ESPRESSIONE GENICA: FLUSSO DI INFORMAZIONI DAL DNA ALLE PROTEINE CELLULA EUCARIOTICA Ogni step cos,tuisce un possibile punto per controllare l abbondanza di una certa proteina. La maggior parte del controllo avviene a livello della TRASCRIZIONE. 1
ESPRESSIONE GENICA: FLUSSO DI INFORMAZIONI DAL DNA ALLE PROTEINE CELLULA EUCARIOTICA -PROCARIOTICA Regolazione Genica nei procarioti Cromosoma batterico di E. coli contiene più di 4200 geni codificanti. GENI COSTITUTIVI: costantemente trascritti (es. geni che codificano per proteine della glicolisi). GENI INDUCIBILI: espressi solo in determinate condizioni (es. geni che codificano per proteine del metabolismo del lattosio vengono espressi solo in presenza di questo disaccaride nell ambiente). Regolazione dell attività di un enzima e/o regolazione del numero di molecole di enzima per cellula. 2
Regolazione Genica nei procarioti Jacob e Monod (1961): identificano l Operon Lac, complesso genico comprendente Ø GENI STRUTTURALI con funzioni correlate (lacz, lacy, laca codificanti per -galattosidasi, galattosio permeasi, galattoside transacetilasi) sotto il controllo di un unico promotore Ø GENI DI CONTROLLO (operatore e repressore) Regolazione Genica nei procarioti L operatore è una sequenza di basi, in parte sovrapposta al promotore, che si trova a monte del primo gene strutturale In assenza di Lattosio, una proteina repressore (codificata da un gene regolatore costitutivamente espresso) si lega all operatore lattosio; quindi l RNA polimerasi non può legarsi al promotore e la trascrizione dell operone Lac è inibita 3
Regolazione Genica nei procarioti Il repressore lattosio ha anche un sito di legame allosterico per l allolattosio (prodotto in piccole quantità in presenza di lattosio). Quando l allolattosio lega il repressore, questo si modifica e si stacca dall operatore, il promotore si libera e l RNA può trascrivere l operone In assenza di allolattosio, il repressore si lega nuovamente all operatore, bloccando la trascrizione dell operone 4
Regolazione dell espressione genica nei procario, Principalmente regolazione trascrizionale Un esempio è l OPERONE LAC: geni, trascrif insieme, che codificano per 3 proteine necessarie per l u,lizzo del lajosio (galajosio-glucosio). Questo operone viene trascrijo se c è il lajosio e non c è il glucosio. IL REGULONE Regulone: gruppo di operoni controlla, da un solo gene regolatore La proteina CAP controlla la trascrizione di una serie di operoni coinvol, in diverse vie cataboliche Una mutazione di CAP può impedire alla cellula di metabolizzare una serie di zuccheri da essa regola, 5
OPERONE LAC 6
Questa ESPRESSIONE può avvenire con una efficienza diversa. Trascrizione 14 7
Regolazione dell espressione genica negli eucario, Eucarioti pluricellulari: -un singolo organismo, utilizzando un unico genoma, deve produrre centinaia di tipi cellulari differenti e specializzati; -le cellule differenziate sono prodotte da popolazioni di cellule immature, non specializzate, dette cellule staminali, attraverso un processo noto come differenziamento cellulare Cellula umana contiene circa 30000 geni RNA genes Geni per proteine Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte di questo potenziale ( 5000 geni) Geni housekeeping metabolismo biosintesi membrana istoni ribosomali Geni tessuto - specifici DIFFERENZIAMENTO CELLULARE A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE) UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA 8
I meccanismi di controllo usati per regolare l espressione dei geni umani devono essere molto più complessi di quelli utilizzati dagli altri organismi. Regolazione dell espressione genica negli eucario, Controllo dell espressione genica: 1. Controllo trascrizionale: a) MECCANISMI EPIGENETICI: modellamento della cromatina b) FATTORI TRASCRIZIONALI: legame di fajori proteici a sequenze nucleo,diche di regolazione (AFvatori e repressori) 9
a) MECCANISMI EPIGENETICI: modellamento della cromatina Trascrizione 19 20 10
