Evoluzione della classificazione del rigetto acuto e cronico del trapianto

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1 Giornale Italiano di Nefrologia / Anno 22 S / pp. S65-S70 Il Rene Trapiantato Evoluzione della classificazione del rigetto acuto e cronico del trapianto D. Santoro 1, G. Bellinghieri 2, A. Mallamace 2, V. Savica 2 1 UO di Nefrologia e Dialisi, Ospedale di Taormina 2 Divisione di Nefrologia e Dialisi, Università degli Studi di Messina Evolution of the classification of acute and chronic transplan rejection In the last twenty years, several systems have been proposed to codify renal allograft rejection. The Banff classification for kidney allograft pathology, introduced in 1993, started a new era in the standardization of criteria for rejection and for allowing uniform reporting. This consensus on allograft grading proposed a schema in order to guide therapy in transplant patients and to help establish an objective rejection end point in clinical trials. This schema, modified during to address many of the criticisms, was substantially improved. Another important system of classification of allograft renal biopsies was the Cooperative Clinical Trials in Transplantation (CCTT) classification which was published in The aim of this system was to develop a schema practical to implement, easy to describe to unfamiliar personnel, reproducible, with high rates of sensitivity and specificity and clinically informative (predictive of course and/or response to therapy). In March 1997, a fundamental revision of the Banff classification for acute rejection was achieved by a consensus conference for incorporating many of the strengths of the CCTT system. Some of these were the importance of vascular damage (endoarteritis, endothelial activation, fibrinoid necrosis) and interstitial hemorrhage, but not the interstitial infiltrate or tubulitis, that correlated with response to anti-rejection therapy and/or 1 year clinical outcome. The most recent modification concerns the addition of C4d positive acute humoral rejection and the emphasis of differences between cell mediated and antibody mediated rejections. Future refinements of these classifications and findings of new molecular markers of allograft rejection, such as fas-ligand or granzyme-b, will help to improve diagnosis and therapy in renal transplant patients. (G Ital Nefrol 2005; 22 (suppl 33): S65-70) KEY WORDS: Classification, Rejection, Banff, CCTT PAROLE CHIAVE: Classification, Rejection, Banff, CCTT La creazione di sistemi di classificazione del rigetto da trapianto renale, ha determinato nell ultimo decennio il fiorire di numerosi studi che hanno contribuito a portare sempre maggiore chiarezza nell interpretazione della biopsia renale e nel conseguente approccio terapeutico in tali situazioni. In passato erano stati effettuati alcuni tentativi di classificazione. In particolare, nel 1979 Finklenstein (1), aveva creato uno dei primi sistemi semiquantitativi, che dimostravano come le alterazioni patologiche correlassero con il decorso clinico del trapianto. Nel 1983, Matas et al (2) avevano proposto un sistema di classificazione simile a quelli attuali con ben otto categorie. In tale schema, l outcome ad un anno correlava con la categoria di appartenenza. Verso la metà degli anni ottanta, l avvento di nuovi farmaci immunosoppressivi nel panorama terapeutico internazionale ha movimentato l ambiente scientifico a tal punto che si è creata la necessità di proporre nuovi trial clinici per la valutazione d end-point patologici ben definiti nel trattamento anti-rigetto. Tale sforzo, in buona parte foraggiato anche dalle case farmaceutiche, aveva come obiettivo la standardizzazione delle biopsie renali dei pazienti trapiantati, affinché si stabilissero dei criteri immunopatologici, capaci di guidare la terapia anti-rigetto. Nello stesso periodo, alcuni gruppi di studio della società per il trapianto cardiaco, ed in particolare, i gruppi interessati al rigetto cardiaco e polmonare (3, 4), avevano provveduto alla creazione di criteri di standardizzazione di tali patologie. Società Italiana di Nefrologia S65

