RIASSUNTO. rimozione del gruppo fosfato dai nucleotidi pirimidinici 5 -monofosfato.

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1 RIASSUNTO La pirimidina 5 -nucleotidasi (PN1) è un enzima che catalizza la rimozione del gruppo fosfato dai nucleotidi pirimidinici 5 -monofosfato. Questa proteina svolge un ruolo molto importante nella via di recupero dei nucleotidi. La sua competenza fisiologica è probabilmente quella di regolare la concentrazione intracellulare dei nucleotidi. La deficienza di questo enzima è associata ad un anemia emolitica non sferocitica, di tipo ereditario autosomico recessivo, e caratterizzata da anisocitosi, reticulocitosi, punteggiatura basofila degli eritrociti, aumento del livello di bilirubina, perdita di ferro nelle urine e un accumulo di nucleotidi pirimidinici all interno del globulo rosso. Scopo della presente tesi è il clonaggio del gene della PN1 a partire dalla conoscenza di parziali sequenze aminoacidiche della proteina. Ci siamo avvalsi dell importante contributo del Progetto Genoma Umano che, fra l altro, ha prodotto un catalogo di centinaia di migliaia di sequenze, le cosidette EST (Exspressed sequence tags), che corrispondono a porzioni di cdna isolate a caso. In questa banca dati abbiamo ritrovato una sequenza nucleotidica che poteva corrispondere al cdna della nostra proteina e quindi abbiamo utilizzato le classiche tecniche di biologia molecolare per clonarlo. Abbiamo espresso l ipotetica proteina 5

2 ricombinante e abbiamo controllato se poteva essere quella di nostro interesse. I risultati sono stati conformi all attesa: infatti abbiamo clonato ed espresso il gene della PN1. Riteniamo che questi risultati possano essere di notevole interesse sia per una conoscenza più approfondita della proteina, ma anche, dal momento che la sua carenza determina una patologia genetica, per l individuazione di mutazioni del gene che possono essere responsabili del fenotipo patologico. 6

3 INTRODUZIONE Gli studi sulle nucleotidasi pirimidiniche sono iniziate nei primi anni 70. Dapprima si pensava che esistesse un unica PN che è stata isolata e parzialmente purificata da Torrance e altri nel La deficienza di questo enzima, chiamato fino ad allora pirimidina 5 -nucleotidasi (PN), è associata ad un anemia emolitica non sferocitica ereditaria con modalità di trasmissione di tipo autosomico recessivo. La patologia è caratterizzata da anisocitosi, reticulocitosi, punteggiatura basofila degli eritrociti, aumento del livello di bilirubina, perdita di ferro nelle urine e un accumulo di nucleotidi pirimidinici all interno del globulo rosso. (Torrance et al., 1977a, 1977b, 1977c). Successivamente è stato dimostrato (Swallow et al., 1983; Paglia et al., 1983,1984) che i pazienti affetti, nonostante fossero difettivi negli eritrociti per l attività PN verso UMP, CMP e dcmp, conservavano una normale attività verso dump e dtmp. Ciò portò alla scoperta di due distinte attività pirimidino nucleotidasiche che furono parzialmente separate da Hirono e altri (1985, 1987) e indicate come PN di tipo 1 e PN di tipo 2. Le attività delle due PN mostrano una differente termostabilità e diverse proprietà enzimatiche e molecolari. I due enzimi vengono codificati 7

4 da due geni distinti (Hirono et al., 1985) che mappano su due cromosomi diversi, ancora sconosciuti. La pirimidina 5 -nucleotidasi (PN1), che viene presa in esame in questa tesi, è un enzima che catalizza la rimozione del gruppo fosfato dai mononucleotidi pirimidinici. Questa proteina svolge un ruolo molto importante nella via di recupero dei nucleotidi. Il suo ruolo fisiologico è probabilmente quello di regolare la concentrazione intracellulare dei nucleotidi pirimidinici e di permettere quindi il trasporto dei nucleotidi, che si sono formati a seguito della reazione di defosforilazione, attraverso la membrana dell eritrocita. I nucleosidi rilasciati servirebbero per la proliferazione delle cellule eritroidi durante i primi stadi del loro differenziamento. Presso il laboratorio del professore Magni la proteina è stata purificata fino ad omogeneità e, più recentemente, è stata determinata la sequenza aminoacidica della maggior parte di essa. Da tali informazioni prende avvio il lavoro che è alla base di questa tesi e cioè il clonaggio e quindi l espressione del gene della PN1. Abbiamo ritenuto che questo potesse essere di strumentale importanza ad una conoscenza più approfondita della proteina, ma anche, dal momento che la sua carenza determina una patologia genetica, alll individuazione di mutazioni del gene che possono essere responsabili del fenotipo patologico. 8

