Vettori per il clonaggio: plasmidi fagi cosmidi YAC. Vettori di espressione. Trasformazione tramite calcio cloruro

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1 Vettori per il clonaggio: plasmidi fagi cosmidi YAC Vettori di espressione Trasformazione tramite calcio cloruro Trasformazione tramite elettroporazione Produzione di DNA ricombinante Il genoma eucariotico è molto complesso: l analisi della struttura dei singoli geni e della loro regolazione è, perciò, difficile. La soluzione praticata consiste nello spezzare i cromosomi in tanti frammenti, isolarli ed analizzarli singolarmente. DNA ricombinante: un frammento di DNA di interesse di un organismo viene inserito in una molecola di DNA di un altro organismo più semplice. In genere il veicolo (vettore) in cui si inserisce il frammento è in grado di replicarsi selettivamente permettendo di amplificare il DNA di interesse. Gli ospiti per il mantenimento e l amplificazione sono, in genere, i batteri. 1

2 Vettori di clonaggio 1. Plasmidi 2. Fagi 3. Cosmidi 4. YACs Vettori per il clonaggio Plasmidi Mediante il clonaggio è possibile produrre quantità illimitate di un determinato frammento di DNA. Il DNA viene introdotto in un adatta cellula ospite ove viene replicato in accordo alla crescita e divisione della cellula. La replicazione del DNA esogeno all interno della cellula ospite è possibile solo se il DNA contiene una sequenza riconosciuta dall ospite come origine della replicazione. La maggior parte del DNA non contiene tale sequenza, perciò è necessario che il DNA da clonare sia unito ad un trasportatore o vettore di DNA, che contenga l origine della replicazione. Molti batteri contengono questo tipo di DNA, detto Plasmide. 2

3 Un plasmide è una molecola di DNA extracromosomico, relativamente piccola, circolare contenente geni che conferiscono proprietà particolari come la resistenza ad antibiotici. A partire da quelli naturali, mediante una serie di tagli e ligazioni, sono stati costruiti dei plasmidi artificiali. I requisiti di un plasmide ottimale sono i seguenti: a) essere piccolo e quindi facilmente maneggiabile e non creare problemi durante la trasformazione. b)possedere un origine della replicazione di tipo batterico c) Possedere geni che conferiscano resistenza ad antibiotici, così da permettere la selezione delle cellule trasformate d) Possedere un buon numero di siti unici di restrizione ( ricco polylinker) 3

4 Replicazione plasmidica La caratteristica più importante dei plasmidi, quella di essere dei repliconi, cioè molecole capaci di replicazione autonoma, è conferita loro dalla presenza di una origine di replicazione, chiamata ori Funzioni dell origine di replicazione Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l origine di replicazione controlla: Il numero di copie La specificità d ospite Numero di copie I plasmidi si distinguono in plasmidi a basso numero di copie, la replicazione avviene in questi casi con la stessa frequenza della divisione cellulare (regolazione stringente); e plasmidi ad alto numero di copie, la replicazione è rilassata, avviene, cioè, più frequentemente rispetto alla replicazione del DNA cromosomico. SPECIFICITA' D'OSPITE Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di specie batteriche e si di dicono a specificità d'ospite limitata ( narrow host range). Per esempio PBR322 o PUC18 che si replicano solo in E.coli Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche e si dicono a largo spettro d'ospite (Broad host range). I plasmidi a largo spettro d'ospite derivano questa loro proprietà dal possesso di alcuni geni necessari per il riconoscimento dell' origine di replicazione. Dipendono meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico. 4

5 I plasmidi sono degli elementi genetici extracromosomali che si replicano autonomamente. Variano da 1 a 200 kb e sono molto diffusi tra i procarioti. I plasmidi possono essere lineari o integrati nel cromosoma batterico (episomi) ma, nella maggior parte dei casi, sono molecole di DNA circolari Nell'ospite batterico i plasmidi si presentano come molecole circolari superavvolte, che, durante le manipolazioni sperimentali, possono rilassarsi o linearizzarsi in seguito a rotture a singolo o a doppio filamento. In un gel di agarosio e bromuro di etidio le tre forme migrano a velocità diverse e possono essere distinte. nick Plasmide superavvolto (supercoiled) Plasmide circolare rilassato Plasmide linearizzato Plasmide: forma rilassata forma lineare forma superavvolta forma linerizzata ( tagliata con un enzima di restrizione in un sito unico) vettori di clonaggio A. requisiti B. esempi Ap R restriction site ori 5

