Gli attivatori trascrizionali sono delle proteine modulari domini funzionali sovrapposti
DIMOSTRAZIONE SPERIMENTALE DI DOMINI FUNZIONALI SEPARATI NEL TF DI LIEVITO GAL 4! Esperimenti di Ptshane. Cellule di lievito gal 4 - (gene deleto) trasformati con il plasmide reporter e plasmidi esprimenti il gene gal 4 wild type e vari mutanti di delezione clonati in plasmidi effettori.
Possono essere costruiti degli Attivatori trascrizionali chimerici unendo il dominio di legame di un fattore con la regione di tran-attivazione di un altro. Questo dimostra che le due funzioni possono essere separate.
HMG box: Elica Ansa Elica Ansa - Elica HTH: Elica Giro Elica Dita di zinco bhlh: Elica Ansa Elica Cerniera di Leucina http://molvis.sdsc.edu/fgij/slides.htm http://proteopedia.org/wiki/index.php/main_page 12-12-2012 6
Il motivo HMG box è costituito da 3 alfa eliche e due anse.! 2LEF.pdb Si lega al solco minore curvando il DNA verso il solco Maggiore.! E una proteina architettonica e riconosce strutture non B (DNA a quattro giunzioni, DNA curvo) o induce curvatura. Facilita le interazioni tra i TF di enhancer associati all espressione di alcuni geni.! 12-12-2012 Lymphoid enhancer-binding factor (LEF-1).! 7
MODELLO DELL ENHANCEOSOMA HMG1 induce curvatura aiuta gli altri TF a legare l enhancer e a porli nel giusto orientamento per l interazione con il complesso di trascrizione basale 12-12-2012 8
MOTIVO ELICA GIRO ELICA L elica 1 dell omeodominio è orientata diversamente rispetto al CI di λ omeodominio CI di λ 12-12-2012 9
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L elica di riconoscimento 3 si lega al solco maggiore. Le catene laterali degli aa interagiscono con le coppie di basi. La regione N terminale dell elica 1 si lega nel solcominore. Le catene laterali dell Arg 3 e 5 formano dei legami deboli specifici con le basi del solco minore e aspecifici con l impalcatuara Z-P. 12-12-2012 11
ALCUNI TF CONTENGONO DUE DOMINI DI LEGAME AL DNA Pict Oct Unc L omeodominio (a) e il dominio POU (b) interagiscono in maniera specifica con le coppie di basi dei due solchi maggiori posti su facce opposte della doppia elica del DNA. Non vi sono contatti proteina -proteina tra i due domini. Questo organizzazione in tandem dei due domini assicura maggiore specificità di legame alla sequenza di riconoscimento. 12-12-2012 12
Zn finger del tipo C-H. E il motivo di legame più ricorrente nei TF eucariotici. Il numero dei fingers nei TF varia da 3 (Sp1, Zif) fino a 37 (Xfin). Struttura di un finger. Un ione Zn ++ forma 4 legami di coordinazione con due His e 2 Cys. Il finger è costituito da una alfa elica e un piano beta con due filamenti antiparalleli. L alfa elica si insinua nel solco maggiore e forma dei contatti specifici con le coppie di basi. 12-12-2012 13
Sp1 e Zif 268 contengono 3 fingers che sono organizzati in una struttura semielicale che posiziona le alfa eliche di ogni finger nel solco maggiore. Ogni finger lega il DNA allo stesso modo legando 9 coppie di basi consecutive. 12-12-2012 14
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Heat shock protein Le proteine Heat Shock si dissociano quando l ormone si lega al suo recettore Formazione dell omodimero La sequenza di localizzazione nucleare è esposta Glucocorticoid Response Elements Funzionano da enhancers La trascrizione dei geni traget è attivata Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display
I recettori degli ormoni steroidei hanno due Zn-fingers CC/CC 12-12-2012 17
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Struttura del complesso Recettore dei Glicocorticoidi/GRE. Anse di dimerizzazione 12-12-2012 20
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Zn finger binucleato in gal 4 12-12-2012 22
Struttura del complesso UAS e il dominio di legame di Gal 4. Gal 4 è diviso in 3 regioni: dimerizzazione, linker e DNA binding. Il legame dei due monomeri avviene con due solchi maggiori posti su lati opposti del DNA (distanti 1,5 giri d elica) 12-12-2012 23
Interazione di un monomero di Gal 4 a un mezzo sito UAS. La regione del Cluster di Zn binucleato si lega al solco Maggiore ed è ancorata al DNA da interazioni non specifiche con l impalcatura (blu). La regione linker si lega al DNA. La Lys 18 della regione C terminale dell alfa elica 1 lega tre coppie di basi nel solco maggiore. 12-12-2012 24
