CRIOCONSERVAZIONE DEI MICRORGANISMI: SISTEMA PROTECT

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1 numero 8 settembre 2008 CRIOCONSERVAZIONE DEI MICRORGANISMI: SISTEMA PROTECT I laboratori microbiologici, in ambito alimentare e farmaceutico così come in altri settori, utilizzano regolarmente standard di riferimento per convalidare le procedure analitiche. Agli standard fisici e chimici vanno aggiunti gli standard microbiologici: si tratta di ceppi microbici indicati da organismi internazionali come riferimento per vari tipi di test. L esempio più classico è la verifica della fertilità dei terreni di coltura, eseguita seminando su piastra un determinato numero di UFC (unità formanti colonie) di specifici ceppi microbici. Sono proprio gli organismi internazionali a specificare le collezioni primarie di riferimento (ATCC, NCTC,...) e le caratteristiche del ceppo da utilizzare (numero di passaggi, UFC, ). I singoli laboratori hanno poi la possibilità di scegliere se mantenere delle ceppoteche interne a cui attingere (colture stock) oppure se acquistare ceppi liofilizzati, certificati e standardizzati, già pronti all uso. In questo senso, per una scelta ottimale vanno valutati alcuni fattori: - frequenza dei test: un utilizzo occasionale di ceppi è molto semplificato dall acquisto di ceppi già pronti, certificati e standardizzati, mentre un uso intensivo o frequente rende più vantaggiosa (anche dal punto di vista economico) la ceppoteca. - microrganismi utilizzati: la gestione di ceppoteche di microrganismi diversi può risultare difficoltosa e richiedere maggiori risorse umane. Bisogna anche considerare gli aspetti legati alla conservazione di ceppi potenzialmente pericolosi. - disponibilità di attrezzature di laboratorio adeguate alla manipolazione di microrganismi, con la messa a punto di procedure che garantiscano il mantenimento delle caratteristiche originarie del microrganismo. 1. TEMPERATURE DI CONSERVAZIONE I laboratori che optano per l utilizzo di ceppi microbici pronti all uso si attengono alle istruzioni del produttore per la loro conservazione. Tipicamente i microrganismi si KAIROSafe review n. 8, settembre /8

2 trovano in forma liofilizzata, molto stabile, e possono essere conservati a +2/+8 C oppure a -20 C, a seconda delle caratteristiche del prodotto. Per quanto riguarda le ceppoteche, si utilizzano basse temperature (-20 C, -80 C, azoto liquido), in grado di garantire la conservazione ottimale per tempi lunghi. In questo caso si parla di crioconservazione. Per l utilizzo in routine, dalle colture stock si preparano delle subculture che possono essere mantenute in provetta a +2/+8 C per qualche settimana, subendo anche ulteriori passaggi per prolungarne il mantenimento. 2. CRIOPRESERVAZIONE Se si opta per la crioconservazione delle colture stock, diventa cruciale la preparazione iniziale della coltura, che deve essere protetta dai danni provocati dal processo di congelamento (sbilancio osmotico e formazione di cristalli di ghiaccio). Si utilizzano cryovial da 1 o 2 ml. Tipicamente, viene preparata una sospensione molto densa di microrganismo (10 7 UFC/ml o più) in terreno nutriente a cui è stata aggiunta una percentuale di agente criopreservante. Gli agenti criopreservanti utilizzati sono di preferenza il dimetilsolfossido (DMSO) o il glicerolo, in percentuali variabili dal 5 al 10%. La percentuale di cellule recuperate dopo lo scongelamento dipende da vari fattori, che bisogna tenere presenti in questa fase iniziale. - numero di CFU della sospensione originaria: maggiore è il numero iniziale, maggiore sarà il recupero. - qualità del terreno nutriente utilizzato: il terreno deve essere fresco ed adeguato alle specifiche esigenze del ceppo da conservare. - percentuale di agente criopreservante: va utilizzata la maggior quantità tollerata dal ceppo. - velocità di congelamento: influenza la dimensione dei cristalli di ghiaccio che si formano durante il processo; una diminuzione di 1 C al minuto dalla temperatura ambiente è ottimale per la maggior parte dei microrganismi. 3. SCONGELAMENTO E SUBCULTURA Regolarmente, viene scongelata una cryovial dalla ceppoteca in modo da ottenere il ceppo da utilizzare per i controlli e le subculture. La cryovial viene messa in bagno termostatato a 37 C per favorire lo scioglimento, quindi il suo contenuto viene sospeso in terreno fresco ed il ceppo ripreso e piastrato su terreno agarizzato. Dalla piastra, dopo incubazione e sviluppo di colonie, il ceppo viene recuperato per un utilizzo KAIROSafe review n. 8, settembre /8

