LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI

LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI AVVERTENZE Queste pagine sono state realizzate per fornire agli studenti uno strumento utile a comprendere in maniera più proficua gli argomenti di analisi microbiologica degli alimenti trattati durante le lezioni formali e le esercitazioni di laboratorio di microbiologia. Si tratta pertanto di una guida in cui sono riportate attività interattive ed esperimenti da svolgere, sotto la guida del docente, durante le esercitazioni di laboratorio. Tali attività pratiche saranno più proficue per quegli studenti che partecipano attivamente alle lezioni teoriche e alle relative esercitazioni in laboratorio. Nel primo capitolo sono riportate informazioni importanti sulla sicurezza nel laboratorio di microbiologia. Si raccomanda di leggere attentamente queste norme e rispettarle scrupolosamente. Nel manuale sono descritte procedure, metodi e substrati nutritivi. Talvolta si tratta solo di esempi adattati alla specifica realtà delle esercitazioni e quindi non necessariamente vanno utilizzati al di fuori di questo contesto nel modo in cui sono descritti. Nel caso di metodi analitici prescritti da normative nazionali o comunitarie, le procedure analitiche proposte in questo manuale potranno costituire un utile base di principi e criteri generali. Va ricordato inoltre che ogni riferimento a substrati, reagenti e Kit diagnostici è solo a titolo di esempio e non esclude l impiego di altri materiali che potrebbero essere adatti e che non sono qui citati. Sicuri di aver commesso errori, ringraziamo in anticipo tutti coloro che avranno la pazienza di segnalarceli. Indice degli argomenti Lezione n. 25 (LAB 1) La sicurezza nel laboratorio di microbiologia e l analisi microbiologica degli alimenti. Campionamento: considerazioni ecologiche e raccolta del campione. Lezione n. 26 (LAB 2) Criteri microbiologici e piani di campionamento. Lezione n. 27 (LAB 3) Principali terreni nutritivi e diluenti usati per l analisi microbiologica degli alimenti. Lezione n. 28 (LAB 4) Preparazione del campione per l analisi e conteggio standard di cellule vitali su piastra (Standard Plate Counts). Preparazione delle diluizioni decimali seriali; Tecniche di semina delle piastre; Condizioni di Lezione n. 29 (LAB 5) incubazione delle piastre; Numerazione delle colonie in piastra Considerazioni sui limiti di rilevamento del conteggio in piastra. Lezione n. 30 (LAB 6) Conteggio in terreno liquido: tecnica MPN (Most Probable Number). Numerazione di popolazioni microbiche specifiche degli alimenti: Microrganismi Aerobi Totali; Lezione n. 31 (LAB 7) Famiglia delle Enterobacteriaceae; Coliformi; Streptococchi fecali (enterococchi); Clostridi solfito riduttori. Lezione n. 32 (LAB 8) Principi di microbiologia selettiva e differenziale e fasi per la ricerca di batteri patogeni negli alimenti. Lezione n. 33 (LAB 9) Cenni sui metodi di identificazione dei microrganismi Lezione n. 34 (LAB 10) Schemi generali delle operazioni di laboratorio Lezione n. 35 (LAB 11) Numerazione dei microrganismi aerobi mesofili totali e delle Enterobacteriaceae in vegetali di IV gamma. Lezione n. 36 (LAB 12) Numerazione di coliformi e di Escherichia coli in carne macinata. Lezione n. 37 (LAB 13) Numerazione di coliformi in latte pastorizzato con il metodo MPN. Lezione n. 38 (LAB 14) Numerazione di coliformi totali, coliformi fecali e streptococchi fecali in acqua destinata al consumo umano. Lezione n. 39 (LAB 15) Numerazione di clostridi solfito-riduttori e della microflora totale in acqua destinata al consumo umano. Lezione n. 40 (LAB 16) Controllo microbiologico delle superfici e delle mani. Controllo microbiologico dell aria e degli ambienti di produzione degli alimenti 1

LAB 1 - Lettura 25. La sicurezza nel laboratorio di microbiologia e l analisi microbiologica degli alimenti La sicurezza nel laboratorio di microbiologia La sicurezza degli ambienti di lavoro deve rappresentare un obiettivo fondamentale per garantire la salute umana. Tra i diversi luoghi di lavoro, nei laboratori didattici o di ricerca, numerose possono essere le possibilità di infortuni come conseguenza della molteplicità delle operazioni che vi si compiono e delle apparecchiature, sostanze e agenti pericolosi usati. Risulta pertanto di fondamentale importanza conoscere in maniera dettagliata tutto ciò che è oggetto del proprio lavoro (apparecchiature, operazioni da compiere, organismi