2 Evoluzione della classificazione. Del rigetto acuto e cronico del trapianto BANFF 93 Nell onda di tale fermento scientifico e sponsorizzati dalla Società Internazionale di Nefrologia, un gruppo di nefrologi, patologi e chirurghi del trapianto si sono riuniti dal 2 al 4 Agosto del 1991 a Banff, in Canada, per dar vita ad un nuovo sistema di classificazione del rigetto del rene trapiantato (5). In tale classificazioni venivano indicate due lesioni principali indicative di rigetto acuto: l arterite intimale e la tubulite. Veniva, inoltre, sminuita l importanza dell infiltrazione interstiziale da parte di monociti, considerata in precedenza come una lesione caratteristica in corso di rigetto, in quanto si affermava che il suo effetto sulla sopravvivenza del rene trapiantato era trascurabile. In particolare in uno studio di Burdick et al in cui venivano valutati clinicamente alcuni pazienti le cui biopsie renali presentavano un alto tasso di infiltrazione interstiziale, si notava come tali soggetti, a distanza di dieci anni, non avevano presentato alcun forma di rigetto e la funzione renale risultava nella norma (6). In un altro lavoro, D Ardenne aveva mostrato come pazienti in terapia stabile da parecchi anni con ciclosporina, presentavano un infiltrazione linfocitaria nell 80% dei casi e tale infiltrazione era diffusa nel 42% (7). Inoltre l infiltrazione interstiziale risente di una problematica legata al rigetto, che è tipicamente un patchy process. Con tale definizione si intende un processo che non è diffuso ma sparso nel contesto del parenchima a macchia di leopardo. Per tale motivo nella biopsia renale si può incorrere nel cosiddetto sampling error, che consiste nell avere un campione non rappresentativo della reale patologia del paziente. Per ovviare a tale possibile errore, infatti si consiglia di effettuare biopsie in punti diversi del rene. A tal proposito, il gruppo Banff, definiva anche l adeguatezza del frustolo, ritenendolo insoddisfacente se il numero dei glomeruli era inferiore a 7 senza nessun arteria, marginale se avesse compreso almeno 7 glomeruli ed un arteria e adeguato con almeno 10 glomeruli e due arterie. La prima classificazione Banff, che sarà successivamente indicata come Banff 93, per distinguerla dalle successive edizioni, proponeva per il rigetto acuto 5 gradi distinti. Il primo cosiddetto borderline si distingueva dal secondo, indicato come grade 1 per la presenza di tubulite con meno di 4 cellule mononucleari per sezione tubulare (Fig. 1) ed un infiltrazione interstiziale inferiore al 25%. Il grade II veniva ulteriormente suddiviso in tipo a, con tubulite più severa (oltre 10 cellule per sezione tubulare) e infiltrazione interstiziale diffusa e tipo b in cui si aveva anche la presenza di arterite lieve o moderata (Fig. 2). L ultimo stadio, indicato come grade III, si caratterizzava per un maggiore danno a livello arteriolare con arterite severa dell intima, necrosi fibrinoide, infarto focale con emorragia interstiziale. Nel Banff 93 veniva indicato, inoltre con un punteggio da 0 a 3, a significare il grado di Fig. 1 - Tubulite: presenza di linfomonociti tra alcune cellule di un tubulo non sede di atrofia. Fig. 2 - Arterite intimale: presenza di cellule mononucleari adese all intima dell arteria ad di sotto delle cellule endoteliali. coinvolgimento (normale, lieve, moderato e severo), per ciascun compartimento: glomerulare, tubulare, interstiziale e vascolare. Il rigetto cronico, caratterizzato dalla nefropatia cronica del trapianto, fibrosi interstiziale ed atrofia tubulare, veniva suddiviso in 3 gradi (lieve, moderato e severo) con ulteriori punteggi per ciascun compartimento glomerulare. Oltre il rigetto acuto e cronico, venivano anche definite le altre patologie non correlate direttamente con il rigetto, tra cui: i disordini linfoproliferativi post-trapianto, il danno acuto e cronico da ciclosporina, le cosiddette glomerulonefriti De novo, le glomerulonefriti ricorrenti le infezioni virali ed altre lesioni meno comuni. I risultati del Banff 93 avevano, pertanto, condotto ad una standardizzazione della nomenclatura ed alla quantificazione delle alterazioni, che si mostrava utile per fini terapeuti- S66