6 A. requisiti 1. Origine di replicazione (ori) 2. Siti di restrizione unici (single cut) 3. Essere selezionabili Ap R restriction site Tc R Ap R = ampicillin resistance gene Tc R = tetracycline resistance gene ori Schema di clonaggio: 1) scelta del vettore da utilizzare per il clonaggio 2) analisi del polylinker 3) digestione del vettore e del DNA di interesse con gli stessi enzimi di restrizione, in modo da creare estremità compatibili 4) caricamento del vettore e del DNA digeriti su gel di agarosio 5) recupero dal gel 6) Ligazione 7) trasformazione di cellule competenti con i prodotti di ligazione 8) recupero delle colonie cresciute su terreno selettivo 9) purificazione del DNA plasmidico e valutazione dell avvenuto clonaggio 6

7 Clonaggio di un frammento di DNA in un plasmide utilizzando la DNA ligasi. Il plasmide viene tagliato con une enzima di restrizione che produce estremità coesive e poi mescolato con il frammento di DNA da clonare, preparato con lo stesso enzima di restrizione, DNA ligasi, e ATP. Le estremità coesive appaiano, e la DNA ligasi stabilizza il legame, producendo una molecola ricombinante di DNA circolare. (Micrographs courtesy of Huntington Potter and David Dressler.) plasmide (inserto fino a~10 kb) Ap R vettore pbr322 BamHI Tc R DNA di interesse BamHI sites ori Ap R = resistenza all ampicillina Tc R = resistenza alla tetraciclina ori = origine della replicazione BamHI = sito di restrizione unico 7

8 digestione con Bam HI Tc R DNA di interesse ligazione DNA clonato Mix di [vettore con il DNA clonato], e vettore solo TB DNA di interesse 1. Isolare DNA clonato (inserto) Vettore di clonaggio 2. Digerire il DNA e il vettore 3. Ligare vettore Uno o più cloni contengono il DNA di interesse 4. Introdurre il DNA in un ospite Cellula ospite 5. Identificare il clone di interesse Cellule competenti: cellule batteriche rese capaci di accettare l ingresso di plasmidi. La membrana diviene permeabile temporaneamente in seguito al trattamento, in condizioni adeguate, dei batteri con delle soluzioni contenenti ioni Ca 2+. Selezione: discriminazione delle cellule che hanno consentito l ingresso del plasmide (portante la resistenza ad un determinato antibiotico) rispetto a quelle che non l hanno fatto (incapaci di sopravvivere in presenza dell antibiotico). 8

9 n.b.: può accadere che nella ligazione il plasmide stesso si richiuda senza accettare il frammento di DNA di interesse. Come evitare che il plasmide si richiuda su se stesso? 1) digerire sia il frammento sia il plasmide con due enzimi di restrizione diversi (in modo che l estremità 5 e 3 del vettore non siano tra loro compatibili) 2) trattare il plasmide, se tagliato con un solo enzima, con la fosfatasi alcalina prima della ligazione. La fosfatasi alcalina rimuove il gruppo 5 fosfato impedendo al plasmide di richiudersi su se stesso. Si potrà ancora formare il legame tra il gruppo 5 fosfato del frammento e quello 3 ossidrilico del plasmide. Il problema della selezione Qualunque tipo di clonaggio molecolare implica la ligazione di un inserto in un vettore e l introduzione di questo costrutto in un ospite, generalmente batterico. Questa trasformazione produce tre tipi di batteri, che bisogna riuscire a discriminare, nel modo più rapido e semplice: Batteri vuoti Batteri contenenti il vettore vuoto Batteri contenenti il vettore ligato all inserto. L uso di marcatori selezionabili, per esempio resistenze ad antibiotici, permette di distinguere facilmente i batteri vuoti, sensibili all antibiotico, da quelli contenenti il vettore, con o senza l inserto, resistenti all antibiotico. Come si possono selezionare i cloni positivi, contenenti l inserto? Tradizionalmente si può ricorrere a metodi laboriosi come l ibridazione su colonia o ad analisi di digestione con enzimi di restrizione dopo purificazione del DNA plasmidico. Molti vettori, però, contengono marker di inattivazione genica che facilitano lo screening delle colonie. 9

