CLASSIFICAZIONE STRUTTURALE DELLE MUTAZIONI

CLASSIFICAZIONE STRUTTURALE DELLE MUTAZIONI 1. sostituzioni 2. piccole inserzioni, delezioni o inserzioni + delezioni contemporaneamente (indels) 3. riarrangiamenti genomici a due o più punti di rottura (delezioni, duplicazioni, traslocazioni, inversioni ecc.) 4. copy number variations (CNV) a queste quattro classi appartengono in modo indistinguibile tanto le variazioni innocue quanto le mutazioni causative di malattia

MUTAZIONI PUNTIFORMI: effetto a livello di traduzione mutazioni silenti, quando l aminoacido non cambia mutazioni missenso quando un aminoacido è sostituito da un altro aminoacido mutazioni nonsenso quando un aminoacido è sostituito da un codone prematuro di terminazione mutazioni nonstop quando al contrario un codone di terminazione è sostituito da un codone di un aminoacido

EFFETTO FENOTIPICO DELLE MUTAZIONI (interpretazione molecolare del mendelismo)

EFFETTO FENOTIPICO DELLE MUTAZIONI Quali prove sono necessarie per stabilire un rapporto di causaeffetto tra mutazione e fenotipo clinico? dimostrazione della stessa mutazione in famiglie diverse con stessa patologia; documentazione dell'insorgenza de novo della mutazione e della patologia e della loro successiva co-segregazione (AD); assenza della mutazione in un ampio numero di controlli normali; controlli funzionali (a livello proteico, metabolico, ecc.)

MECCANISMO PATOGENETICO Un alterazione genetica: come altera la quantità o la qualità del prodotto proteico codificato? come questo agisce nel determinare la patologia? sono note le tappe del processo patogenetico? in particolare, perché produce un danno rilevabile a livello clinico? è possibile fare una classificazione funzionale oltre che strutturale delle mutazioni?

LIVELLI DI ESPRESSIONE DEL FENOTIPO I metodi di indagine del fenotipo possono differire notevolmente da caso a caso: Si prenda come esempio l anemia falciforme: a) Fenotipo Clinico : sintomi rilevabili (astenia, dispnea, ecc.); b) Fenotipo Cellulare : morfologia dei globuli rossi (a falce); c) Fenotipo Molecolare : può essere indagata l intera molecola di Hb oppure il prodotto primario del gene, cioè la catena ß dell Hb; d) Analisi del DNA : a questo livello si può dire che fenotipo e genotipo coincidono.

CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE MUTAZIONI (in base all effetto fenotipico) PERDITA DI FUNZIONE ( LOSS OF FUNCTION ) ACQUISIZIONE DI FUNZIONE ( GAIN OF FUNCTION )

QUANDO SOSPETTARE CHE UNA MUTAZIONE PROVOCHI PERDITA DI FUNZIONE?

quando lo stesso fenotipo clinico viene prodotto da: delezioni mutazioni puntiformi distruzione del gene a seguito di riarrangiamento strutturale del cromosoma (traslocazione o inversione cromosomica) coinvolgente il locus

MUTAZIONI CON PERDITA DI FUNZIONE Quando il prodotto genico ha una funzione biologica ridotta o assente generalmente si producono fenotipi recessivi.

α-talassemia Correlazione genotipo-fenotipo Fenotipo clinico N di geni α genotipo produzione di catene α Normale 4 αα / αα 100% Portatore sano 3 αα / α- 75% Tratto talassemico (anemia lieve, microcitosi) 2 α- / α- (cis) αα / - - (trans) 50% Malattia da Hb H (β4) (anemia emolitica moderatamente severa) Idrope fetale o talassemia 1 α- /- - 25% 0 - - /- - 0% omozigote (Hb di Bart: γ4)

QUANDO SOSPETTARE CHE UNA MUTAZIONE PROVOCHI ACQUISIZIONE DI FUNZIONE?

Quando si ha: espressione fenotipica in eterozigosi il fenotipo clinico non si associa mai alla delezione del locus genico maggiore specificità e minore frequenza nella popolazione rispetto alle mutazioni con perdita di funzione

Manifestazione in eterozigosi a causa di: reale acquisizione di una nuova funzione espressione in un momento sbagliato dello sviluppo espressione nel tessuto sbagliato in risposta a segnali errati espressione a livelli inappropriatamente elevati

MUTAZIONI CON ACQUISIZIONE DI FUNZIONE Quando il prodotto genico ha una funzione diversa dal normale, si produce generalmente un fenotipo dominante.

