del complemento Il complemento è costituito da una ventina di proteine circolanti capaci di interagire con le membrane biologiche e con specifici recettori situati sulla superficie di diversi tipi cellulari, hanno la capacità di opsonizzare i patogeni e di indurre una serie di reazioni infiammatorie che aiutano a combattere le infezioni. Via classica di attivazione del complemento Via alternativa di attivazione del complemento

9 Via classica di attivazione del complemento

10 Via alternativa di attivazione del complemento

11 Le due vie convergono in una via finale comune che porta alla attivazione del complesso di attacco alla membrana o MAC (membrane attack complex) costituita da una struttura multiproteica lipofila a forma di poro che provoca la lisi cellulare.

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14 2) Le citochine Messaggeri solubili (in genere glicoproteine) prodotte sia da cellule immunitarie che non immunitarie Regolano la risposta infiammatoria, il sistema immunitario, la crescita e la differenziazione cellulare, agendo in maniera autocrina, paracrina ed endocrina. Sono le dirette responsabili sia dell aumento delle proteine di fase acuta positive sia delle modificazioni ematopoietiche, metaboliche e neuroendocrine della fase acuta dell infiammazione. Es. la febbre è indotta dalle citochine che fungono da pirogeni endogeni sull ipotalamo, dove stimolano la sovra-regolazione del set point ipotalamico per il controllo della temperatura corporea.

15 Le citochine si classificano in: interleuchine (IL) interferoni (INF) Fattori di necrosi tumorale (TNF) Fattori di crescita (GF) e colony-stimulating factors (CSF) Quelle essenziali per l infiammazione sono IL1, IL6 e il TNFa

16 3) I derivati dell acido arachidonico (prostaglandine, leucotrieni) L acido arachidonico è prodotto dai fosfolipidi di membrana per azione della fosfolipasi A. Sintesi e ruolo dei derivati dell acido arachidonico

17 4) La chemiotassi I principali mediatori coinvolti nella chemiotassi sono: C5a Peptidi N-formilati LCTB 4 PAF La chemiotassi si realizza secondo queste tre fasi Ferma adesione, mediante integrine (ICAM, VCAM), all endotelio vascolare Migrazione attraverso i gap dell endotelio Migrazione attraverso il tessuto secondo un gradiente chemiotassico

18 I mediatori chimici, una volta attivati portano ad una serie di eventi a cascata tipici dell'infiammazione, che sono sintetizzti in: Calor e Rubor (vasodilatazione), Tumor (vasopermeabilità), Dolor(edema e mediatori flogistici), Functio lesa (effetto finale della risposta infiammatoria)

19 A seconda del tipo e dell estenzione del trauma, l organismo attua diverse strategie: Risposta metabolica al trauma Risposta delle proteine della fase acuta

20 Comprende due fasi: Risposta metabolica al trauma Può considerarsi una risposta fisiologica di protezione 1) Fase di deflusso (ebb-phase): è generalmente breve e corrisponde allo shock clinico, derivante da una ridotta perfusione del tessuto 2) Fase di flusso (flow-phase): può avere una durata di giorni o settimane. Il metabolismo è alterato per garantire che l energia prodotta sia a disposizione del tessuto interessato, a scapito del muscolo e delle riserve di grasso Cambiamento metabolico Aumento della glicogenolisi e della glucogenogenesi Aumento della lipolisi Aumento della proteolisi Conseguenze Aumento del glucosio ematico da usare come substrato energetico Aumento degli acidi grassi liberi da usare per fornire energia Aumento di amminoacidi che sono catabolizzati per produrre energia o usati per la sintesi dei tessuti

21 Le fasi della risposta metabolica al trauma

22 Risposta delle proteine della fase acuta Si possono osservare variazioni caratteristiche nella concentrazione di alcune proteine plasmatiche in seguito a intervento chirurgico, a trauma, durante processi infettivi o durante lo sviluppo di tumori proteine della fase acuta La risposta delle proteine alla fase acuta è un aumento o una diminuzione della produzione (principalmente da parte del fegato) di alcune proteine citochine TNF Evento traumatico Infiammazione proteine della fase acuta

23 Le proteine della fase acuta Si definisce proteina della fase acuta (APP) quella proteina la cui concentrazione plasmatica aumenta (APP positiva) o diminuisce (APP negativa) di almeno il 25% durante le reazioni di fase acuta. Sono considerate i nuovi recettori solubili del danno esogeno ed endogeno prodotto da stimoli biologici, chimici e fisici Possiedono le caratteristiche tipiche per essere individuati e misurati ed i loro valori nei fluidi biologici, valutati nel singolo paziente, sono correlabili con il rischio di malattia, lo stato e l evoluzione della malattia stessa (trait, state, progression)