10 Marker di selezione È un gene il cui prodotto può essere usato per selezionare le cellule che portano il plasmide di interesse Marker di inattivazione genica E un gene che viene distrutto (inattivato) quando un gene di interesse viene clonato nel plasmide Markers di selezione e di inattivazione genica Ap R ori BamH1 Tc R trasformazione di E. coli il vettore non digerito consente ai batteri di crescere in presenza di ampicillina (Ap) e tetraciclina (Tc). Piastra di replica + ampicillina + ampicillina + tetraciclina Cosa accade se del DNA viene inserito nel sito di BamHI? il gene Tc R (tetracyline resistance) viene inattivato Un altro marker di inattivazione genica è lacz (codifica per beta-galattosidasi) Ap R ori X-gal (intatto) BamH1 lacz beta-galactosidasi taglia X-gal e ciò si manifesta con una colorazione blu O Cl O Br HO Cl Br N beta-galactosidase N O OH prodotto BLU 10

11 Le colonie che contengono il vettore SENZA un inserto sono blu. Ap R ori BamH1 lacz + ampicillina + X-gal Quelle che hanno il vettore +l inserto sono bianche Il DNA esogeno inattivattiva lacz La beta-galattosidasi non viene prodotta X-gal non viene tagliato le colonie con l inserto sono bianche,, NON blu insert X (LacZ-) X-gal X + ampicillina + X-gal DNA virale Il metodo più adatto per clonare singoli geni è ottenuto utilizzando plasmidi, poiché l inserto ha raramente dimensioni superiori alle 5Kb. In alcuni casi, come ad esempio nella costruzione di librerie di DNA, occorre clonare pezzi di DNA di dimensioni notevoli (fino a circa 20Kb). Tali inserti aumentano la dimensione del plasmide a tal punto che la trasformazione non avviene più efficacemente. 11

12 In questi casi occorre far uso del DNA dei batteriofagi (virus batterici) poiché una grossa molecola di DNA può essere introdotta nell ospite batterico da una particella virale infettiva. Un vettore molto usato è il batteriofago λ: gran parte del DNA non essenziale del batteriofago λ viene rimosso e sostituito con l inserto. Il DNA virale viene impacchettato in vitro nelle particelle virali e queste sono utilizzate per infettare cellule batteriche precedentemente seminate su piastre agar. Il DNA virale viene replicato e si originano una serie di placche di cellule lisate su un tappeto di cellule batteriche. Il DNA clonato può essere recuperato dalle placche. Vettore fagico (inserti 20 kb) a. Fago lambda (λ) λ dsdna 1/3 del genoma non-essenziale per la crescita litica (si può sostituire questa parte con DNA esogeno) TB 12

13 Il genoma del fago λ è una molecola di DNA lineare a doppio filamento lunga 48.5kb. Alle estremità si trovano delle estensioni a singolo filamento di 12 nucleotidi, complementari tra loro, che permettono al DNA di circolarizzare una volta penetrato nell ospite batterico. Il fago λ possiede delle estremità coesive naturali, che quando sono appaiate formano il sito cos. Es. di vettore fagico: Charon 4A (genetically altered λ derivative) Siti EcoRI lacz gene 1. restrizione 2. ligazione Sito cos Inserto di DNA Il DNA viene incapsulato nel capside in vitro. Infezione delle cellule ospiti si ottengono delle placche cellule di E. coli placche (regioni di cellule lisate dal fago) 13

14 placche bianche (LacZ-) Placche blu (LacZ+) Il DNA viene isolato dalle placche chiare. (Le placche blu NON contengono l inserto.) Cosmidi: un problema che si presenta quando si clonano grossi frammenti di DNA in vettori plasmidici è la bassissima efficienza di trasformazione che si ottiene con molecole molto grandi di DNA. Tale problema è stato risolto con due metodi diversi: tramite l impiego dell elettroporazione e dei vettori cosmidici. I cosmidi sono plasmidi che contengono i siti cos del fago λ che sono le sequenze λ richieste per l impacchettamento del DNA in una particella di fago λ. La lunghezza del DNA che viene impacchettato deve essere di 37-50kbasi. 14