5 1.1 Pirimidine nucleotidasi Le nucleotidasi Gli enzimi che catalizzano l idrolisi dei nucleotidi monofosfato sono largamente distribuiti in tutti gli organismi. La competenza fisiologica delle nucleotidasi è presumibilmente quella di regolare la concentrazione di nucleotidi intracellulari o il trasporto di membrana dei nucleotidi in collaborazione con una nucleoside chinasi (Pesi et al., 1994). Nelle cellule di mammifero sono stati trovati diversi generi di nucleotidasi solubili che sono state classificate in quattro gruppi; nucleotidasi con elevata Km (Spychala et al., 1988) che catalizzano in maniera preferenziale i nucleotidi purinici; nucleotidasi con bassa Km (Madrid-Marina e Fox, 1988); 5 (3 )- nucleotidasi (Fritzon e Smith, 1971) che idrolizzano i nucleotidi pirimidinici e in ultimo le pirimidine 5 - nucleotidasi (PN). Le PN si trovano negli eritrociti ed includono due sottoclassi: PN1 e PN2 (Hirono et al., 1985). 9

6 1.1.2 Caratteristiche enzimatiche e molecolari delle PN Due nucleotidasi pirimidino specifiche (PN1; PN2) sono state isolate nella frazione solubile degli eritrociti umani. Gli studi sulla specificità del substrato, indicano che la PN1 è maggiormente coinvolta nella degradazione ed eliminazione delle pirimidine 5 -monofosfato negli eritrociti, mentre la PN2 idrolizza preferenzialmente le pirimidine 3 - monofosfato, con l esclusione dei monofosfati delle citidine e delle adenosine (Amici et al., 1991, 1994) (Vedi tabella 1.1). Tabella 1.1 Specificità della PN1 e della PN2 Substrat o (1mM) PN 1 Attività % PN 2 Attività % Substrat o (1mM) PN 1 Attività % PN 2 Attività % UMP U3 MP 2 64 CMP 95 0 C3 MP 0 0 GMP 0 0 G3 MP 0 30 AMP 0 0 A3 MP 0 0 IMP 4 2 dump du3 MP 3 72 dcmp 52 0 dc3 MP 0 0 dtmp 43 7 dt3 MP dgmp 0 0 dg3 MP 0 4 damp 0 0 da3 MP 0 0 dimp 0 20 cu2 3 MP 0 0 cu3 5 MP 0 0 cc2 3 MP 0 0 cc3 5 MP 0 0 cg2 3 MP 0 0 cg3 5 MP 0 0 ca2 3 MP 0 0 ca3 5 MP 0 0 ct3 5 MP 0 0 U2 MP 4 36 G2 MP 0 1 C2 MP 3 0 A2 MP

7 Il peso molecolare della PN1 è di daltons, sia in SDS-PAGE che in gel filtrazione, mentre la PN2 ha un peso molecolare di daltons se analizzato in SDS-PAGE e di daltons se si analizza lo stesso campione attraverso una gel filtrazione, suggerendoci quindi una struttura dimerica per la PN2. Questi enzimi richiedono Mg 2+ per la loro attività, mentre i cationi dei metalli pesanti sono inibitori molto forti. L attività degli enzimi è inibita da agenti che chelano i metalli ed è sensibile ai reagenti tioreattivi. Il punto isoelettrico è di 5.4 e l attività ottimale si ha ad un ph di 7.5 per la PN1 e di 6.5 per la PN2 (Amici et al., 1991, 1994) Dove vengono espresse Le 5 -Nucleotidasi sono largamente diffuse in natura ed esiste un esauriente letteratura sull enzima dai tessuti dei vertebrati, dal veleno dei serpenti, dal lievito e dai batteri. Sono state identificate tre 5 - Nucleotidasi nel fegato dei mammiferi: una lisosomiale, una citoplasmatica e una legata alla membrana (Arsenis e Touster, 1968). Unico è l enzima lisosomiale per il fatto che idrolizza ugualmente bene i mononucleotidi 2 -,3 - e 5 -. Le 5 -nucleotidasi sono state trovate anche nella mucosa intestinale, nella ghiandola pituitaria, nel cervello, nel tessuto cardiaco e nel muscolo scheletrico (Drummonds e Yamamoto, 1971). 11