MUTAZIONI DIVERSE DELLO STESSO GENE PRODUCONO PERDITA O ACQUISIZIONE DI FUNZIONE GENE EFFETTO MUTAZIONE TIPO CELLULARE FENOTIPO CLINICO pax3 perdita di funzione germinale s. di Waardenburg guadagno di funzione somatico rabdomiosarcoma ret perdita di funzione germinale s. di hirschprung guadagno di funzione somatico men2a, 2b, carcinoma midollare della tiroide kit perdita di funzione germinale piebaldismo guadagno di funzione somatico oncogenesi GISTs

S. di Waerdenburg (gene PAX3) A. Madre e figlia: ciuffo frontale bianco B. Ragazzo di 10 anni con sordità congenita, naso prominente con ali ipoplasiche C. Fratelli con ipertelorismo, modesta microftalmia, sordità (uno solo), eterocromia dell iride (uno solo) D. Bimbo di 4 mesi con ciuffo bianco alla nascita, ora pigmentato, impianto laterale dei canti interni, ipoplasia delle ali del naso.

SINDROME DI HIRSCHPRUNG (GENE RET)

PIEBALDISMO (gene KIT)

CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DELLE MUTAZIONI 1. allele equivalente 2. allele ipomorfo 3. allele amorfo 4. allele ipermorfo 5. allele neomorfo 6. allele antimorfo

1. allele equivalente (funzionalità inalterata) variazione che non modificano né la quantità, né la qualità biochimica e funzionale del prodotto genico il prodotto genico risulta invariato e normalmente localizzato esempi sono le circa ~10.000 differenze della sequenza del DNA codificante che si osservano nella popolazione umana che non hanno alcuna conseguenza patologica (SNPs) Assenza di effetto fenotipico

2. allele ipomorfo (perdita di funzione parziale) variazione della sequenza del DNA che riduce la quantità di prodotto genico e/o la sua qualità funzionale tali alleli sono silenti e recessivi e possono agire più come modificatori del fenotipo che come causa diretta di patologia alleli ipomorfi possono però essere causa di malattia se in emizigosi esempio: gli alleli ipomorfi del gene della distrofina localizzato sul cromosoma X che determinano quadri di distrofia muscolare di Becker nei maschi in quanto hanno una singola copia del gene Assenza di effetto fenotipico in eterozigosi

3. allele amorfo (perdita di funzione totale) variazione di sequenza del DNA più drastica: corrisponde classicamente alla delezione (cancellazione) della sequenza codificante del gene un allele amorfo può essere prodotto da altri tipi di mutazione che abbiano la medesima conseguenza di una delezione totale del gene in emizigosi causa una malattia genetica quando colpisce una funzione genica essenziale (es emofilia, distrofia muscolare di Duchenne, ecc) l allele amorfo in eterozigosi in genere è presente in un portatore sano di una malattia autosomica recessiva Assenza di effetto fenotipico in eterozigosi

4. allele ipermorfo (acquisizione di funzione) ipermorfo è l allele che determina l aumentata quantità o funzione di un prodotto genico l allele ipermorfo può essere semplice o avere una combinazione di altri effetti come ad esempio, quello di essere presente in una localizzazione impropria o in un tempo sbagliato è associato di regola ad un tratto genetico dominante, in quanto l aumentata espressione/funzione non può essere bilanciata dall allele non mutato un esempio è l aumentata funzione del recettore per l FGF3 che causa l acondroplasia (nanismo dismorfico) che è appunto a trasmissione autosomica dominante Presenza di effetto fenotipico in eterozigosi

5. allele neomorfo (acquisizione di funzione) neomorfo (neo=nuovo) definito come causato da una mutazione che porta ad un prodotto genico nuovo o una funzione nuova si distingue solo didatticamente dall allele ipermorfo valgono le stesse considerazioni fatte per l allele ipermorfo sulla natura dominante della mutazione in alcune forme di cancro l allele neomorfo è una chimera di due geni, dovuta ad una traslocazione cromosomica, come il cromosoma di fusione Philadelphia con la comparsa di nuove proteine Bcr-abl in casi di leucemia mieloide cronica Presenza di effetto fenotipico in eterozigosi

6. allele antimorfo o dominante negativo (perdita/acquisizione di funzione) antimorfo (anti=contro) definito come causato da una mutazione che porta ad un prodotto genico antagonistico è il risultato di una mutazione che colpisce un gene il cui prodotto proteico funziona in cooperazione con altre proteine particolari mutazioni rendono la proteina di disturbo a tutte le altre pur essendo queste ultime perfettamente normali un esempio è dato dal collagene in cui più geni (e due alleli per ogni gene) contribuiscono alla formazione delle proteine ciascuno producendo una parte delle catene di base: una mutazione in un solo allele produce un effetto negativo complessivo Presenza di effetto fenotipico in eterozigosi

APLOINSUFFICIENZA (loci sensibili al dosaggio genico) Un allele amorfo in eterozigosi in genere si associa ad un fenotipo recessivo ma se riguarda un locus in cui il 50% del dosaggio (prodotto dall altro allele non mutato) non è sufficiente a mantenere lo stato di normalità del fenotipo si parla di allele e mutazione aploinsufficiente che si associa ad un fenotipo dominante.