e sostanze da manipolare ecc.), dei possibili pericoli che lo caratterizzano e delle relative norme messe in atto per evitarli o prevenirli. In particolare, nei laboratori di microbiologia, le persone coinvolte nelle varie operazioni possono essere esposte ad una serie di pericoli microbiologici le cui probabilità di comparsa (rischio) e le conseguenze per la salute (gravità del rischio) sono strettamente dipendenti dal tipo di organismo manipolato. Pertanto, è buona norma, al fine di garantire la sicurezza degli operatori, condurre, per ogni microrganismo e per le operazioni correlate alla sua manipolazione, un analisi del rischio, in maniera da stabilire le procedure di corretta prassi da adottare. Di norma, le tecniche e le attività che si svolgono nel laboratorio didattico di microbiologia degli alimenti e i microrganismi che si manipolano, suggeriscono la presenza di rischio limitato allorquando tutte le operazioni sono condotte secondo buone pratiche di laboratorio. E dunque essenziale che tutte le norme siano rigorosamente rispettate in ogni passaggio quando si lavora con microrganismi. Di seguito sono descritte alcune norme e regole basilari di comportamento nel laboratorio di microbiologia: Considerare il laboratorio come un ambiente in cui si è esposti a pericoli di varia natura: è dunque importante esibire comportamenti ispirati dalla consapevolezza del lavoro da svolgere. Una buona organizzazione, un approccio disciplinato, attenzione e buon senso assicurano che ogni operazione e attività siano svolte in sicurezza e con successo. Una volta nel laboratorio di microbiologia: Seguire sempre le istruzioni dell istruttore o del docente; Prima di compiere qualsiasi operazione o utilizzare qualsiasi strumentazione chiedere sempre istruzioni; Non depositare sui banchi di lavoro oggetti personali (vestiario, borse, libri); Indossare e abbottonare il camice; Lavarsi le mani; Non conservare o consumare alimenti e bevande; Non fumare; Munirsi di dispositivi di protezione personale come guanti, occhiali, mascherine e altri quando particolari operazioni lo richiedono; Ponete particolare attenzione nell'uso di gas, della fiamma del becco Bunsen (proteggere, raccogliendoli, i capelli lunghi per evitare il rischio di bruciarli) e degli apparecchi elettrici; Segnalate agli istruttori qualsiasi malfunzionamento o situazione non comune; Nessuna procedura microbiologica deve essere applicata senza aver ricevuto appropriate istruzioni e dimostrazioni dal personale istruttivo; Per minimizzare le possibilità di contaminazione degli operatori e dell ambiente le coltura microbiche vanno maneggiate secondo Buone Norme di Laboratorio e quindi considerate come se fossero patogene; Trasportare le provette contenenti microrganismi sempre nell apposito portaprovette; Non pipettare a bocca colture di microrganismi (salvo specifica indicazione); 2

Al termine di ogni sessione di lavoro pulire i banchi di lavoro con una soluzione disinfettante (alcol denaturato o altra soluzione disinfettante messa a disposizione); Non asportate nessun materiale dal laboratorio (soluzioni, vetreria, piastre, pipette, colture batteriche etc.); Seguite le istruzioni che vi saranno fornite al termine della sessione di lavoro per eliminare qualsiasi materiale di scarto. Il materiale biologico deve essere smaltito in appositi contenitori; Lavatevi accuratamente le mani prima di lasciare il laboratorio. L analisi microbiologica degli alimenti Introduzione L analisi microbiologica degli alimenti, cioè la determinazione del numero e/o della presenza di specifiche popolazioni microbiche e/o di uno specifico microrganismo e/o di specifici metaboliti microbici (enzimi, tossine), è una disciplina scientifica abbastanza recente. Le prime analisi di prodotti lattiero-caseari risalgono al 1930, mentre quelle relative al controllo dei molluschi al 1940. A partire dal 1950 incomincia a crescere l interesse analitico per tutti gli altri alimenti. L'analisi microbiologica degli alimenti trova la sua maggiore efficacia quando è intesa e utilizzata come strumento di supporto alla implementazione di sistemi di gestione della qualità e sicurezza microbiologica degli alimenti (come ad esempio l analisi dei pericoli e dei punti critici di controllo -HACCP ) e alla verifica della loro efficacia. Quando il controllo microbiologico degli alimenti è retrospettivo, cioè basato sul prelievo di un campione di alimento pronto per il consumo e sua analisi per