VII Indice Prefazione XII Capitolo 1 Introduzione alle metodologie biochimiche 1 (Martino Luigi Di Salvo, Roberto Contestabile) 1.1 La Biochimica, una scienza sperimentale 1 1.2 Come si progetta, si esegue e si interpreta un esperimento 2 1.3 Internet e la bioinformatica nella ricerca biochimica 9 Capitolo 2 Lavorare in laboratorio 11 (Maria Teresa Carrì) 2.1 Strumentazione di base 11 2.1.1 Vetreria di laboratorio e materiale monouso 11 2.1.2 Bilance 14 2.1.3 Sistemi agitatori 15 2.1.4 Sistemi termostatati 15 2.1.5 ph-metri 17 2.1.6 Cappe 18 2.1.7 Centrifughe 19 2.2 Le sane pratiche di laboratorio 26 2.2.1 La normativa vigente 26 2.2.2 La formazione 28 2.2.3 La prevenzione 29 2.2.4 Uso di cancerogeni e mutageni 32 2.2.5 Uso di radioisotopi o di sorgenti di radiazioni ionizzanti 32 Scheda di approfondimento 2.1 34 De morbis artificum diatriba 2.3 Come si prepara una soluzione 34
VIII 2.3.1 Soluzioni 34 2.3.2 Soluzioni stock e diluizioni 36 2.3.3 Controllo del ph delle soluzioni 38 Scheda di approfondimento 2.2 25 I tamponi del signor Good Scheda di approfondimento 2.3 39 Ancora soluzioni! Esercizi 48 Capitolo 3 Metodologie per la produzione delle proteine ricombinanti 53 (Francesco Giansanti, Giuseppina Pitari, Maria Carmela Bonaccorsi di Patti, Rodolfo Ippoliti) 3.1 Strategie di clonaggio di sequenze codificanti 54 3.1.1 Clonaggio di sequenza nota 54 3.1.2 Clonaggio di sequenza ignota 57 3.2 Sistemi per l espressione delle proteine ricombinanti 59 3.2.1 Batteri 61 3.2.2 Lieviti 64 3.2.3 Cellule di mammifero 67 3.2.4 Cellule d insetto 70 3.3 Proteine di fusione 71 3.3.1 Tipo e funzionamento dei tag 73 3.4 Mutagenesi di sequenze codificanti 75 3.4.1 Mutagenesi sito-specifica 76 3.4.2 Mutagenesi casuale 81 Scheda di approfondimento 3.1 84 Un esempio di esperimento di mutagenesi sito-specifica: la storia della famiglia delle GFP Capitolo 4 Metodologie per la purificazione delle proteine: tecniche di separazione 87 (Roberto Contestabile, Martino Luigi Di Salvo, Margherita Eufemi) 4.1 Estrazione delle proteine dalla fonte biologica 88 4.1.1 Rottura delle cellule e omogeneizzazione dei tessuti 89 4.1.2 Separazione di organelli o componenti subcellulari 92
IX 4.2 Metodi di frazionamento di miscele proteiche 93 4.2.1 Tecniche di centrifugazione 94 4.2.2 Metodi di precipitazione delle proteine 97 4.3 Cromatografia 101 4.3.1 Cromatografia a esclusione molecolare o gel-filtrazione 104 4.3.2 Cromatografia a scambio ionico 109 4.3.3 Cromatografia di affinità 113 4.3.4 Cromatografia di ripartizione 116 4.3.5 Cromatografia di adsorbimento 118 4.3.6 Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) 120 Scheda di approfondimento 4.1 123 La separazione magnetica (Dynabeads ) Capitolo5 Metodologie per la purificazione delle proteine: tecniche di analisi 125 (Maria Teresa Carrì) 5.1 Elettroforesi 125 5.1.1 Elettroforesi di proteine 129 5.1.2 Elettroforesi di acidi nucleici 139 5.2 Dosaggi quantitativi 142 5.2.1 Metodi spettrofotometrici 142 5.2.2 Metodi radioisotopici 146 5.3 Tecniche immunochimiche 149 5.3.1 Anticorpi 149 5.3.2 Western blot 152 5.3.3 ELISA e RIA 153 5.3.4. Immunoprecipitazione 156 Scheda di approfondimento 5.1 158 Orientarsi nel mondo delle macromolecole: le metodologie dei punti cardinali Scheda di approfondimento 5.2 159 La citofluorimetria a flusso Capitolo 6 Esempi di purificazione di proteine 161 (Maria Carmela Bonaccorsi di Patti) 6.1 Purificazione della DNA polimerasi di Thermus aquaticus 164