24 La risposta delle proteine della fase acuta Tipo di proteina Aumento Diminuzione Inibitori delle proteasi α1-antitripsina Proteine della coagulazione α2-macroglobulina Fibrinogeno Protrombina Fattore VIII Plasminogeno Proteine C1s del complemento Varie C2, B, C3, C4, C5, C56, C1 INH Aptoglobulina Ceruloplasmina PCR Proteina A nel siero Albumina HDL LDL

25 Le proteine della fase acuta Proteine Concentrazione normale (g\l) Tempo di reazione (ore) Aumento (X normale) CRP < 0, SAA A1-antichimotripsina < 0,030 0,3-0, A1-glicoproteina acida A1-antitripsina Aptoglobina fibrinogeno C3 C4 ceruloplasmina 0,5-1,4 1,9-3,5 0,7-3,8 2,0-4,5 0,5-1,2 0,2-0,5 0,15-0, < 2

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27 I PRRs nell attivazione delle APP positive L aumento delle APP è attivato dai PRRs (pattern recognition receptors), recettori che riconoscono con precisione caratteristiche tipiche delle molecole diffusamente utilizzatedai microbi (PAMP, pathogen associated molecular patterns) e che possono anche interagire con componenti self (quali per es., le proteine indotte da stress). In particolare, durante infezioni e stress vengono attivati PRRs di membrana (es., recettori spazzini/scavenger, recettori toll-like) PRRs citoplasmatici (es., NOD, NALP3 che sono espressi dalle cellule dell immunità naturale e dell infiammazione, come fagociti neutrofili e monociti/ macrofagi). I PRRs attivati, attraverso una serie di pathways intracellulari che portano all attivazione dell NF-kB (elemento chiave nel controllo di geni della risposta infiammatoria) producono citochine infiammatorie, in particolare TNF-a, IL-1 e IL-6.

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30 Classificazione delle APP+ basata sulle citochine che ne stimolano la produzione le APP-tipo I, il cui prototipo è la SAA, sono indotte da IL-1a e b; da TNF-a e b La APP-tipo 2, il cui prototipo è la PCR, sono indotte da IL-6 e 11; Leukemia inhibitor factor, oncostatina M.

31 Le APP positive Pentrassine corte Collettine Proteine del sistema del complemento LPS binding protein Proteine del sistema della coagulazione e della fibrinolisi Antiproteasi Proteine di trasporto PCR SAA (proteina A dell Amiloide) MBL SPA e SPD (proteine del surfactante polmonare) Ficoline L-, M- e H- C3, C4, C9 inibitore del C1q, prot legante C4b Fibrinogeno, plasminogeno, attivatore del plasminogeno tissutale, Proteina S, vitronectina A1antitripsina e a1 anti-chimotripsina Ceruloplasmina, aptoglobina, emopessina

32 Le nuove APP Glicoproteina acida a-1 CD14 solubile: è la forma solubile del CD14, una proteina di membrana dei monociti-macrofagi, che funziona come recettore per l LPS. Infatti I suoi livelli sierici aumentano come conseguenza dell attivazione LPS-mediata dei monociti-macrofagi Proteine S100: molecole pro-infiammatorie espresse e secrete dai fagociti. S100A8, -A9 e -A12 sono iperespressi a livello del sito della flogosi. NB. L eterodimero S100A8-A9, oggi noto come proteina leucocitaria L1, era noto come calprotectina. Sono utili marker diagnostici in caso di artriti, polmoniti croniche, malattie intestinali; sono indici di attivazione dei fagociti; sono in grado di rilevare livelli di infiammazione minima residua; sono indici predittivi per la prognosi del paziente. Procalcitonina (PCT): in conzioni fisiologiche è prodotta da cell C della tiroide. Nell infiammazione è prodotta dal fegato e dai PMN. È un utile marker diagnostico di infezioni batteriche gravi, ma non di infezioni virali. Infatti è attualmente in uso in terapia intensiva nella diagnosi precoce e nel monitoraggio della sepsi.

33 Il quadro proteico elettroforetico (QPE) nella fase acuta α1- globuline aumentano precocemente, per l aumento di a1- antitripsina α2-globuline aumentano subito dopo, per l aumento di aptoglobina e ceruloplasmina Raramente aumentano le β-globine, per l aumento di PCR e fibrinogeno Invece, l albumina e la transferrina diminuiscono nalla fase acuta

34 Aumentano nella fase acuta dell infiammazione in ordine di tempo Proteina C reattiva A1antichimotripsina Aptoglobina A1glicoproteina acida A1antitripsina C4 Fibrinogeno C3 Ceruloplasmina I migliori indicatori della fase reattiva acuta sono le proteine che subiscono gli incrementi maggiori: aumenti moderati nelle infezioni virali, notevoli in quelle batteriche

