Oggi. Nuovi strumenti per una migliore diagnosi dell infezione tubercolare latente
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1 Oggi Vol. 97, N. 3, Marzo 2006 Pagg Nuovi strumenti per una migliore diagnosi dell infezione tubercolare latente Giovanni Ferrara, Monica Losi, Pietro Roversi, Leonardo M. Fabbri, Luca Richeldi Riassunto. La diagnosi di infezione tubercolare latente si può avvalere oggi di due nuovi test immunologici su sangue, basati sul rilevamento della produzione in vitro di interferone-gamma da parte dei linfociti T specifici per il M. tuberculosis. Questi test, QuantiFERON-TB Gold ed T-SPOT.TB, essendo certamente più specifici del test cutaneo tubercolinico e probabilmente più sensibili in alcuni sottogruppi di pazienti, potrebbero rappresentare uno strumento di cruciale importanza per le strategie di controllo ed eliminazione della tubercolosi. Parole chiave. ELISPOT, infezione tubercolare latente, interferone-gamma, linfociti T, QuantiFERON-TB Gold, test cutaneo tubercolinico, T-SPOT.TB. Summary. New tools for a better diagnosis of latent tuberculosis infection. Two new blood tests are today available for diagnosing latent tuberculosis infection. Both tests are based on the release of interferon-gamma from M. tuberculosis-specific T cells. These tests, QuantiFERON-TB Gold and T-SPOT.TB, are certainly more specific compared to the tuberculin skin test, and possibly more sensitive in some subgroups of patients; they might represent a crucial tool for tuberculosis control and elimination. Key words. ELISPOT, interferon-gamma, latent tuberculosis infection, QuantiFERON- TB Gold, tuberculin skin test, T cell, T-SPOT.TB. La tubercolosi in Italia e nel mondo L Italia è stata, tra le nazioni europee, una delle più colpite nel passato dalla tubercolosi (TB); il boom economico negli anni 60, l efficace azione del sistema sanatoriale italiano e la disponibilità, per la prima volta nella storia dell umanità, di un trattamento farmacologico efficace, hanno in seguito I limiti della diagnostica classica per la malattia attiva stanno diventando sempre più evidenti anche nei paesi ad alta incidenza di tubercolosi, in particolare nell Africa Sub-Sahariana, dove la mortale alleanza tra TB, HIV e povertà estrema, limita in maniera drammatica l efficienza dei programmi di controllo 7, sottolineando il crescente bisogno di nuovi approcci per la prevenzione della progressione da infezione latente a malattia attiva, in particolare nei bambini al di sotto dei 5 anni di età e nei soggetti infettati dall HIV 8. consentito di ridurre drasticamente l incidenza della TB nella popolazione generale, tanto che essa è stata confinata ad alcuni gruppi a maggior rischio, in particolare anziani (esposti al bacillo in un lontano passato), immunodepressi (in particolare pazienti con infezione da HIV) ed immigrati da aree ad alta endemia (dove oggi la situazione epidemiologica è simile o peggiore rispetto a quella italiana dell immediato secondo dopoguerra). Il numero crescente di individui che necessitano di trattamenti immunosoppressivi per patologie neoplastiche od auto-immuni, associato all aumento dell età media della popolazione residente ed alla crescente percentuale di persone non nate nel nostro paese, rendono indispensabili oggi, in Italia come nel resto del mondo occidentale, strategie mirate di prevenzione della malattia 1-4. In particolare, l attuale quadro epidemiologico, peraltro molto simile a quello di altri Paesi occidentali, quali gli Stati Uniti ed il Regno Unito, ha reso cruciali per il controllo della malattia la diagnosi ed il trattamento dello stato di infezione tubercolare latente (ITBL). Clinica di Malattie dell Apparato Respiratorio, Università di Modena e Reggio Emilia. Pervenuto il 16 gennaio 2006.