15 Vettori YAC (cromosomi artificiali di lievito): Consistono in un vettore di clonaggio composto da due copie di una sequenza telomerica (i telomeri sono le sequenze alle estremità dei cromosomi) di lievito, di un centromero di lievito, di una ars di lievito (sequenza che si replica autonomamente dove inizia la replicazione del DNA) e di marcatori di selezione appropriati. La quantità di DNA che può essere clonata è di kb (ma si può arrivare anche a 1 megabase). Svantaggi YAC: 1) efficienza di clonaggio bassa; 2) resa di DNA YAC isolato da una colonia di lievito è molto bassa; 3) i cloni YAC spesso contengono delezioni e riarrangiamenti del DNA clonato. Tra i vettori di lievito i vettori YAC sono particolarmente importanti, perché, grazie alla dimensione degli inserti che possono contenere, sono molto utilizzati nella preparazione e screening di librerie molto complesse Vengono mantenuti e propagati in E.coli Procedura 1. Digerire parzialmente il DNA bersaglio con EcoRI e il vettore YAC con EcoRI e BamHI 2. Separare i due bracci 2. Ligare vettore YAC e inserto 3. Trasformare le cellule di lievito, selezionando per i 2 marcatori diversi posizionati ciascuno su un braccio diverso 15

16 ori trp1 ura3 trp1 ura3 Capacità di accettare inserti: Plasmidi fino a ~10 kb Fagi fino a ~ 20 kb Cosmidi fino a ~ 45 kb YACs fino a ~800 kb Espressione di geni Uno scopo della biologia molecolare è ottenere l espressione di geni estranei in cellule batteriche. L espressione può avvenire solo se si soddisfano dei requisiti: a) il gene clonato deve possedere delle sequenze che costituiscano un promotore nella zona a monte della regione codificante b) deve contenere una sequenza di Shine- Dalgarno (SD) che agisce come sito di legame dei ribosomi. 16

17 In genere i frammenti di DNA di interesse non posseggono tali regioni. Sono stati perciò costruiti dei VETTORI DI ESPRESSIONE: questi contengono le sequenze del promotore e quella di Shine-Dalgarno prima del polylinker. Vettori di espressione: vettori costruiti in modo da esprimere le sequenze in essi clonate, fondendole con dei segnali di inizio di trascrizione e traduzione. Vettore di espressione laci gene (codifica una proteina repressore) P = promotore O = operatore ori P O marker di selezione Siti di restrizione unici gene di interesse TB Produzione di grandi quantità di una proteina ricombinante. Un gene di interesse è stato clonato a valle di un promotore, per produrre grandi quantità di mrna. A seconda delle caratteristiche del vettore, gli ospiti possono essere batteri, lieviti, o cellule di mammifero. 17

18 Overespressione di una proteina usando un vettore di espressione. I batteri sono stati trasformati in modo da produrre un enzima, l elicasi; la trascrizione di tale enzima è sotto il controllo di un promotore virale che si attiva solo alla temperatura di 37 C o al si sopra di essa. L estratto proteico totale è stato analizzato in SDS-PAGE, sia per i batteri cresciuti a 25 C sia per batteri cresciuti a temperature maggiori (fino a 42 C) In tal modo il DNA estraneo viene espresso nell ospite (la proteina codificata da tale pezzo di DNA viene cioè prodotta in un organismo estraneo). Perché si abbia la produzione della proteina è necessario che il frammento di DNA sia in frame : le triplette nucleotidiche devono essere lette in maniera corretta (l inserimento nel plasmide deve essere fatto controllando la distanza dai siti regolatori). I fattori che influenzano il livello di espressione di un gene clonato sono i seguenti: a) forza del promotore b) terminazione della trascrizione c) numero di copie del plasmide d) stabilità del plasmide e) fisiologia della cellula ospite f) sequenze al sito di inizio della traduzione g) scelta dei codoni h) struttura dell mrna 18

19 Per massimizzare l espressione di un gene clonato, non è sufficiente scegliere il promotore più forte possibile perché si devono anche considerare gli effetti secondari che la sovraespressione può avere sull ospite. Le proteine ricombinanti possono essere tossiche: in breve tempo si selezionano mutanti che non producono la proteina tossica. Livelli di sintesi troppo alti, inoltre, determinano un deterioramento del metabolismo cellulare, rallentano la crescita dei cloni ricombinanti con selezione di ceppi mutanti ad espressione ridotta o nulla. Per ridurre tali problemi si ricorre all impiego di vettori nei quali l espressione dei geni clonati dipende da un promotore regolabile (T7, tac) inducibile con isopropil-βtiogalattoside (IPTG). Per avere alti livelli di espressione, inoltre, è necessario che l mrna sia tradotto efficacemente. 19