8 1.2 Patologia associata alla mancanza di PN1 I globuli rossi sopravvivono in circolo per un periodo compreso fra 90 e 120 giorni. La durata di vita dei globuli rossi può accorciarsi in un notevole numero di disordini; qualora il midollo osseo non sia in grado di rimpiazzare adeguatamente gli eritrociti prematuramente distrutti, si sviluppa un anemia. Le anemie emolitiche vengono generalmente distinte in base alla anomalia che causa la prematura distruzione dei globuli rossi. Dal punto di vista eziologico la distruzione dei globuli rossi può essere legata a: a) Un difetto molecolare (emoglobinopatia o enzimopatia). b) Un anomalia nella struttura e nella funzione della membrana. c) Un fattore ambientale come un trauma meccanico o la presenza di autoanticorpi (Wendel Ross, H. Franklin Bunn). Un particolare tipo di enzimopatia che prendiamo in esame e quella dovuta ad un anomalia di uno degli enzimi del metabolismo nucleotidico. Questo enzima, chiamato pirimidina nucleotidasi (PN), interviene nel catabolismo degli acidi nucleici. 12

9 1.2.1 Fenotipo dei pazienti con mancanza della P5N di tipo I (PN1) In pazienti affetti da anemia emolitica non sferocitica si è potuto documentare sia un aumento del livello di nucleotidi pirimidinici all interno degli eritrociti, riscontrabile in campioni deproteinizzati con la spettrofotometria (Valentine et al., 1974), e con l analisi in h.p.l.c. (Simmonds et al., 1988), sia un decremento dell attività della PN1. Sembra quindi appropriata come diagnosi la mancanza dell attività della PN1. Le emazie di tali soggetti sono riconoscibili per la presenza di una punteggiatura basofila dovuta ad un accumulo di nucleotidi pirimidinici e materiale ribonucleico, riscontrabile con la colorazione delle strisciate di sangue attraverso la tecnica di Wright. Attraverso i casi pubblicati, sono mostrate le caratteristiche di questa condizione patologica: moderata anemia ( g/l), anisocitosi, reticulocitosi, punteggiatura basofila degli eritrociti, aumento del livello di bilirubina, uno spostamento del massimo di assorbimento dell UV di campioni deproteinizzati di eritrociti da 260 mm a mm. Sempre negli eritrociti abbiamo: un aumento del livello di glutatione ridotto (GSH), una riduzione dell attività del ribosio fosfato pirofosfochinasi (RPK), un aumento del livello di nucleotidi pirimidinici e una riduzione dell attività della PN1. Il fatto che molti altri stessi casi siano stati trovati dal 1974 in poi, vorrebbe dimostrare che la mancanza della PN1 non è una malattia 13

10 estremamente rara. Infatti, Beutler stabilì che la deficienza di PN1 è la quarta anemia emolitica più comune causata dalla mancanza di un enzima specifico, dopo altre patologie enzimatiche quali la mancanza del G-6-PD, del piruvato chinasi e del glucosio fosfato isomerasi (Beutler et al., 1980). Studiando geneticamente alcune famiglie di pazienti con la deficienza della PN1 sembra emergere che ci sia un eredità autosomica recessiva per ciò che riguarda la trasmissione degli alleli coinvolti. Inoltre, in circa metà dei casi pubblicati, ci sono elementi di consanguineità. Sembra probabile l esistenza di un polimorfismo genetico, considerando la distribuzione dell attività dell enzima tra omozigoti ed eterozigoti obbligati (Beutler et al., 1980). In un eritrocita normale i nucleotidi adeninici, costituiscono la più importante riserva energetica (circa il 97% dei nucleotidi totali) (Valentine et al., 1974), mentre i nucleotidi pirimidinici rappresentano una piccola frazione del totale. I nucleotidi pirimidinici derivano dal catabolismo degli RNA ribosomiali. Essi vengono defosforilati dalla PN1 e presumibilmente diffondono fuori dalla cellula una volta rilasciati i loro gruppi fosfato. Normalmente, la concentrazione dei nucleotidi pirimidinici all interno degli eritrociti è molto bassa. Al contrario, negli eritrociti con la deficienza di PN1, presentano solo un 32% di nucleotidi adeninici, mentre le citidine e uridine costituiscono rispettivamente il 50% e 16% del pool nucleotidico. 14