3 immediato. La subcultura viene ottenuta trasferendo alcune colonie in provetta contenente terreno nutriente agarizzato. In questa fase, i passaggi ripetuti possono aumentare il rischio di contaminazione del ceppo e comportarne delle modifiche. 4. SISTEMA PROTECT Le tecniche messe a punto per proteggere le cellule durante il congelamento sono state affinate nel corso degli ultimi decenni. Per evitare i rischi di contaminazione e modifica del ceppo originario, che le classiche tecniche di congelamento, scongelamento e subcoltura possono provocare, sono stati ideati dei sistemi alternativi molto validi. La Technical Service Consultants (TSC) ha messo a punto più di 20 anni fa il Sistema, che associa la presenza di una sostanza crio-preservante all adesione dei microrganismi a speciali perline in ceramica porosa (Figura 1) Figura 1: Sistema Il sistema è costituito da una cryovial contenente: - terreno nutriente crio-preservante con glicerolo, che previene il danno cellulare dovuto al congelamento - 20 perline di ceramica porosa colorata, sulla cui ampia superficie aderiscono i micorganismi. Le perline hanno diversi colori, che permettono di differenziare i microrganismi conservati e corrispondono al colore del tappo delle cryovials. La sterilizzazione è assicurata dal trattamento con raggi gamma. La tecnica di utilizzo è molto semplice e permette di ottenere direttamente su piastra il ceppo originario, senza ulteriori passaggi. KAIROSafe review n. 8, settembre /8

4 4.1 Preparazione della ceppoteca con il Sistema 1: Preparare una sospensione densa di microrganismi nella cryovial di 2: Tappare e agitare, capovolgendo la cryovial per 6 volte 3: Aspirare più liquido possibile ed eliminarlo 4: Congelare In quattro semplici fasi, è possibile costituire una ceppoteca ben identificabile attraverso i colori delle cryovials e delle perline. Quando necessario, è sufficiente scegliere in freezer la cryovial con il ceppo da utilizzare ed estrarre una sola perlina. KAIROSafe review n. 8, settembre /8

5 4.2 Recupero dei microrganismi con il Sistema 1: Togliere la cryovial dal congelatore e porla in cryoblock per mantenere la bassa temperatura. Rimuovere la perlina necessaria utilizzando un ago sterile 2: Strisciare la perlina su agar o metterla direttamente in brodo; incubare secondo necessità 5. SISTEMA PROTECT SELECT L ultima novità in casa TSC consiste nello sviluppo di differenti tipi di soluzioni nutrienti per conservare in modo mirato e selettivo categorie diverse di microrganismi. (Figura 2): Figura 2: Nuovo Select La gamma TM è quindi arricchita da 4 nuovi prodotti: - Select per Prodotti Caseari Il terreno nutriente criopreservante è formulato per mantenere i microrganismi isolati da latte e prodotti caseari e risponde alle indicazioni ISO. Il sistema può essere anche utilizzato per i microrganismi isolati da acque di risciacquo e ambiente. Le perline hanno colore viola. KAIROSafe review n. 8, settembre /8