EPIGENETICA: Acetilazione e altre modifiche istoniche e metilazione del DNA. Si tratta di modifiche della cromatina che non comportano cambiamenti nella sequenza di basi del DNA. Acetilazione degli istoni e altre modifiche istoniche e metilazione del DNA modificano la struttura della cromatina e possono REGOLARE L ESPRESSIONE DEI GENI MEDIANTE: MECCANISMI EPIGENETICI GENE: Ogni regione del DNA capace di sintetizzare una molecola funzionale di RNA. Regolazione dell espressione genica negli eucario, Controllo dell espressione genica: 1. Controllo trascrizionale: a) MECCANISMI EPIGENETICI: modellamento della cromatina b) FATTORI TRASCRIZIONALI: legame di fajori proteici a sequenze nucleo,diche di regolazione (AFvatori e repressori) 11
b. FATTORI TRASCRIZIONALI PROTEINE CHE RICONOSCONO E LEGANO SPECIFICHE SEQUENZE ALL INTERNO DI UN PROMOTORE: - FATTORI TRASCRIZIONALI BASALI sono indispensabili per l inizio della trascrizione, aiutano la RNA polimerasi a riconoscere il promotore - ATTIVATORI TRASCRIZIONALI aumentano l efficienza di trascrizione - REPRESSONI TRASCRIZIONALI diminuiscono l efficienza di trascrizione Fa8ori trascrizionali 23 Una serie di fattori di trascrizione deve legarsi al promotore prima che la RNA polimerasi vi si possa legare e trascrivere quindi, a livello basale, il gene. L efficienza della trascrizione dipende anche dal legame di proteine di regolazione, attivatrici e, in alcuni casi di repressione, al promotore. Altre sequenze di DNA, spesso molto distanti dal promotore, sono ulteriormente implicate nella regolazione, aumentandola (enhancer) o reprimendola (silencer). -100 GC box -80 CAAT box -25 TATA box Elementi distali Elementi prossimali Promotore basale Fa8ori trascrizionali 24 12
ENHANCER - SILENCER Una sequenza enhancer classica contiene al suo interno parecchi elementi di controllo differenti, ognuno dei quali è costituito da una corta sequenza di DNA che funziona da sito di legame per uno specifico fattore di trascrizione regolativo (attivatore). Spesso i siti di legame possono essere gli stessi presenti nelle sequenze prossimali. I silencer sono meno abbondanti, legano fattori in grado di ridurre l efficienza di trascrizione (repressori). Fa8ori trascrizionali 25 REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO TRASCRIZIONALE: FATTORI TRSCRIZIONALI LA REGOLAZIONE GENICA A LIVELLO TRASCRIZIONALE AVVIENE ATTRAVERSO IL LEGAME DI FATTORI PROTEICI (FATTORI DI TRASCRIZIONE) A SEQUENZE NUCLEOTIDICHE DI REGOLAZIONE. I FATTORI PROTEICI IMPEGNATI A REGOLARE L ESPRESSIONE GENICA AGISCONO IN TRANS LEGANDOSI ALLE SEQUENZE DI DNA CHE SONO IN PROSSIMITA DEL GENE (IN CIS) Fa8ori trascrizionali 26 13
FATTORI TRASCRIZIONALI 14
Regolazione trascrizionale in risposta ad ormoni lipofili# In assenza di stimolo il recettore è inattivato mediante il legame con una proteina di inibizione (HSP90) Fa8ori trascrizionali 29 15
I DUE PRINCIPALI MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE (MECCANISMI EPIGENETICI E FATTORI TRASCRIZIONALI) SPESSO AGISCONO INSIEME. Fa8ori trascrizionali 31 Repressori e attivatori, grazie a co-attivatori/corepressori, dirigono quindi la deacetilazione/ acetilazione degli istoni a livello di specifici geni Fa8ori trascrizionali 32 16
STRUTTURA GENE EUCARIOTICO Regolazione dell espressione genica negli eucario, Controllo dell espressione genica: 2. Controllo post-trascrizionale: SPLICING ALTERNATIVO STABILITÀ DELL mrna (mirna, sirna) 17
Regolazione dell espressione genica negli eucario, Splicing alternativo 18
La stabilità dell mrna citoplasmatico è variabile! 19
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The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 was awarded jointly to Andrew Z. Fire and Craig C. Mello "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" h8p://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/ 21
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 was awarded jointly to Andrew Z. Fire and Craig C. Mello "for their discovery of RNA interference - gene silencing by doublestranded RNA" Caenorhabdi,s elegans h8p://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/ 22
pri-mirna pre-mirna mirna 23
1.Complementarità imperfetta I mirna bloccano l espressione dei loro geni target a livello traduzionale Per inibire la traduzione legano solitamente le regioni non tradotte al 3 (3 UTR),per le quali presentano omologia 2.Complementarità perfetta I mirna che legano i loro RNA bersaglio con complementarietà perfetta inducono il taglio del bersaglio che,quindi,non può più essere tradotto: STABILITA DELL mrna Target, attivano la degradazione dell mrna In questo caso i mirna trovano la loro regione di omologia o nell ORF(open reading frame) o nella sequenza codificante 24