DOMINANZA NEGATIVA ( loci non sensibili al dosaggio genico ) Se il prodotto di un allele ipomorfo interagisce con quello dell allele normale, perché entra a far parte di molecole multimeriche, può inattivarlo generando così una condizione di perdita di funzione associata ad un fenotipo dominante

MUTAZIONE APLOINSUFFICIENTE OI tipo lieve MUTAZIONE DOMINANTE NEGATIVA OI tipo grave COL1A1 COL1A2 COL1A1 COL1A2 Mancata espressione dell allele mutato (ALLELE AMORFO) con riduzione del numero di fibre collagene Espressione alterata dell allele mutato (ALLELE ANTIMORFO) il cui prodotto proteico si integra nel collagene alterandone la struttura

Osteogenesi imperfetta di tipo I Bimbo di 2 mesi: fratture ossee spontanee, ernia inguinale, epato-splenomegalia (sclere blu) Mutazioni a carico di COL1A1 o A2 che portano a perdita di funzione (allelli amorfi) causano OI di tipo lieve per effetto di aploinsufficienza

Osteogenesi imperfetta di tipo II Gravi alterazioni scheletriche incompatibili con vita autonoma Mutazioni di senso errato portano alla formazione di alleli antimorfi il cui prodotto proteico, legandosi a quello dall allele normale, causa OI di tipo grave per effetto di dominanza negativa

F I N E

Esempio di mutazioni con guadagno di funzione Variante Pittsburg dell α1-antitripsina Eziopatogenesi: l α1-antitripsina è un inibitore dell elastasi. La mutazione di senso errato M358R sostituisce la metionina con l arginina nel sito attivo della molecola, la quale non lega più l elastasi ma la trombina. Questa nuova antitrombina costitutivamente attiva è causa di una patologia letale della coagulazione.

I MECCANISMI DELLE MUTAZIONI CON ACQUISIZIONE DI FUNZIONE FUNZIONE ERRATA GENE MALATTIA Acquisizione di un nuovo substrato PI Deficit alfa1-antitripsina Sovraespressione PMP22 M. di Charcot-M-Tooth Recettore sempre attivo GNAS 1 McCune-Albrigh (PFD, displasia fibrosa poliostotica) Alterazione canali ionici (Na) SCN4A Paramiotonia congenita Multimeri strutturalmente anomali COL2A1 Osteogenesi imperfetta Ignota HD Corea di Huntington Gene chimerico BCR-ABL Leucemia Mieloide Cronica

FENOTIPI CAUSATI DALL EFFETTO DI DOSE DI SINGOLI GENI PRODOTTO GENICO DOSAGGIO FENOTIPO RISULTANTE Inibitore dell esterasi C1 50% Edema angioneurotico Fibrillina 50% S. di Marfan Proteina PAX3 50% S. Waardenburg tipo 1 Proteina PAX6 50% Aniridia Recettore LDL 50% Ipercolesterolemia Proteina mielina PMP22 50% Neuropatia tomaculare 150% CMT tipo 1A Prodotto DSS 200% Femmine 46, XY Può essere difficile dimostrare che un fenotipo dipenda da un semplice effetto di dosaggio genico e non tutti gli esempi riportati in questa tabella potrebbero risultare validi nel tempo

MUTAZIONI CON EFFETTO FENOTIPICO A livello di: struttura del gene: alterazioni dello splicing, delle fasi maturative dell'rnam, della traduzione, della regolazione genica, ecc. funzione del gene: - perdita allele amorfo o nullo - riduzione allele ipomorfo - guadagno quantitativo qualitativo allele ipermorfo allele neomorfo cellulare e/o somatico: recessività (espressione in omozigosi) dominanza (espressione in eterozigosi)

LOSS-OF-FUNCTION MUTATIONS La perdita di funzione di un gene può dipendere da: Riduzione del dosaggio genico. Es.: α-talassemia: delezioni dei geni dell α-globina s. di Turner: monosomia del cromosoma X cancro: perdite acquisite a livello somatico di geni oncosoppressori (Retinoblastoma)

DNA replicazione Trasmissione: proliferazione Genotipo espressione Sintesi proteica: attività cellulare Fenotipo MITOSI (generazioni cellulari) somatic cells MEIOSI (generazioni di individui) germ cells Metodiche di studio: - molecolare - citogenetica - biochimica Livello di espressione - molecolare - subcellulare - cromosomico (> 4-5 Mb) - tessuto - organo - sistemico - multisistemico Esami diagnostici: - molecolare - biochimici - citogenetico - anatomo-patologici - RX,RMN,Eco, ecc - clinico-dismorfologico - polispecialistico