6 - Select per Anaerobi Il terreno nutriente criopreservante è formulato per mantenere i microrganismi anaerobi ed esigenti inclusi Clostridium, Bacteroides, Propionebacterium, Prevotella e Fusobacterium. Le performance del terreno sono state ottimizzate incrementando la viscosità e la rimozione dell ossigeno. Le perline hanno colore arancione. - Select per Funghi e Lieviti: La formulazione del terreno rende più semplice la sospensione delle spore fungine. Vitalità e stabilità risultano incrementate. La vitalità di Saccharomyces, Candida, Aspergillus e Penicillum risulta elevata anche dopo 12 mesi. Le perline hanno colore grigio. - Select Meat free : I componenti del terreno di origine animale sono sostituiti da materiali equivalenti in termini di performance e qualità, ma di origine vegetale, eliminando così qualsiasi possibile rischio relativo all encefalopatia spongiforme TSE. In questo modo, si risponde alle esigenze del settore farmaceutico e biotech. Le perline hanno colore Nero. 6. VANTAGGI DEL SISTEMA PROTECT Il sistema di criopreservazione e mantenimento presenta innumerevoli vantaggi rispetto ai metodi classici, consentendo di allestire ed utilizzare le ceppoteche in modo molto semplice ed efficace: - diminuiscono i rischi di contaminazione e modifica dei ceppi - diminuiscono i costi dei test - aumenta il recupero dei microrganismi dopo lo scongelamento - migliora l identificazione dei ceppi grazie ai diversi colori ed alla completa scrivibilità delle cryovial - aumentano la praticità e la maneggevolezza grazie al design della cryovial e delle scatole - versatilità nei confezionamenti (riassunti nella tabella 1) KAIROSafe review n. 8, settembre /8

7 Prodotto Colore Confezionamento Refill Confezionamento con Bulk Starter (100 pz) Anse ed aghi inclusi* (1000 pz) (10 pz) Scatola Scatola in Scatola Scatola in cartonata polipropilene cartonata polipropilene Classico Misti TS70-MX TS71-MX TS70-MX Plus TS71-MX Plus TS72-MX TS69-MX Blu TS70-BL TS71-BL TS70-BL Plus TS71-BL Plus TS72-BL TS69-BL Verdi TS70-GN TS71-GN TS70-GN Plus TS71-GN Plus TS72-GN TS69-GN Rossi TS70-RD TS71-RD TS70-RD Plus TS71-RD Plus TS72-RD TS69-RD Bianchi TS70-WH TS71-WH TS70-WH Plus TS71-WH Plus TS72-WH TS69-WH Gialli TS70-YE TS71-YE TS70-YE Plus TS71-YE Plus TS72-YE TS69-YE Arancioni TS73-AN25 TS69-AM Anaerobi TS73-AN100 Viola TS73-DY25 TS69-DY Latte TS73-DY100 Nero TS73-MF25 TS69-MF Meat Free TS73-MF100 Grigio TS73-YM25 TS73-YM Muffe/lieviti TS73-YM100 * 50 anse e 50 aghi in polistirolo sterili, fornite solo con i confezionamenti da 100 Tabella 1: Confezionamenti e formati del sistema IL SISTEMA PROTECT E DISTRIBUITO IN ITALIA IN ESCLUSIVA DA KAIROSAFE KAIROSafe review n. 8, settembre /8

8 Per informazioni e richieste: KAIROSafe S.r.l. Sistiana, 41/D Duino Aurisina (TS) Tel/fax: info@kairosafe.it web: Ceppi microbici liofilizzati Terreni di coltura disidratati Terreni di coltura pronti all uso Sistema per conservazione di microrganismi Tamponi Spugnette Piastre da contatto per il monitoraggio microbiologico delle superfici Indicatori biologici per sterilizzazione Reagenti e Consumabili per LAL test Accessori per microbiologia Sistemi per microfiltrazione KAIROSafe review n. 8, settembre /8