11 La non funzionalità della PN1, che è un enzima citosolico, determina presumibilmente un accumulo di prodotti di degradazione ribosomale all interno dell eritrocita. 1.3 Studi recenti sulla PN1 Gli eritrociti durante la differenziazione terminale presentano un elevata degradazione del loro RNA con il conseguente rilascio dei mononucleotidi (Rapoport, 1986). I mononucleotidi pirimidinici vengono degradati in maniera preferenziale da una PN1 specifica degli eritrociti; la mancanza di questo enzima causa un anemia emolitica negli esseri umani. I globuli rossi che ne derivano mostrano un significante accumulo dei nucleotidi pirimidinici dovuto all incompleta degradazione dell RNA e dell RNA ribosomiale; questo ci mostra l importanza dell attività svolta dall enzima per la maturazione dei globuli rossi dal momento che l enzima permette il rilascio dei nucleosidi che sono permeabili alla cellula. Particolari sulla regolazione dell attività della PN1 e la sua influenza sul pool nucleotidico durante lo sviluppo eritroide sono sconosciuti. I dati sperimentali ci suggeriscono che l attività della PN1 negli eritrociti immaturi aumenta in maniera rilevante. Infatti, tra la 17 a e 23 a settimana di gestazione, l attività della PN1 nei globuli rossi dei feti umani risulta essere tre volte maggiore rispetto a quella riscontrata nei globuli rossi degli adulti (Lestas et al., 1986). 15

12 Dallo studio del metabolismo eritrocitico embrionale in un altro organismo eucariota come il pulcino, si è dimostrato che l adenosina 3 :5 - ciclica monofosfato (camp) controlla molti aspetti di questo metabolismo durante la seconda metà dell incubazione dell uovo. Negli embrioni di pollo un aumento della concentrazione di camp negli eritrociti è dovuta ad un rapido incremento della norefinefrina (NE) nel plasma, attivando così l adenilato ciclasi attraverso i recettori -adrenergici (Dragon et al., 1995, 1996). Lo stimolo fisiologico per il rilascio di NE è dato dall ipossia. Questi eventi avvengono quando la concentrazione di UTP negli eritrociti dell embrione diminuisce. Diversamente dal recettore -adrenergico, si è trovato un recettore adenosinico A2R accoppiato con l adenilato ciclasi. In vitro l attivazione del recettore adenosina A2R induce lo stesso processo metabolico che si osserva con l attivazione del recettore -adrenergico (Glombitza et al., 1996). Inoltre si è analizzata l attività dei due enzimi chiave del metabolismo pirimidinico, la pirimidina nucleoside fosforilasi (PNP) e la PN1 per vedere se i cambiamenti della loro attività enzimatica è correlata con il decrescere della concentrazione di UTP negli eritociti durante la differenziazione terminale e se le attività degli enzimi sono sotto controllo ormonale attraverso le catecolamine e le adenosine. I risultati mostrano che, durante la seconda settimana di incubazione l UTP è la seconda più abbondante fonte di fosfato organico degli eritrociti dell embrione. Questi ultimi presentano solo una minima attività della 16

13 PNP, escludendo quindi l utilizzo di uridina da parte degli eritrociti. Al contrario, l attività della PN1 aumenta significativamente tra il 13 e 15 giorno di sviluppo. L incubazione per undici giorni degli eritrociti con un recettore -adrenergico o adenosinico determinano la sintesi de novo dell enzima (PN1), che a sua volta aumenta all aumentare del rilascio di uridina nel mezzo d incubazione. L aumento dell attività della PN1 alla fine della seconda settimana di incubazione è dovuta all aumentare nel plasma del livello di catecolamine e alla conseguente attivazione dei recettori -adrenergici. Inoltre, l adenosina esterna potrebbe anch essa contribuire all attivazione della sintesi di PN1 attraverso il legame con i recettori A2R. I risultati ci mostrano che la sintesi della PN1 è particolarmente controllata dal camp durante la differenziazione terminale degli eritrociti e che l enzima risulta essere un fattore limitante per il rilascio di uridina durante la maturazione eritrocitaria. 17

14 Figura. 1.1 Ruolo del camp e PN1 nel metabolismo eritrocitico durante la differenziazione terminale. NT, trasportatore nucleosidico; AC, adenilato ciclasi; β-r, recettore adrenergico; A, adenosina; A2R, recettore adenosinico; NE, norefrinefrina; G, proteina G. Queste conclusioni sono state fatte anche in un recente studio sugli eritrociti umani nucleati dell embrione umano. I risultati possono essere applicati all eritropoiesi nell adulto. Nell organismo adulto, le cellule eritroidi immature si sviluppano nel midollo osseo. La regolazione della PN1 durante le ultime fasi della differenziazione eritroide associato con la degradazione dell RNA e un conseguente rilascio dei nucleosidi pirimidinici provvederebbe a determinare una effettiva via di recupero energetico che permette il trasferimento dei precursori dei nucleotidi pirimidinici alle cellule eritroidi in proliferazione durante i primi passaggi della differenziazione. 18