2 124 Recenti Progressi in Medicina, 97, 3, 2006 Questa condizione è classicamente definita dalla positività del test cutaneo tubercolinico (noto anche come intradermoreazione di Mantoux), dall assenza di sintomi e dalla normalità della radiografia del torace. La progressiva riduzione dell incidenza della malattia attiva ha fatto sì che la diagnostica classica sia per la TB attiva che per l ITBL 5, introdotta nella pratica clinica dallo stesso scopritore del M. tuberculosis, Robert Koch, oltre 100 anni fa 6, sia divenuta sostanzialmente inadeguata, a causa soprattutto di una bassa sensibilità per le forme di TB attiva più subdole (che sono sempre più diffuse, in particolare tra gli anziani) e di una bassa specificità per la diagnosi di ITBL nei soggetti vaccinati per la TB. Due nuovi test per la diagnosi di infezione tubercolare latente: il QuantiFERON-TB Gold ed il T-SPOT.TB Due nuovi test diagnostici per l ITBL sono divenuti recentemente disponibili: entrambi si basano sul rilevamento di una risposta linfocitaria T verso due antigeni specifici del M. tuberculosis, l Early Secretory Antigen Target 6 (ESAT-6) ed il Culture Protein Filtrate 10 (CFP10). I linfociti del sangue periferico che hanno precedentemente incontrato il micobatterio tubercolare, sono in grado di produrre la citochina interferone-gamma (IFN-γ) se messi a contato con proteine del M. tuberculosis 9. Questi nuovi test hanno comunque anche peculiarità specifiche che li differenziano: il QuantiFERON-TB Gold (QFT-TB) (Cellestis Ltd, Carnegie, Victoria, Australia) viene eseguito direttamente su sangue venoso intero eparinato, stimolato con gli antigeni specifici per ore. L IFN-γ prodotto dai linfociti durante la stimolazione viene misurato direttamente sul plasma raccolto dai campioni, tramite un lettore ELISA. Il risultato finale viene ottenuto grazie ad un algoritmo che tiene conto della produzione basale di IFN-γ da parte delle cellule ematiche nel controllo negativo, e viene ritenuto positivo solo se la produzione specifica di IFN-γ supera un cut-off predefinito (tabella 1). Il test T-SPOT.TB (TS.TB) (Oxford Immunotec, Oxford, Gran Bretagna) viene eseguito purificando e contando le cellule mononucleate del sangue periferico e stimolandole con le proteine specifiche: la produzione di IFN-γ viene quindi rilevata attraverso la tecnologia ELISPOT (Enzyme-Linked Immuno-SPOT), che permette di rilevare la presenza delle singole cellule che producono la citochina, sotto forma di spot (una vera e propria impronta lasciata dalla cellula T). Gli spot vengono contati con un apposito lettore ed il risultato finale interpretato alla luce degli spot presenti nei campioni stimolati e nei controlli negativo e positivo, secondo cut-off predefiniti (tabella 1). A differenza del test cutaneo tubercolinico, entrambi i nuovi test immunologici sono provvisti di un controllo negativo (necessario per rilevare esagerate risposte basali aspecifiche non legate alla stimolazione antigenica e, quindi, possibili errori tecnici) e di un controllo positivo (in entrambi i test basato sulla produzione di IFN-γ indotta dal mitogeno aspecifico fitoemoagglutinina). Il controllo positivo è particolarmente importante per valutare il funzionamento generale del test: è evidente che se le cellule del paziente non sono in grado di produrre una qualsiasi risposta immune nel controllo positivo, non è possibile escludere che una mancata risposta alla stimolazione specifica sia dovuta a problemi tecnici (inadeguata processazione dei campioni) o a fattori limitanti intrinseci del paziente (immunosoppressione fisiologica o patologica). Un test che non presenti una produzione di IFN-γ nel controllo positivo e nei campioni stimolati viene definito, per entrambe le metodiche, indeterminato, proprio perché non è possibile escludere che esso non abbia funzionato a causa dei fattori sopra menzionati. Tabella 1. - Interpretazione dei nuovi test immunologici per la diagnosi di infezione tubercolare. Controllo negativo* ESAT-6 e/o CFP10 (valori campioni con antigeni meno valori del controllo negativo) QuantiFERON-TB Gold (read out: IFN-γ IU/mL) Controllo positivo (PHA) Positivo <0.7 IU/mL 0.35 IU/mL Non rilevante Negativo <0.7 IU/mL <0.35 IU/mL 0.50 IU/mL Indeterminato <0.7 IU/mL <0.35 IU/mL <0.50 IU/mL Possibile errore tecnico 0.7 IU/mL Non rilevante Non rilevante T-SPOT.TB (read out: SFUS/ PBMCs) Positivo <6 SFUs 6 SFUs Non rilevante Negativo <6 SFUs <6 SFUs 20 SFUs Indeterminato <6 SFUs <6 SFUs <20 SFUs Possibile errore tecnico 10 SFUs Non rilevante Non rilevante ESAT6: Early Secretory Antigen Target 6; CFP10: Culture Protein Filtrate 10; PHA: fitoemoagglutinina; IFN-γ: interferone-γ; SFU: Spot Forming Unit; PBMCs: cellule mononucleate del sangue periferico (Peripheral Blood Mononuclear Cells). *La versione delle istruzioni approvate per il QuantiFERON-TB Gold dall Unione Europea prevede un limite superiore del controllo negativo di 2 IU/mL. Se il numero di spot nel controllo negativo del T-SPOT. TB è 6 SFU, il numero degli spot nel campioni stimolati con antigeni deve essere superiore di due volte al valore del controllo negative per avere un risultato positivo.