35 Proteine negative della fase acuta Sono le proteine che diminuiscono durante la fase acuta dell infiammazione. Questo è dovuto 1) perchè l iper-produzione delle APP positive limita la riserva aminoacidica 2) Perchè, come accade per l alb, fuoriescono dai vasi sangugni negli essudati infiammatori Albumina Trans-tiretina Alfa-fetoproteina Transferrina a2-glicoproteina

36 La diagnosi dell infiammazione Per la diagnosi dell infiammazione si effettua: Misurazione della temperatura corporea Conta dei globuli bianchi ed esame della formula, che permette di stabilire se l infiammazione è provocata da agenti batterici o virali, se si tratta di un processo infiammatorio cronico o di una reazione allergica Analisi delle proteine di fase acuta o di marcatori non proteici, come la VES o la PCR, può essere utile per monitorare il progredire della patologia o l effetto della terapia

37 Conta dei globuli bianchi ed esame della formula infiammazioni da agenti batterici: leucocitosi (> ) con neutrofili > 80% Infiammazioni da virus: WBC normali o poco aumentati, in genere linfocitosi Infiammazioni croniche: WBC normali o poco aumentati Reazioni allergiche o parassitosi: WBC normali o poco aumentati, eosinofilia

38 VES (velocità di eritosedimentazione) E un indicatore molto sensibile della fase acuta (aumenta dopo circa 24 h e diminuisce 6-8 giorni dopo la risoluzione della fase acuta) E aspecifico perché è alterato (per aumento di Ig) anche in tutte le situazioni di infezione, infiammazione, disprotidemia e necrosi.

39 La formazione degli aggregati Nell infiammazione la VES aumenta perché 1) La disprotidemia favorisce l aggregazione dei GR, che sedimentano più velocemente 2) l aumento delle a-globuline e\o delle immunoglobuline favorisce la formazione di macroaggregati con i globuli rossi, che sedimentano più velocemente. rouleaux

40 Le variazioni della VES Anemie Anemie emolitiche Infezioni Neoplasie Infarto del miocardio Malattie reumatiche Malattie immunitarie Ipoalbuminemia Alterazioni/diminuzione a carico dei GR (poichilocitosi, policitemia vera, anemia drepanocitica, insuff cardiaca congestizia) Inoltre, nelle forme di natura non neoplastica l aumento delle proteine di fase acuta è in genere brusco e limitato nel tempo. Il riscontro di una reazione di fase acuta che si protrae nel tempo depone fortemente per un processo neoplastico.

41 Ciclo mestruale Fattori influenzanti la VES Contraccettivi orali Gravidanza Età neonatale Iperlipoproteinemia ed ipergammaglobulinemia Macrocitosi Microcitosi Anomalie di membrana del G.R.

42 Il Metodo ottico per la valutazione della VES Metodica: sangue citratato, aspirato in una pipetta di vetro o plastica graduata fino a 200 mm. La sedimentazione si legge dopo 1 ora Valutare la densità ottica prima e dopo (ciascun campione è letto 1000 volte in 20 sec.) Aggregation starting t = 0 Aggregation after 1000 scans t = 20 sec. Eccellente correlazione con il metodo di Westergren, metodo di riferimento secondo l ICSH

43 PCR (proteina C reattiva) È così chiamata per la sua reattività con il polisaccaride C dello Pneumococco È uno dei marcatori più sensibili, ma anche poco specifico dell infiammazione E la classica proteina della fase acuta, è costituita da 5 catene identiche = pentaxina, proteine leganti il calcio, con proprietà di difesa; infatti è capace di legarsi ad un elevato numero di sostanze, sia esogene che endogene e quindi di facilitare la loro rimozione dal circolo (opsonizzazione). La sua produzione è indotta durante l infiammazione acuta e cronica (le endotossine batteriche sono i più potenti stimoli alla produzione di PCR), ma anche in alcune neoplasie (linfoma non- Hodgkin s, Ca renale) e nelle malattie autoimmunitarie e da immunocomplessi.

44 Valori di Riferimento della PCR adulti e bambini = 0,06-10 mg\l (mediana: 0,58 mg/l) neonati < 0,06 mg\l bambini fino ad 1 mese < 1,6 mg\l Dopo un singolo stimolo, la concentrazione sierica della PCR si eleva al di sopra dei VdR entro le 6 ore, raggiungendo il picco in ore. L emivita plasmatica della PCR rimane costante sia in condizioni di salute che patologiche, così che la concentrazione di PCR circolante riflette il tasso di sintesi della proteina e quindi l intensità con cui il processo patologico ne stimola la produzione. La concentrazione di PCR circolante diminuisce rapidamente quando lo stimolo cessa. Il valore di PCR circolante riflette in maniera direttamente proporzionale il grado di infiammazione e di danno tissutale.