3 Santoro et al TABELLA I - PRINCIPALI DIFFERENZE TRA LA CLASSIFI- CAZIONE BANFF 93, BANFF 97 ED IL SISTEMA CCTT Banff Banff 97 CCTT Borderline Sospetto per Tipo I Grado I Tipo IA (T2 I2) Grado IIA Tipo IB (T3 I2) Grado IIB Tipo IIA (V1) Tipo II Grado III Tipo IIB (V2) Tipo III (V3) Tipo III ci ed altri studi. Peraltro tale standardizzazione, mise in luce successivamente alcuni problemi. Infatti, ci si rese conto, che venivano separate alcune lesioni che invece sarebbero dovute appartenere alla stessa categoria (l endoarterite suddivisa in grado IIb e III; l infiammazione tubulo-interstiziale suddivisa da grado borderline a grado IIa etc..). Inoltre, venne chiarito che la tubulite in tubuli atrofici non poteva essere considerata patologica e venne contestato il basso grado di riproducibilità di tale classificazione. Quest ultimo problema, era stato documentato in un lavoro di Marcussen et al. (8), in cui venivano revisionate 77 biopsie renali da parte di 5 patologi, per testare la riproducibiltà inter-observer della classificazione Banff. I risultati di tale studio mostravano una scarsa concordanza nelle valutazioni delle biopsie, eccetto che per una lesione particolare: l endoarterite. CCTT System Nonostante tutto, il lavoro del primo gruppo di lavoro Banff 93 aveva avuto il merito di stimolare la discussione in numerosi centri di trapianto, nonostante la sua applicazione fosse complessa da realizzare nella pratica ed avesse alcune limitazioni. Pertanto nel 1997 sorse un nuovo gruppo di lavoro, allo scopo di creare, sulla scorta del precendente sistema Banff, un nuovo sistema di classificazione semplificato. Tale associazione, la cui nascita fu sponsorizzata dall NIH (National Institute of Health), prese il nome di: Cooperative Clinical Trials in Transplantation (CCTT). Lo scopo di questo gruppo nascente era per l appunto la creazione di un sistema pratico per essere implementato e semplice da descrivere ad un personale non familiare con tale settore della patologia. Inoltre, il sistema CCTT, doveva essere riproducibile, avere un alta sensibilità e specificità, ed essere utile dal punto di vista clinico, nel senso di essere predittivo del corso del rigetto e della risposta alla terapia. Lo schema di classificazione del sistema CCTT prevedeva tre tipi di rigetto. Il tipo 1 comprendeva un infiltrazione interstiziale superiore al 5% della corticale, con almeno due delle seguenti caratteristiche: edema, degenerazione/danno tubulare, linfociti attivati. La tubulite doveva, inoltre, essere presente in 3 tubuli su 10 nelle aree più infiltrate. Il tipo 2 includeva l endoarterite intimale ed il tipo 3 la necrosi fibrinoide accompagnata o meno dalla trombosi, la necrosi parenchimale o l emorraggia. La riproducibilità e la sensibilità del sistema CCTT veniva testata nello stesso studio da un gruppo di patologi, i quali a rotazione dovevano accertare circa l assenza o la presenza di rigetto. La concordanza di risposte risultò eccellente, infatti, si ebbe il 91% di accordo osservando un solo frustolo e del 99% su un doppio frustolo. Peranto il gruppo CCTT concluse affermando che il loro sistema risultava semplice, riproducibile e rilevante dal punto di vista clinico (9). Banff 97 Nel Marzo del 1997, venne effettuata una importante revisione al sistema Banff, in seguito ad una consensus conference, che aveva inglobato molte delle indicazione che erano venute fuori dal sistema CCTT (10). In questa nuova classificazione una maggiore rilevanza clinica venne attribuita al danno vascolare, in seguito ad alcuni studi che erano venuti fuori negli ultimi