3 G. Ferrara et al.: Nuovi strumenti per una migliore diagnosi dell infezione tubercolare latente 125 Benché basati sul medesimo principio immunologico, il QFT-TB ed il TS.TB presentano anche differenze sostanziali: il QFT-TB è tecnicamente più semplice e viene eseguito con metodiche (ELI- SA) generalmente già in uso in laboratori di microbiologia di medio livello. Il TS.TB prevede un passaggio tecnico in più rispetto al QFT-TB (cioè l isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico), è tecnicamente più complesso e la lettura viene eseguita con una metodica che si sta diffondendo nei laboratori specialistici, ma che ancora non è largamente disponibile; il prezzo per queste maggiori difficoltà tecniche è peraltro rappresentato da un migliore controllo della performance del test e, verosimilmente, una maggiore sensibilità. Rispetto al test cutaneo tubercolinico, che ad oggi rimane il cardine della diagnosi di ITBL, i due test hanno numerosi potenziali vantaggi: sono eseguiti ex vivo, in condizioni controllate (controlli negativi e positivi) e richiedono una sola visita per il prelievo senza la necessità di una visita di ritorno per la lettura del test; inoltre, danno possibilità di ripetere liberamente i test senza pericolo di essere influenzati dall effetto boosting. La tabella 2 riassume le caratteristiche dei nuovi test immunologici, a confronto con il vecchio test di Mantoux. Valutazione iniziale dei test QuantiFERON-TB Gold e T-SPOT.TB in casistiche selezionate: approssimando il gold standard diagnostico Non esistendo un gold standard per la diagnosi di ITBL, la sensibilità approssimata di tali test è stata valutata in confronto diretto col test cutaneo, sulla base di una serie di surrogati di probabilità di infezione tubercolare, quali la durata e l intensità dell esposizione a casi di TB polmonare bacillifera ed i risultati ottenuti testando pazienti con TB attiva con conferma microbiologica. La specificità è stata invece misurata testando soggetti a basso rischio di infezione tubercolare e vaccinati col vaccino BCG, noto fattore confondente del test cutaneo. Gli studi più informativi sono stati eseguiti confrontando il risultato dei test su sangue con quello del test cutaneo in soggetti recentemente esposti a casi di TB bacillifera. Assumendo che l emissione di bacilli dal caso indice sia costante nel tempo, la probabilità di nuova infezione sarà maggiore quanto maggiore sarà stata la durata dell esposizione. Diversi studi hanno dimostrato sia per il QFT-TB 10 che per il TS.TB che i test su sangue correlano meglio del test cutaneo con l esposizione, suggerendo una maggiore sensibilità dei test ex vivo per la diagnosi di ITBL. Tabella 2. - Caratteristiche dei nuovi test per la diagnosi di ITBL, a confronto con il test di Mantoux. QuantiFERON-TB Gold T-SPOT.TB Test cutaneo tubercolinico Tipo di test In vitro In vitro In vivo Antigeni ESAT-6 e CFP10 ESAT-6 e CFP10 PPD Principio sul quale il test si basa Immunità cellulo-mediata, produzione di IFN-γ da parte dei linfociti T Immunità cellulo-mediata, produzione di IFN-γ da parte dei linfociti T Ipersensibilità ritardata Tempo di stimolazione ore ore ore Read out Livelli plasmatici di IFN-γ IFN-γ Spot Forming Units Infiltrato cutaneo (mm) Strumenti di laboratorio necessari Incubatore, lettore ELISA Centrifuga per la separazione dei PBMCs, incubatore, lettore ELISPOT Nessuno Controllo positive interno Sì (PHA) Sì (PHA) No Necessaria la separazione dei PBMCs Numero di PBMCs controllato Possibilità di ripetere la lettura su campioni stimolati conservati Reazioni crociate con BCG e micobatteri non TB Effetto boosting da test ripetuti No Sì NA No Sì NA Sì No No No No Sì No No Sì ESAT-6: Early Secretory Antigen Target 6; CFP10: Culture Protein Filtrate 10; PPD: Purified Protein Derivative; PHA: fitoemoagglutinina; PBMCs: cellule mononucleate del sangue venoso periferico (Peripheral Blood Mononuclear Cells); IFN-γ: interferone-γ; SFU: Spot Forming Unit; BCG: Bacillo di Calmette e Guèrin.