45 Le variazioni della PCR Un aumento di PCR è sempre indice di patologia o di infiammazione acuta o cronica, malattia autoimmunitaria o da complessi immuni, necrosi tissutale e cancro; mentre valori normali non escludono la presenza di piccoli focolai infiammatori, oppure di LES, sclerosi sistemica progressiva, dermatomiosite e colite ulcerosa, in cui la risposta della fase acuta è minima. Il grado di aumento della PCR riflette la massa o l attività del tessuto infiammato: PCR tra 10 e 50 mg\l = leggera infiammazione, localizzata (cistite, gengivite),infezioni virali PCR tra 50 e 100 mg\l =malattia più severa, infezioni da Gram+ PCR > 100 mg\l = infezione batterica da Gram-

46 Variabilità dei valori della PCR In fase acuta i valori di PCR non sono influenzati né dal ritmo circadiano né dall ingestione di cibo. I farmaci antinfiammatori o immunosoppressivi non ne influenzano i livelli: pertanto durante la terapia farmacologica, la diminuzione dei livelli di PCR è attribuibile solo all effetto reale del farmaco sulla patologia sottostante.per questo è un indice della valutazione della terapia ed è un indice prognostico.

47 Importanza diagnostica della PCR Per diagnosticare e/o monitorare un infezione, quando le indagini microbiologiche sarebbero troppo lente (complicazioni infettive post-operatorie, terapia intensiva, neonatologia, infezioni per neutropenia da chemioterapici o post-trapianto, monitorare la risposta alla terapia antibiotica) Per lo screening di un processo infiammatorio (infezioni, IMA, trombosi venose profonde, malattie reumatiche, neoplasie) Per il monitoraggio delle malattie reumatiche Per la diagnosi differenziale di alcune patologie gastrointestinali (colon irritabile da patologie organiche; colite ulcerosa da morbo di Crohn)

48 Il dosaggio di PCR e VES può essere utilizzato per monitorare il progredire della patologia o l effetto della terapia Misurando la Proteina C reattiva nel siero (PCR): la cui concentrazione cambia molto rapidamente, quindi può essere usata per il controllo giornaliero Valutando la velocità di sedimentazione degli eritrociti (VES): è una misura indiretta da fibrinogeno e delle immunoglobuline. Varia lentamente e viene utilizzata per seguire l andamento del processo infiammatorio al passare delle settimane

49 Amiloide sierica A (SAA) Apolipoproteina (lega le HDL), prodotta come proteina della fase acuta (aumenta di volte) Significato fisiologico non noto VR: < 10 mg\l Metodo di determinazione: immunonefelometria, immunoturbidimetria, RIA, ELISA, Significato clinico: parametro specifico (paragonabile alla PCR, per monitorare la fase acuta della risposta infiammatoria) ma anche sensibile, soprattutto per distinguere meglio le risposte minime E un indice molto sensibile di rigetto di trapianto (soprattutto per il trapianto renale)

50 Neopterina È sintetizzata nei macrofagi dal GTP ad opera della guanosinatrifosfato-cicloidrolasi, che è stimolata dall interferone γ, prodotto soprattutto durante la risposta immunitaria mediata dai linfociti T. E un indice che valuta l attivazione del sistema immunitario, migliore del dosaggio delle citochine Metodi di determinazione HPLC per la determinazione sulle urine, in rapporto alla concentrazione della creatinina ELISA per la determinazione sul siero

51 Indicazioni e significato clinico della neopterina Ø Determinazione dell attività di malattie associate ad attivazione della risposta immune cellulare: Infezioni virali (epatite virale, HIV: nell 80% dei casi la neopterina rimane elevata anche dopo la sieroconversione; ricomincia ad aumentare con il progredire della malattia) Infezioni batteriche o parassitarie con localizzazione intra-cellulare (tubercolosi, malaria) Diagnosi differenziale tra infezioni virali e batteriche Malattie autoimmunitarie: la neopterina segue il decorso della malattia, con variazioni che riflettono l attività della malattia Ø Valutazione prognostica e monitoraggio terapeutico: Patologie neoplastiche (soprattutto ematologiche) Infezioni (soprattutto HIV) trapianti di organi solidi: un aumento di neopterina precede di 2-7 giorni la comparsa di complicanze infettive virali o di rigetto trapianti di midollo osseo: l aplasia midollare si associa a diminuzione dei livelli di neopterina, che comincia a ricomparire circa 7 giorni prima della ricostruzione ematologica. Nel caso di infezione virale o GVH (graft versus host) reaction, la neopterina aumenta considerevolmente. Ø monitoraggio delle terapie immunomodulanti: interferone, interleuchine Ø Test di screening per escludere patologie nel sangue utilizzato per le trasfusioni

52 Valore diagnostico dei test usati per la diagnosi di infiammazione Test Elettroforesi proteine sieriche Sensibilità diagnostica moderata Specificità diagnostica minima WBC conta alta moderata VES alta minima PCR o SAA alta alta