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L associazione combinatoria dei TF con la formazione di eterodimeri espande la gamma delle specificità di legame al DNA o impedisce il legame di un TF. 12-12-2012 26
TF ELICA- ANSA - ELICA (H L H) si legano al DNA con le α-eliche basiche in modo simile ai TF b-zip. Sono definite b-hlh basico 12-12-2012 27
Le proteine Elica - Ansa - Elica interagiscono per associazione combinatoria Un omodimero b-hlh riconosce una sequenza simmetrica sul DNA ed attiva la trascrizione. L eterodimerizzazione con un membro della famiglia HLH privo dell alfa elica basica non lega il DNA. Se presente in eccesso, la proteina HLH blocca la formazione dell omodimero b-hlh. 12-12-2012 28 differenziamento proliferazione
FATTORI DI TRASCRIZIONE A CERNERIA DI LEUCINA b-zip! La regione basica e il leucine zipper formano una lunga α-elica. L α- elica basica di ogni monomero si insinua nel solco Maggiore del DNA a modo di pinza emostatica che tiene il DNA. Cerniera di leucina! Regione basica! 12-12-2012 29
Fattori di Trascrizione a cerniera di leucina (b-zip)! Le α-eliche destrogire nel supercoil levogiro riducono il numero di residui da 3,6 a 3,5 per giro Nei TF b-zip ogni sette aa si trova un residuo idrofobico (leu). GCN4 12-12-2012 30
Rappresentazione come helical wheel della sequenza aa del dominio di legame al DNA dei TF a cernirera di leucina. Gli aa di ogni settima posizione sono unite a formare i raggi a-g di una ruota. La leu si ripete ogni sette residui nel raggio d.! 12-12-2012 31
La formazione di omodimeri o eterodimeri nelle strutture coil-coil dipende da interazioni elettrostatiche tra aa di carica opposta! 12-12-2012 32
ALCUNI FATTORI DI TRASCRIZIONE POSSONO FORMARE SOLO ETERODIMERI! Nei raggi (e) e (g) sono presenti degli aa carichi che favoriscono la formazione di omo ed eterodimeri. Fos non può formare omodimeri per la forte repulsione tra le cariche dei residui di Glu in (g) ed (e) in assenza di cariche positive compensatorie. Fos forma un eterodimero Jun-Fos.! 12-12-2012 33
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Organizzazione dei geni dell rrna 12-12-2012 35
L anatomia molecolare degli rdna è conservata 12-12-2012 36
L osservazione al M.E. dell rdna di Xenopus mostra delle figure ad albero di Natale. I rami sono costituito da particelle ribonucleoproteiche (rrnap) Direzione di trascrizione Direzione di trascrizione Il doppio albero indica che i due tipi di promotore sono attivi.! La trascrizione dal promotore dello spacer inizia e termina prima 12-12-2012 del promotore del gene.! 37
L organizzazione dei promotori dell rdna è conservata Nell IGS sono localizzati il promotore dello spacer e il promotore dei geni. Strutturalmente sono uguali e legano gli stessi fattori di trascrizione. Vi sono anche delle sequenze enhancer rappresentate da numerose ripetizioni in tandem del sito di legame per il fattore di trascrizione UBF. Al 3 del 28 S e tra i due tipi di promotori sono presenti dei terminatori della trascrizione. Il fattore TTF1 è responsabile della terminazione. 12-12-2012 38
UPE! CORE! I promotori Pol I di topo e uomo sono specie specifica: l rdna umano è trascritto in cellule o estratti nucleari umane ma non in quelli di topo e viceversa.! TAF L elemento CORE lega SL1 ed è responsabile della specie specificità.! SL1 è costitito da TBP e tre TAF che sono speciche per la Pol I! Le tre TAF poli di topo ed uomo sono differenti.!
FORMAZIONE DEL PIC DELLA RNA POLIMERASI I! 12-12-2012 40
Promotori della RNA polimerasi III Terminatore Il promotore per l RNA di U6 ha le caratteristiche di un promotore della pol II. La TATA box è l elemento discriminante. Se la togliamo il promotore diventa identico a quello del gene per U2 (trascritto dalla pol II) e U6 senza la TATA box viene trascritto dalla pol II. DSE= Promotore Distale; lega il TF POU, OCT 1. PSE= Promotore prossimale; lega un complesso SNAPc. TATA= lega la TBP che è associata ad uno o più proteine 12-12-2012 41
PIC RNA POL III! TFIIIC e TFIIIA e sono TF di assemblaggio. Servono per reclutare TFIIIB nel sito d inizio. TFIIIB, costituito da TBP e TAFs III, recluta la RNA pol III e partecipa al melting del promotore (5S) indipendentemente dall ATP. Probabilmente TFIIIC e TFIIIA si dissociano una volta che la Polimerasi inizia a trascrivere 12-12-2012 42
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