4 126 Recenti Progressi in Medicina, 97, 3, 2006 Da notare però che in tutti gli studi pubblicati il test tubercolinico ha sempre fornito più risultati positivi, anche in assenza di fattori confondenti quali la vaccinazione con BCG oppure infezioni da micobatteri non tubercolari, tanto che le recenti linee guida dei Centers for Disease Control and Prevention americani 14 (le uniche dedicate ad uno dei due test, il QFT-TB), mettono in guardia circa la possibilità di un buco di sensibilità del test; analogamente, la versione preliminare delle linee guida del National Institute for Clinical Excellence inglese (NICE) 1 consiglia di eseguire i nuovi test su sangue sempre in associazione al test cutaneo tubercolinico. Tuttavia, in assenza di un certo riferimento diagnostico per l ITBL ed in assenza di studi longitudinali sul valore predittivo dei nuovi test, risulta al momento impossibile una conclusione certa circa il significato clinico di queste osservazioni. Una seconda misura surrogata di sensibilità è stata ottenuta testando soggetti affetti da TB attiva con conferma microbiologica: per entrambi i test, la sensibilità è risultata più elevata rispetto al test cutaneo, ed in particolare è stata molto elevata per il TS.TB (92-97% 15, 16 ) (81-89% per il QFT-TB ). Questi risultati confermano ulteriormente la maggiore sensibilità diagnostica per l infezione tubercolare dei test su sangue, rispetto al test cutaneo, in particolare del TS.TB. Gli studi che hanno cercato di valutare la specificità dei nuovi test, invece, hanno incluso soprattutto soggetti a basso rischio di infezione tubercolare e con fattori confondenti quali la vaccinazione con BCG. Dai risultati di tali studi si può oggi concludere che la specificità dei test su sangue è certamente superiore a quella del test di Mantoux, in particolare non essendo i nuovi test influenzati dallo stato vaccinale 10, 11, 16, 18, principale causa di risultati falsamente positivi del test cutaneo 5. L utilizzo dei nuovi test su sangue nella pratica clinica quotidiana Uno dei potenziali ostacoli all utilizzo su larga scale dei test su sangue è che essi necessitano di un laboratorio per essere eseguiti, con tutto ciò che questo comporta, dall esecuzione dei prelievi, ai tempi di accettazione ed esecuzione, fino alla refertazione ed all interpretazione dei risultati. Bisogna inoltre considerare che non sono ancora chiari i limiti e le indicazioni più appropriate per questi test, considerando che essi dovrebbero superare i limiti di un test come il test di Mantoux, il quale ha alle spalle oltre 100 anni di dati sull uso clinico e che idealmente necessita di una sola persona per la sua esecuzione e lettura. Uno studio recentemente portato a termine presso il Policlinico di Modena 20 ha recentemente mostrato come uno di tali test, il QFT-TB, possa essere eseguito di routine in un laboratorio di microbiologia, non diversamente da tutti gli altri test diagnostici già entrati nella pratica clinica quotidiana. Il test poteva essere richiesto da tutti i reparti dell ospedale e, di fatto, i pazienti testati hanno presentato le caratteristiche più varie, con una buona percentuale rappresentata da soggetti con diversi gradi di immunosoppressione e sintomi suggestivi di TB attiva. Il test QFT-TB è entrato nella routine diagnostica del Policlinico di Modena da oltre 1 anno ed i risultati dei primi otto mesi del suo utilizzo hanno fornito importanti indicazioni sull utilità e sui potenziali limiti di impiego di questa nuova metodica. Il test è risultato particolarmente utile nelle procedure di screening per contatti di casi di TB attiva e per i soggetti immigrati da aree ad elevata prevalenza di TB: di fatto, i risultati ottenuti sul campo sono stati simili a quelli ottenuti in studi su popolazioni selezionate, confermando la maggiore specificità dei test su sangue nei soggetti vaccinati: ciò ha consentito di evitare con sufficiente confidenza un significativo numero di trattamenti dell ITBL. Il test QFT-TB ha inoltre fornito un risultato indeterminato (assenza di una risposta sia agli