X 6.1.1 Purificazione da Thermus aquaticus 165 6.1.2. Purificazione da Escherichia coli 167 6.1.3 Purificazione con His-tag da Escherichia coli 169 6.2 Purificazione di una proteina di membrana, il trasportatore della serotonina 170 6.2.1 Detergenti: proprietà e utilizzo 171 6.2.2 Purificazione da cervello umano 173 6.2.3 Purificazione da cellule di mammifero HEK293-TetOn 174 Capitolo 7 Metodi spettroscopici per lo studio delle proteine 177 (Fabio Altieri, Maria Carmela Bonaccorsi di Patti) 7.1 Spettroscopia di assorbimento UV-VIS 182 7.1.1 La legge di Lambert e Beer 182 7.1.2 Strumentazione 183 7.1.3 Cromofori delle proteine 188 7.1.4 Applicazioni 191 7.2 Spettroscopia di fluorescenza 193 7.2.1 Principi teorici 193 7.2.2 Aspetti quantitativi 195 7.2.3 Strumentazione 196 7.2.4 Fluorofori 198 7.2.5 Applicazioni 201 7.3 Spettroscopia a luce polarizzata 206 7.3.1 Principi teorici 207 7.3.2 Dicroismo circolare 209 7.3.3 Applicazioni del dicroismo circolare 210 Scheda di approfondimento 7.1 215 Proteine fluorescenti: una tavolozza di colori a disposizione dei ricercatori Scheda di approfondimento 7.2 218 La Real-Time PCR Capitolo 8 La cinetica enzimatica nello studio del meccanismo di reazione 221 (Giovanni Antonini) 8.1 Come funziona un enzima 221 8.1.1 L energia di attivazione e la teoria dello stato di transizione 222
XI 8.1.2 Classificazione degli enzimi 222 8.2 Cinetica enzimatica allo stato stazionario 223 8.2.1 La cinetica in stato stazionario e l equazione di Michaelis-Menten 223 8.2.2 Il significato di K m, V max, k cat e del rapporto k cat /K m 225 8.3 Valutazione sperimentale della cinetica allo stato stazionario 226 8.3.1 La velocità iniziale e i limiti strumentali 226 8.3.2 Il grafico di Lineweaver-Burk 232 8.3.3 I metodi lineari e la minimizzazione non lineare a confronto 232 8.3.4 Cinetiche enzimatiche con più di un substrato 235 8.4 L inibizione enzimatica 237 8.4.1 L inibizione enzimatica: competitiva, non competitiva, incompetitiva e mista 237 8.4.2 La regolazione allosterica e l attivazione enzimatica 245 Scheda di approfondimento 8.1 248 L utilizzo industriale degli enzimi Scheda di approfondimento 8.2 250 Un esempio dell uso della cinetica enzimatica per dosare enzimi o substrati: i biosensori Scheda di approfondimento 8.3 252 L importanza farmacologica degli inibitori enzimatici Capitolo 9 Metodi biochimici nell analisi delle interazioni molecolari 255 (Roberto Contestabile, Martino Luigi Di Salvo) 9.1 Analisi teorica degli equilibri di legame: equazioni e grafici 255 9.1.1 Il legame a un unico sito 255 9.1.2 Il legame a siti multipli 262 9.1.3 La competizione di legame 269 9.1.4 Il legame non specifico 271 9.1.5 La cinetica di legame 272 9.2 Analisi sperimentale degli equilibri di legame 272 9.2.1 Metodi spettroscopici 273 9.2.2 Metodi basati sulla separazione molecolare 274 9.2.3 Risonanza plasmonica di superficie 277 9.3 Metodi per l analisi delle interazioni proteina-proteina 278 Scheda di approfondimento 9.1 286 Un equilibrio di legame vitale come l aria che respiriamo Indice analitico 291