la presenza di microrganismi patogeni, alterativi o marker, esso assume il carattere di una ispezione e quindi è inappropriato per principio. L ispezione, infatti, consente di misurare un effetto senza però identificare il meccanismo che lo ha generato. Allo stesso modo di come la misura della temperatura o della pressione di un paziente non consente di controllare la febbre o l ipertensione. Il controllo microbiologico degli alimenti dovrebbe essere orientato a: i) valutare le reali condizioni igieniche di produzione di un alimento al fine di identificare le fasi del processo in corrispondenza delle quali si verificano i rischi maggiori di contaminazione da parte di microrganismi pericolosi, di una loro sopravvivenza o di una loro incontrollata proliferazione; i risultati forniranno indicazioni utili per l'implementazione del sistema HACCP per la specifica realtà produttiva; ii) analisi dei prodotti finiti a conferma e verifica dell'efficacia del sistema HACCP implementato e per stabilire se le norme di buona fabbricazione, di conservazione e di distribuzione sono state strettamente seguite. Il piano dei controlli microbiologici va definito preventivamente. Esso deve essere strutturato in modo tale che anche minime variazioni all interno di un lotto (quantità di prodotto ben definita) di un singolo prodotto possano essere facilmente rilevate, consentendo di apportare le dovute correzioni prima che esso venga immesso sul mercato. E necessario stabilire la frequenza e il tipo di analisi in funzione degli obblighi legislativi, della tipologia e quantità dei prodotti e della storia analitica. I controlli microbiologici, secondo le finalità perseguibili, devono riguardare le materie prime, gli intermedi di lavorazione, i coadiuvanti tecnologici, il personale gli ambienti di trasformazione e il prodotto finito. La domanda dell analisi microbiologica di un campione alimentare La maggior parte dei controlli di qualità sono fatti o richiesti dal produttore, il cui interesse è quello di dimostrare al compratore la qualità del suo prodotto. In ogni modo, l analisi microbiologica di un campione alimentare è richiesta per diversi motivi, tra i quali ricordiamo: la verifica dell efficacia dei sistemi di garanzia della qualità e della sicurezza implementati; per provare a livello internazionale la buona qualità microbiologica del prodotto; 3

quando un alimento è sospettato di essere stato causa di malattia alimentare; per l identificazione dei pericoli potenziali durante le fasi di un processo produttivo; per l identificazione dei Punti Critici di Controllo; per stabilire la shelf life di un prodotto ai fini dell etichettatura (data di scadenza). Il tipo di indagine microbiologica da condurre su un determinato campione alimentare può riguardare: a) la determinazione del numero di specifiche popolazioni microbiche (Microrganismi totali «aerobi, anaerobi, microaerofili, sporigeni, non sporigeni, psicrotrofici, mesofili, termofili»; Lieviti e Muffe; Enterobacteriaceae; Coliformi; Batteri lattici; Micrococcaceae, ecc.); b) la determinazione del numero di specifici microrganismi (protecnologici, probiotici, patogeni, alterativi); c) la determinazione della presenza o assenza (ricerca) di specifici microrganismi patogeni veicolati dagli alimenti; d) la ricerca di determinati metaboliti prodotti dai microrganismi (enzimi, tossine). Nell analisi microbiologica di un alimento si devono prendere in considerazione diversi punti: il piano di campionamento e i criteri microbiologici; il prelievo e trasporto dei campioni in laboratorio; la scelta dei metodi analitici per il rivelamento, la numerazione e l identificazione di specifici microrganismi o di gruppi di microrganismi e delle loro tossine. Questi aspetti saranno trattati in dettaglio nei prossimi paragrafi. Campionamento: considerazioni ecologiche e principi A differenza dell analisi chimica degli alimenti, in cui le sostanze chimiche dannose sono il più delle volte distribuite uniformemente e, nella maggioranza dei casi, la loro concentrazione rimane più o meno costante nel tempo, l analisi microbiologica di un alimento deve tener conto dell ecologia microbica dello stesso. Infatti, la distribuzione dei microrganismi negli alimenti è imprevedibile e nella maggioranza dei casi essi sono distribuiti in maniera casuale, con stratificazioni microscopiche e spaziali. Inoltre, la microflora di un alimento presenta un carattere dinamico, potendo aumentare o diminuire