antigeni che al controllo positivo) quasi esclusivamente in pazienti trattati con terapie immunosoppressive (chemioterapia, steroidi cronici e nuovi farmaci biologici), in cui il risultato del test cutaneo era invariabilmente (falsamente) negativo. L associazione tra stati di immunosoppressione, test su sangue indeterminato e test cutaneo negativo sottolinea ancora una volta l inadeguatezza del test di Mantoux per lo screening dell ITBL in questi pazienti, ma non risolve completamente il problema clinico, in quanto almeno il QFT-TB non sembra essere dotato della sensibilità necessaria ad escludere con assoluta certezza un infezione tubercolare nei pazienti a maggior rischio di progressione in forme gravi di malattia attiva. Resta dunque ancora da accertare quanto questi nuovi test saranno in grado di migliorare la diagnostica dell infezione tubercolare, in particolare nei gruppi a maggior rischio di progressione e nei quali la diagnostica tradizionale presenta evidenti limiti, in particolare nei contatti nelle fasce estreme d età ed in pazienti portatori di stati di grave immunosoppressione. Quale il ruolo dei nuovi test nelle strategie di controllo della tubercolosi? Argomento di grande discussione oggi è rappresentato dal ruolo del trattamento dell ITBL anche nei paesi ad alta prevalenza di TB. La grande diffusione dell infezione da HIV, infatti, ha portato ad un esponenziale crescita delle nuove infezioni e dei nuovi casi e decessi da TB, soprattutto nell Africa sub-sahariana, dove anche l implementazione delle attuali strategie di controllo non sembra offrire risposte adeguate a questa epidemia.
5 G. Ferrara et al.: Nuovi strumenti per una migliore diagnosi dell infezione tubercolare latente 127 La sindrome da immunodeficienza acquisita, inoltre, ha modificato la presentazione clinica e complicato il trattamento delle forme specifiche, tanto da fare ipotizzare anche in questi setting un potenziale ruolo del trattamento con isoniazide. Oggi sono in corso importanti trial 8 disegnati per provare l utilità del trattamento dell ITBL anche nei paesi in via di sviluppo. Un fattore limitante tale approccio è sicuramente rappresentato dalla bassa sensibilità e bassa specificità del test cutaneo tubercolinico in queste popolazioni, ad alta prevalenza di anergia cutanea e dove la vaccinazione con BCG è universalmente praticata alla nascita. In questo contesto, i nuovi test potrebbero permettere di migliorare la diagnosi dell ITBL e di indirizzare in maniera appropriata il trattamento dei soggetti infetti, qualora fosse dimostrata una loro maggiore sensibilità rispetto al test cutaneo. Al momento sono disponibili pochi dati, anche se confortanti, sulla performance dei nuovi test in queste condizioni. In particolare l ELI- SPOT-RD1 (la versione sperimentale del TS.TB) ha mostrato di non essere influenzato dalla conta dei linfociti CD4 nei pazienti HIV positivi 21 e di essere in grado di supportare meglio del test cutaneo la diagnosi di TB attiva in bambini sotto i 5 anni affetti da sindrome da immunodeficienza acquisita e malnutrizione 22. Un notevole limite all uso di questi test nei paesi in via di sviluppo è rappresentato certamente dai costi elevati, rispetto al test cutaneo: le spese per l esecuzione del singolo test e per la manutenzione dei laboratori non giustificano, al momento, questo approccio nei setting con limitate risorse economiche: peraltro, se l aumento di spesa fosse mirato a particolari gruppi di pazienti, come i bambini, nei quali la TB è spesso mortale o capace di provocare gravi invalidità permanenti 23, potrebbe rappresentare un investimento efficace per i sistemi sanitari dei paesi emergenti, permettendo di migliorare la salute ed alleviare i bisogni futuri di persone con un aspettativa di vita che, si spera, si avvicini nel prossimo decennio agli standard occidentali 24. Bibliografia 1. National Institute for Clinical Excellence. Tuberculosis: Clinical diagnosis and management of tuberculosis, and measures for its prevention and control. 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