anni. In particolare, in uno di tali studi, Nickeleit et al. avevano valutato 111 biosie renali dando dei punteggi ad alcune alterazioni istologiche ben specifiche, in particolare: endoarterite, adesione di cellule mononucleari alle cellule endoteliali, necrosi fibrinoide, cellule schiumose e fibrosi intimale (11). Tale analisi mise in evidenza che il rigetto con endoarterite si manifestava nel 54% dei casi, e che considerando, quale end point, la normalizzazione dei valori di creatinina in 3 settimane, l arterite intimale risultava meno responsiva al trattamento con steroidi. La necrosi fibrinoide, riscontrata nel 4% dei casi, non rispondeva in alcun caso né agli steroidi né agli anticorpi monoclonali. Infine, considerando la perdita dell organo ad un anno, gli Autori mostravano come essa si determinava nel 21% dei soggetti che non presentavano l endoarterite, rispetto al 28% di quelli in cui era presente tale lesione, ed era del 100% nelle biopsie con necrosi fibrinoide. Pertanto gli Autori enfatizzavano il ruolo del danno vascolare (endoarterite, necrosi fibrinoide etc.) rispetto al danno tubulo-interstiziale (infiltrazione e/o tubulite) nella risposta alla terapia anti-rigetto ed all outcome renale ad un anno. Come si può osservare dalla Tabella I, uno delle modifiche più importanti, che venne effettuato nel Banff 97 rispetto al 93 era l incorporazione del grado I e IIA del 93 nel tipo IA ed IB del 97, che a loro volta erano classificati, in maniera globale, come tipo I nel sistema CCTT. In tale S67

4 Evoluzione della classificazione. Del rigetto acuto e cronico del trapianto maniera si è voluto compattare il rigetto tubulo-intrerstiziale, in un unico livello (tipo I), modificando la precedente suddivisione in due livelli del Banff 93 (grado I e IIA). Inoltre il grado IIB e III del 93 furono compattati nel secondo gruppo, rispettivamente tipo IIA e IIB, del Banff 97, che corrispondevano al tipo II del sistema CCTT. In questo caso, si è differenziata l endoarterite (tipo II nel Banff 97 e nel CCTT) dalla necrosi fibrinoide che invece nel Banff 93 era compresa in un unico livello (Grado IIA e IIB). Data l importanza clinica della necrosi fibrinoide, tale lesione venne relegata al livello III sia nel Banff che nel CCTT e differenziata dall endoarterite, che come era stato dimostrato presentava un differente comportamento alla terapia immunosoppressiva ed un outcome molto più grave. Il Rigetto Acuto Anticorpo-Mediato Nella nuova classificazione Banff 97, il rigetto acuto veniva differenziato in anticorpo-mediato e cellulo mediato. L anticorpo-mediato, dovuto almeno in parte alla presenza di anticorpi preformati contro il donatore, veniva ulteriormente differenziato in immediato (o iperacuto) e ritardato (o acuto accelerato). Tale suddivisione fu successivamente messa in discussione, in quanto, negli ultimi anni stavano venendo fuori numerosi studi, circa l identificazione di markers patologici specifici di rigetto anticorpo mediato. In particolare Halloran et al., mostravano come il rigetto caratterizzato dalla presenza di neutrofili nei capillari peritubulari, ed anticorpi contro antigeni di classe I del sistema HLA, rappresentasse un entità distinta dal classico rigetto acuto ed iperacuto (12). In tale contesto, i pazienti con anticorpi contro antigeni di classe I del sistema HLA, rappresentavano il 23-38% e presentavano un decorso clinico più aggressivo. Inoltre, incominciava a delinearsi un nuovo marker patologico, nella diagnosi di rigetto acuto anticorpo-mediato, costituito dalla deposizione del C4d lungo le pareti dei capillari peritubulari (13). Il C4d è un frammento del complemento C4 e viene rilasciato nel corso dell attivazione della via classica del complemento, in seguito all interazione del complesso antigene-anticorpo. Poichè il C4d si lega covalentemente agli elementi tissutali, nel sito locale di attivazione, rappresenta un marker durevole di danno anticorpo-mediato. Collins et al., sottolinearono il