20 Alcuni fattori influenzano il tasso di traduzione, come ad esempio l interazione del ribosoma con le basi che si trovano immediatamente a monte del codone di inizio del gene. Nei batteri la sequenza chiave è la sequenza SD (nella configurazione ottimale è 5 - UAAGGAGG-3 ). Anche la distanza tra la sequenza SD ed il codone di inizio riveste un ruolo importante. L efficienza migliore si ha con 8 basi, al di sotto di 4 ed al di sopra di 14 il tasso di traduzione diminuisce di parecchi ordini di grandezza. Anche la composizione dei codoni che precedono e seguono l AUG di inizio influenza il tasso di traduzione. Il codice genetico presenta degenerazioni, in genere, però, l utilizzo dei codoni non è casuale, ma dipende dalla disponibilità dei trna nella cellula. La maggior parte dei geni più espressi di E.coli contiene soprattutto codoni per i trna più abbondanti. NOTE: limitazioni per gli eucarioti: a) poiché L mrna prodotto viene letto come triplette, per ottenere l espressione della proteina desiderata, le sequenze inserite in un vettore devono essere in frame con il modulo di lettura. 20

21 b) Per dirigere la sintesi di una proteina funzionale nei batteri, si può clonare direttamente il DNA genomico, se ottenuto da un batterio; mentre è imperativo clonare il cdna per geni eucariotici in quanto i batteri non posseggono la capacità di processare l RNA per rimuovere gli introni. c) se la proteina, per essere funzionale, necessita della glicosilazione (aggiunta di oligosaccaridi in punti precisi), non si può utilizzare il sistema batterico, ma si può ricorrere alle cellule di lievito come ospiti (sono in grado di operare alcune modificazioni post-traduzionali) Vettori che semplificano la purificazione delle proteine ricombinanti: i vettori di espressione, in molti casi, sono stati modificati in modo che il prodotto proteico ricombinante espresso sia fuso ad un altra proteina o ad un polipeptide (tag) che ne renda facile la purificazione. Esempi tipici, in tal senso, sono i vettori che portano S.m.GST (pgex vector) e i vettori che portano una coda di istidine (a monte o a valle del gene clonato) (pet vector) 21

22 Espressione di proteine di fusione AGGAAAC AGAACCATG TCC TTTG TCTT GGTAC GST BamHI HindIII GGATCCGTCGAAGCTTGATAATTAGCTGA CCTAGGCAGCTTCGAACTATTAATCGA CT AGGAAAC AGAACCATG G AGCTTGATAATTAGCTGA GST TCC TTTG TCTT GGTAC CCTAG ACTATTAATCGACT BamHI cdna IgG HindIII ATG AGGAAAC AGAACCATG TCC TTTG TCTT GGTAC GST TAA GGATCC CCTAGG cdna IgG AAGCTT TTCGAA Met GST IgG Glu Ala Gly Ser Val Ala Cys Tyr AGGAAAC AGAACCATG TCC TTTG TCTT GGTAC GST GGATCC CCTAGG cdna IgG AAGCTT TTCGAA Met GST IgG Glu Ala Gly Ser Lys Phe Met Asp AGGAAAC AGAACCATG TCC TTTG TCTT GGTAC GST GGATCCAAA CCTAGGTTT cdna IgG AAGCTT TTCGAA Met GST? 22

23 Vettori che favoriscono la solubilizzazione delle proteine espresse: un problema associato alla overespressione di proteine ricombinanti in E.coli è il sequestramento di queste in aggregati insolubili detti corpi di inclusione. Per cercare di ridurre la formazione dei corpi di inclusione si possono modificare alcuni parametri quali la temperatura di incubazione dei batteri e la velocità di crescita. In alcuni casi le proteine possono essere rinaturate mediante solubilizzazione dei corpi di inclusione con guanidina idrocloruro. In alternativa si possono usare vettori modificati geneticamente in modo da sovraesprimere, oltre alla proteina di interesse, anche una proteina che favorisca il corretto folding della proteina ricombinante. Metodi di trasformazione La trasformazione batterica è definita come il cambiamento ereditabile delle proprietà dei batteri causato dall assunzione di DNA esogeno. Gli acidi nucleici non entrano nelle cellule spontaneamente ma richiedono assistenza per attraversare le barriere fisiche e raggiungere il sito all interno della cellula dove possano essere espressi o replicati. 23