di numero durante le varie fasi di un processo produttivo in funzione delle condizioni ecologiche che si realizzano. Queste considerazioni richiedono una scelta adeguata del piano di campionamento. Ogni campione preso per l analisi può essere considerato come una perdita per il produttore. In alcuni casi, l intera unità da cui è prelevato il campione da sottoporre ad analisi (ad es: da una bottiglia sigillata o da una confezione sigillata) è in pericolo di andare incontro ad alterazione. Per questa ragione e per motivi di igiene l intera unità va scartata dopo il prelivo (ovvero non deve immessa in commercio o consumata). Per minimizzare le perdite, solo la porzione più piccola possibile è presa come campione. Se una particolare proprietà dell alimento varia all interno dell alimento nella sua interezza, ogni conclusione rispetto a quella proprietà é di limitato valore se essa é basata su un campione piccolo; inoltre, prendere delle decisioni sulla base di tali conclusioni potrebbe comportare considerevoli rischi sullo stato di sicurezza del prodotto. In ogni modo incertezza e rischio sono inevitabili nel liberare un lotto (cioè definirlo accettabile) sulla base di test a campione. Raccolta del campione Il campione deve essere costituito da uno specificato numero di unità campionarie (in genere 5; vedi piani di campionamento per la definizione di unità campionaria) prelevate a random da ogni lotto di prodotto. Ogni unità campionaria dovrebbe consistere di almeno 100 g o ml e, in ogni caso, dovrebbe essere in quantità tale da rispettare i criteri stabiliti nel piano. Quando è possibile, prelevare sempre campioni da contenitori perfettamente sigillati. Se il prodotto da analizzare è costituito da grosse masse, prelevare diverse sottounità che andranno a costituire l unità campionaria finale. Le unità campionarie totali non devono provenire dallo stesso contenitore della massa del campione, ma da contenitori diversi. I campioni di alimento vanno raccolti in contenitori sterili, avendo cura di adottare tutte le precauzioni di asepsi per evitare contaminazioni. Inoltre, i campioni vanno conservati e 4

trasportati in condizioni refrigerate (0-4 C) o allo stato congelato, in funzione della natura del prodotto. In alcuni casi, la legislazione nazionale e comunitaria fornisce indicazioni specifiche sulle modalità operative da seguire per il campionamento di alimenti da analizzare da un punto di vista microbiologico. Alcune di queste normative sono: O.M. 11.10.1978 riguardante i Limiti di cariche microbiche tollerabili in determinate sostanze alimentari e bevande (G.U. n. 346 del 13.12.1978); Decisione 471/2001 CE riguardante i controlli generali delle condizioni igieniche di produzione delle carni fresche; Circolare Ministero della Sanità del 28/08/2002 riguardante la ricerca di L. monocytogenes in prosciutti crudi stagionati; Regolamento (CE) n. 2073/2005 della Commissione, del 15 novembre 2005, sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari. Nel capitolo 3.1 dell allegato 1 al Regolamento sono riportate Norme generali per il campionamento e la preparazione dei campioni da analizzare. In assenza di norme più specifiche in materia di campionamento e di preparazione dei campioni da analizzare, si utilizzano come metodi di riferimento le norme pertinenti dell ISO (International Organisation for Standardization) e gli orientamenti del Codex alimentarius. Nel capitolo 3.2 sono invece riportate le norme specifiche per il Campionamento batteriologico nei macelli e nei luoghi di produzione di carne macinata e preparazioni a base di carne. Tali norme riguardano il di campionamento per le carcasse di bovini, suini, ovini, caprini ed equini e di pollame. Ulteriori letture Villani F. (2007) Microbiologia degli alimenti e Laboratorio di Microbiologia degli Alimenti. http://wpage.unina.it/villani. Galli Volonterio A. (2005) Microbiologia degli alimenti. Casa Editrice Ambrosiana, Milano. Bell C., Neaves P., Williams A. P. (2005) Food Microbiology And Laboratory Practice. Blackwell Sciente, Uk. Jay J.M., Loessner M.J., Golden D.A. (2005) Modern food microbiology. Springer, USA. Mossel D.A.A., Corry J.E.L., Struijk C.B., Baird R.M. (1995) Essentials Of The Microbiology Of Foods. A Text Book For Advanced Studies. John Wiley And Sons. Chichester, U.K. Ray B. (2004) Fundamental of food microbiology. CRC PRESS, London. Roberts D., Hooper W., Greenwood M. (1995) Practical Food Microbiology. Phls, London. 5