ruolo importante di tale frazione del complemento, ed affermarono che la deposizione del C4d a livello dei capillari peritubulari, si associava con le tipiche alterazioni morfologiche del rigetto umorale anticorpomediato (14). Mauiyyedi et al., in uno studio su 232 biopsie renali effettuate in un singolo centro, per un rigetto acuto che si verificava nei primi tre mesi dal trapianto, hanno voluto correlare la deposizione del C4d, con le alterazioni patologiche specifiche e la presenza di anticorpi circolanti anti-donatore (15). I loro risultati misero in evidenza la presenza del C4d nei capillari peritubulari, nel 30% delle biopsie renali e la correlazione con alcune alterazioni patologiche ed umorali. Le alterazioni patologiche erano caratterizzate dalla presenza di neutrofili a livello dei capillari peritubulari (65% C4d+ vs 9% C4d-), mentre le alterazioni umorali erano costituite dal riscontro di anticorpi donatore-specifici (90% C4d+ vs 2% C4d-). Pertanto gli Autori sottolineavano l importanza del C4d quale esame diagnostico da effettuare in maniera routinaria e sollecitavano una nuova riclassificazione del rigetto anticorpo-mediato, poichè come era evidente nei loro risultati, tale forma di rigetto presenta una terapia ed una prognosi ben distinte. In seguito a tale evidenza, venne effettuata una nuova consensus conference allo scopo di stabilire dei nuovi criteri per il rigetto umorale, rispetto alla precedente classificazione Banff 97 (16). In tale contesto venivano definiti tre criteri, indicati come evidenze, per la diagnosi del rigetto anticorpo-mediato: 1) evidenza morfologica di danno tissutale acuto: a) danno tubulare acuto; b) neutrofili nei capillari tubulari, e/o glomerulari e/o trombosi capillare, arterite intimale/necrosi fibrinoide etc.: 2) evidenza immunopatologica dell azione dell anticorpo: a) C4d e/o immunoglobuline (raramente) nei capillari peritubulari; b) immunoglobuline e complemento nelle sedi di necrosi fibrinoide. 3) Evidenza sierologica di anticorpi monoclonali verso antigeni del sistema HLA del donatore o altri antigeni endoteliali anti-donatore. Conclusioni I vari schemi di classificazione del rigetto acuto e cronico del trapianto, nel corso degli anni hanno subito vari cambiamenti ed aggiornamenti, a causa della continua evoluzione delle conoscenze in tale ambito e dei numerosi studi che si sono sviluppati attorno ad essi. Sicuramente due degli obiettivi che si era promosso il primo gruppo collaborativo Banff, e cioè quelli di guidare la terapia ed aiutare a stabilire dei ben definiti end-point per i trial clinici sono stati raggiunti (5). L evidenza del raggiungimento di tale obiettivo è dato dal suo universale utilizzo nei trial clinici e di ricerca, in cui è richiesta l interpretazione immunopatologica delle biopsie dei reni trapiantati. Nonostante tale indubbio successo, tali schemi hanno subito nel corso degli anni parecchie critiche, in particolare diretti verso la scarsa riproducibilità dei risultati. Uno dei più grossi studi al riguardo è il CERTPAP (Convergence of European Renal Transplant Pathology Assessment Procedures) Project, in cui un gruppo di esperti patologi europei hanno testato la riproducibilità, tra diverse istituzioni, della classificazione Banff e CCTT (17). Le conclusioni di tale studio mostravano come i risultati interistituzionali non sono necessariamente riproducibili e che il trattamente del singolo paziente sulla base dell analisi della biopsia renale, deve essere S68