sirna I sirna agiscono principalmente determinando la degradazione dello specifico mrna bersaglio attraverso un meccanismo definito RNA interference(rnai) Molecole di sirna si producono a partire da RNA normalmente estranei alla cellula, quali trasposoni,virus o transgeni. RNAi perciò rappresenta un sistema di difesa contro l invasione di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma 25
STRUTTURA GENE EUCARIOTICO Modello per la biogenesi e l attività di mirna e sirna 26
sirna agiscono solo per complementarietà perfetta per cui ogni sirna può avere un unico mrna bersaglio e modulare la stabilità dell mrna Diversamente, i mirna costituiscono una numerosa classe di geni endogeni filogeneticamente conservati,la cui funzione è di inibire l espressione genica principalmente attraverso l inibizione della traduzione Ogni mirna,per il suo caratteristico meccanismo d azione può avere più di un mrna bersaglio MiRNAs filogene,camente conserva, 27
* * Respiratory syncy,al (RS) virus is the most common cause of respiratory and breathing infecoons in children. mirna CIRCOLANTI 28
mirna CIRCOLANTI mirna CIRCOLANTI * * RBP: RNA Binding Proteins 29
mirna CIRCOLANTI mirna CIRCOLANTI: marcatori diagnostici * # AML: acute myeloid leukemia DLBCL: diffuse large B-cell lymphoma * # 30
OMEOSTASI DEL FERRO NELLA CELLULA : regolazione post-trascrizionale Il ferro e un nutriente essenziale La cellula lo usa per: citocromi, emoglobina e molti enzimi. Il ferro in eccesso e causa di formazione di radicali liberi. Quindi la concentrazione di ferro deve essere controllata accuratamente. Ferri,na: Lega il Ferro e lo conserva ReceJore della Transferrina (TFR): trasporta il ferro nella cellula Regolazione di proteine trasportatrici/ immagazzinamento del ferro Ferritin Sangue! Fe 2+! Transferrin receptor (ingresso) (Stoccaggio)! Fe 3+! Transferrin (trasporto)! Quando il ferro e in eccesso la cellula deve ridurre il numero di molecole di recettore e aumentare quello della ferritina.! La cellula ottiene questo mediante regolazione della traduzione, cosi la risposta e piu rapida 31
OMEOSTASI DEL FERRO NELLA CELLULA : regolazione post-trascrizionale Sono state evidenziate numerose sequenze di regolazione all interno delle sequenze non tradotte (5 e 3 UTR). Esistono proteine che legandosi a specifiche sequenze di RNA controllano l espressione genica a livello traduzionale 5 UTR Elemento IRE 3 UTR La velocità di degradazione di alcuni mrna eucariotici è regolata Regolazione Ferro-dipendente della stabilità dell mrna del recettore della transferrina +Fe -Fe Una proteina in grado di legarsi alle sequenze IRE (IRE-BP) regola la produzione del recettore della transferrina. Essa in presenza di basse concentrazioni di ferro si lega agli elementi di risposta al ferro (IRE) che si trovano nella regione non tradotta al 3 (3 UTR), impedendo la degradazione dell mrna. 32
Controllo dell espressione genica: 3. Controllo traduzionale 33
La traduzione di mrnas è regolata da specifiche RNA-binding proteins! Regolazione Fe-dipendente della traduzione dell mrna della ferritina!! +Fe -Fe La proteina che si lega alle sequenze IRE (IRE-BP) inibisce la produzione della catena pesante della ferritina legandosi agli elementi di risposta al ferro (IRE) che si trovano nelle regioni non tradotte al 5 (5 UTR). Controllo dell espressione genica: 4. Controllo post-traduzionale: Concentrazione della proteina Proteina afva o inafva 34
Modificazioni dei singoli aa Fosforilazione gruppi ossidrilici di Ser, Thr e Tyr Carbossilazione gruppi carbossilici possono essere aggiun, a Asp e Glu (es. protrombina) Me,lazione gruppi me,lici possono essere aggiun, a Lys e Glu (es. istoni) Ace,lazione (es. istoni) Proteina afva o inafva 35
Esistono molteplici livelli di regolazione dell espressione genica negli eucarioti NUCLEO controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi responsivi di geni inducibili Genoma Meccanismi epigenetici: controllo a lungo e corto raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina Trascritto primario (precursore) mrna controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polya alternativo, CITOPLASMA controllo traduzionale traduzione mrna controllo del trasporto controllo della stabilità degradazione PROTEINA controllo post-traduzionale PROTEINA attiva o inattiva 36