24 La competenza è la capacità di assumere DNA. In laboratorio si ricorre all uso di cellule di E. coli quali ospiti. Tali batteri non sono naturalmente competenti, ma vengono resi tali tramite pretrattamento a 0 C con soluzioni contenenti cloruro di calcio A. Trasformazione Trasferimento di DNA esogeno in un genoma batterico DNA esogeno (plasmide) Cellula trasformata La ricombinazione non è necessaria poichè il plasmide ha un origine di replicazione 24

25 1. Competenza Capacità delle cellule di acquisire DNA estraneo a. Alcune cellule sono naturalmente competenti b. Alcune cellule possono divenire competenti a seguito a trattamenti chimici e fisici. c. Molte cellule sono rese competenti tramite elettroporazione. Schema preparazione cellule competenti: a) I batteri vengono fatti crescere fino ad un OD 600 di b) Vengono posti in ghiaccio (la crescita viene bloccata) c) I batteri vengono centrifugati a basso numero di giri d) Il pellet viene risospeso nel tampone contenente i cationi divalenti e posto di nuovo in ghiaccio e) Centrifugazione a basso numero di giri f) I batteri vengono recuperati, risospesi in tampone contenente ioni divalenti e glicerolo al 15%, aliquotati e messi a -80 C. 25

26 Si è notato che la capacità competente è maggiore dopo 24 ore di conservazione a freddo delle cellule. La vitalità cellulare e la capacità competente diminuiscono con il tempo (solitamente sono utilizzabili per circa 6 mesi dalla data di preparazione). Il trattamento dei batteri con soluzioni contenti, oltre al CaCl 2, anche Mg 2+, Rb 2+ o K +, aumenta l efficienza di trasformazione. I cationi divalenti possono avere 3 ruoli nell aiutare la trasformazione: 1) i cationi divalenti schermano le cariche negative sul DNA (gruppi fosfato) e sulla superficie della cellula (fosfolipidi e lipopolisaccaridi di superficie) così che il DNA può entrare più facilmente in stretto contatto con la cellula 2) la combinazione di bassa temperatura e cationi divalenti può aiutare a cristallizzare regioni della membrana rendendo accessibili i canali di assunzione del DNA 3) i cationi divalenti possono aiutare a riorganizzare i lipopolisaccaridi lontano dai canali che normalmente sovrastano L ingresso effettivo dell acido nucleico esogeno è provocato dallo shock termico. Trasformazione tramite elettroporazione: L esposizione di cellule animali, vegetali e batteri ad impulsi elettrici ad alto voltaggio destabilizza la membrana cellulare ed induce la formazione transiente di pori che favorisce l ingresso delle molecole di DNA. Tale metodo è rapido, semplice e efficiente. In genere l efficienza di trasformazione è circa volte maggiore per cellule preparate tramite elettroporazione rispetto a quelle trattate chimicamente. 26

27 Elettroporazione cellule + DNA Elettrodo - elettrodo + Un breve impulso elettrico favorisce la formazione di pori nella membrana cellulare e il DNA entra TB Tramite elettroporazione, inoltre, è possibile introdurre, nelle cellule ospiti, anche molecole di DNA di notevoli dimensioni. I fattori che influenzano l efficienza dell elettroporazione sono la temperatura, i parametri elettrici (voltaggio, resistenza, ), il tipo di DNA utilizzato e le caratteristiche delle cellule riceventi (condizioni di crescita, trattamento postelettroporazione). La preparazione delle cellule per l elettroporazione è semplice: a) batteri vengono fatti crescere fino ad un OD 600 di 0.5 raccolti tramite centrifugazione e lavati accuratamente con una soluzione tampone a basso contenuto di sali per ridurre la forza ionica della sospensione cellulare b) I batteri, poi, vengono risospesi in glicerolo al 10% alla concentrazione di 3x10 10 cell/ml, congelati in ghiaccio secco e conservati a -80 C per un periodo di 6 mesi. c)l elettroporazione avviene a 0-4 C. Il DNA viene miscelato con la sospensione di batteri e trasferito in cuvetta. La ditta che costruisce l elettroporatore specifica le condizioni da usare (voltaggio da applicare, tempo di esposizione, ) necessari per ottenere i risultati migliori. 27