5 Santoro et al affidato alla capacità dell esperto immunopatologo locale. Negli ultimi anni sono emerse, nuove tecniche, per la diagnosi del rigetto, alternative alle classiche metodiche immunopatologiche tra cui in particolare la cosidetta diagnosi molecolare. A tal riguardo, alcuni Autori hanno analizzato l espressione dell mrna di alcune molecole (Granzyme B, perforin, Fas ligand), attraverso l utilizzo della tecnica RT-PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction), in biopsie renale e nei leucociti urinari e periferici. I risultati di tali studi mostravano una correlazione tra i livelli di tali molecole e la gravità del rigetto acuto (18). Nichel et al. hanno evidenziato una correlazione tra, i livelli di Fas Ligand e la risposta alla terapia immunosoppressiva (19). Infine Desvaux et al., hanno mostrato come la molecola Granzyme B presenta un elevata sensibilità (90%) e specificità (78%) nell individuare lesioni borderline che richiedono una terapia immunosoppressiva, mentre i livelli Fas Ligand correlano con la resistenza alla terapia immunosoppressiva, il che è un indice indiretto di un aggravamento della prognosi (20). Sulla base di tali evidenze riteniamo che in futuro l interpretazione istologica, della biopsia rene trapiantato, grazie al sempre più diffuso utilizzo delle attuali metodiche istologiche ed immunoistochimiche e con l ausilio di raffinate tecniche di diagnosi molecolare, testate da trial clinici multicentrici (Banff o CCTT), potrà permettere di ottenere diagnosi in tempi più brevi e risposte più precise attraverso la misurazione dell espressione genica di alcuni markers del rigetto. Riassunto Negli ultimi vent anni, sono stati proposti numerosi sistemi per la classificazione del rigetto da trapianto renale. La classificazione Banff per il rigetto da trapianto ha innescato una nuova era nella valutazione del rigetto. La prima conferenza multicentrica sul trapianto ha creato un sistema, che si proponeva di aiutare il medico nella gestione della terapia e che fosse in grado di creare degli end-point obiettivi per i trial clinici. La classificazione di Banff nel corso degli anni ha subito numerosi cambiamenti, per correggere le numerose critiche ed incorporare sostanziali cambiamenti. Un altro importante sistema di classificazione, per le biopsie del rene trapiantato, è stato il Cooperative Clinical Trials in Transplantation Classification (CCTT). Lo scopo di tale sistema fu quello di sviluppare uno schema pratico per essere implementato, semplice da descrivere a personale non familiare, riproducibile, con un alto tasso di sensibilità e specificità e clinicamente informativo (predittivo dell andamento della malattia e della risposta alla terapia). Nel Marzo del 1997 è stata effettuata una revisione fondamentale del sistema Banff, da parte di una consensus conference, allo scopo di introdurre molte delle idee che erano venute fuori dal sistema CCTT. Tra questi, l importanza del danno vascolare (endoarterite, attivatione endoteliale, necrosi fibrinoide) ed emoraggia interstiziale, ma non l infiltrato interstiziale o la tubulite, che correlavano con la risposta alla terapia anti-rigetto e/o con l outcome ad un anno. Poiché il rigetto umorale (AHR) presenta una terapia distinta ed una prognosi differente, è stato successivamente classificato separatamente dal rigetto cellulare (ACR) con un ulteriore suddivisione in: AHR I: coinvolgimento dei neutrofili a livello capillare ed AHR II: necrosi fibrinoide arteriolare. Ulteriori raffinamenti di tali classificazioni e la scoperta di nuovi marker molecolari di rigetto da trapianto, come fas-ligand o granzyme-b, aiuteranno a migliorare la diagnosi e la terapia nei pazienti portatori di trapianto renale. dal rigetto cellulare (ACR) con un ulteriore suddivisione in: AHR I: coinvolgimento dei neutrofili a livello capillare ed AHR II: necrosi fibrinoide arteriolare. Ulteriori raffinamenti di tali classificazioni e la scoperta di nuovi marker molecolari di rigetto da trapianto, come fasligand o granzyme-b, aiuteranno a migliorare la diagnosi e la terapia nei pazienti portatori di trapianto renale. Indirizzo degli Autori: Dr. Domenico Santoro Unità di Nefrologia e Dialisi Ospedale San Vincenzo santisi@hotmail.com Bibliografia 1. Finkelstein FO, Siegel NJ, Bastl C, Forrest JN Jr, Kashgarian M. Kidney transplant biopsies in the diagnosis and management of acute rejection reactions. 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