PROPOSTE DI LINEE GUIDA PER LA DIAGNOSI DELLE EPIDERMOLISI BOLLOSE EREDITARIE

PROPOSTE DI LINEE GUIDA PER LA DIAGNOSI DELLE EPIDERMOLISI BOLLOSE EREDITARIE Gruppo di lavoro Marina Colombi, (genetista molecolare) Sezione di Biologia e Genetica, Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologie, Università di Brescia Daniele Castiglia, (biologo molecolare) Laboratorio di Biologia Molecolare e Cellulare, Istituto Dermopatico dell Immacolata, Roma Rita Gardella, (genetista molecolare) Sezione di Biologia e Genetica, Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologie, Università di Brescia Gianluca Tadini, (dermatologo) Clinica Dermatologica, Policlinico, Milano Ernesto Bonifazi, (dermatologo, esperto in dermatologia pediatrica) Clinica Dermatologica, Università di Bari Corrado Angelo, (dermatologo, esperto in dermatologia pediatrica) Istituto Dermopatico dell Immacolata, Roma Eleonora Marchina, (medico genetista) Sezione di Biologia e Genetica, Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologie, Università di Brescia May El Hachem, (dermatologa, esperta in dermatologia pediatrica) Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Roma Umberto Bertazzoni, (biologo molecolare ed esperto in bioetica) Sezione di Biologia Genetica, Dipartimento Materno Infantile e di Biologia-Genetica, Università di Verona Giovanna Zambruno, (dermatologa ed esperta in biologia degli epiteli) Laboratorio di Biologia Molecolare e Cellulare, Istituto Dermopatico dell Immacolata, Roma Gruppo di consulenti Sergio Barlati, Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologie, Università di Brescia Paolo Cattorini, Dipartimento di Medicina e Sanità Pubblica, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università dell'insubria, Varese Ruggero Caputo, Clinica Dermatologica, Policlinico, Milano Carlo Corchia, Dipartimento di Neonatologia Medica e Chirurgica Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Roma Bruno Dallapiccola, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologia, Università La Sapienza, Istituto CSS-Mendel, Roma 1

Alberto Giannetti, Clinica Dermatologica, Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche, Università di Modena e Reggio Emilia Luigi D. Notarangelo, Clinica Pediatrica, Dipartimento Materno Infantile, Università di Brescia Firmino F. Rubaltelli, Dipartimento di Terapia Invasiva Neonatale, Azienda Ospedaliera Careggi, Università degli Studi di Firenze. 2

ARGOMENTO E OBIETTIVO DELLE LINEE GUIDA Le Epidermolisi Bollose (EB) sono un gruppo eterogeneo di malattie genetiche ereditarie rare della cute (genodermatosi) caratterizzate da fragilità della cute e delle mucose e dalla formazione di bolle (1,2). Le EB sono patologie mendeliane, trasmesse con modalità autosomica dominante o recessiva. La loro prevalenza nella popolazione è stata stimata in 1:130.000 negli Stati Uniti (3), 1:82.000 in Italia (4), 1:20.000 in Scozia (5). Sono malattie invalidanti; la maggior parte dei pazienti presenta quadri clinici molto gravi, talvolta anche letali. I progressi della genetica molecolare hanno permesso di identificare 10 geni correlati alle EB, ne hanno modificato l approccio diagnostico e hanno aperto nuove prospettive terapeutiche. Queste linee-guida (LG) riassumono le informazioni utili a razionalizzare la diagnosi delle EB, con particolare riguardo all uso delle indagini molecolari, anche al fine di evitare esami inutili e dispendiosi. Pertanto le LG si propongono di chiarire: (a) quando e come le analisi debbano essere richieste nell iter diagnostico delle EB; (b) quali informazioni i test genetici siano in grado di fornire; (c) quali siano le metodiche disponibili e il loro grado di affidabilità. La necessità di definire LG diagnostiche per l'eb è dettata dalle seguenti ragioni: (a) le EB sono, insieme alle ittiosi, il principale gruppo di genodermatosi; (b) si associano a quadri clinici spesso gravi, fin dall esordio alla nascita, con peggioramento progressivo ed esito spesso letale; (c) nel periodo perinatale presentano quadri clinici spesso simili, a fronte di prognosi radicalmente differenti; (d) possono essere diagnosticate a livello genetico; (e) hanno un diverso iter diagnostico, in base alle specifiche alterazioni genetiche individuate. L iter diagnostico proposto prevede tre fasi: 1. valutazione clinica e anamnesi genetica familiare; 2. analisi immunopatologica e ultrastrutturale della cute; 3. indagini genetico-molecolari. Destinatari iniziali di queste linee guida sono i dermatologi, i neonatologi, i pediatri e i genetisti medici. 3

METODOLOGIA Queste LG si conformano ai principi generali contenuti nelle Linee guida italiane per i test genetici, Comitato Nazionale per la Biosicurezza e le Biotecnologie, Presidenza del Consiglio dei Ministri, 1998 e ai pertinenti articoli (9, 10, 30-33, 44) del Codice di Deontologia Medica. La procedura adottata per la stesura delle LG è la seguente: formazione di un Gruppo di Lavoro ad hoc (GdL), in occasione della riunione Protocolli diagnostici e terapeutici nelle Epidermolisi bollose (12/5/2002, Policlinico, Università di Bari), al quale hanno aderito esperti di diversa estrazione: dermatologi, genetisti, biologi molecolari, esperti in bioetica; revisione dei dati di letteratura, riunioni periodiche, discussione; stesura di un documento intermedio; parere su tale documento di un Gruppo di consulenti multidisciplinare individuato dal GdL: dermatologi leader di gruppi attivi nel campo della diagnostica delle epidermolisi bollose, esperti neonatologi e pediatri, esperti in genetica medica, esperti in bioetica; ritorno al GdL dei pareri forniti dal Gruppo dei consulenti ed elaborazione delle LG; richiesta di parere e approvazione delle LG da parte dei Consigli Direttivi della Società Italiana di Dermatologia medica, chirurgica, estetica e di Malattie Sessualmente Trasmesse (SIDeMaST), dell Associazione Dermatologi Ospedalieri Italiani (ADOI), della Società Italiana di Neonatologia (SIN), della Società Italiana di Genetica Umana (SIGU); presentazione delle LG all Istituto Superiore di Sanità. Il GdL resta operativo in previsione delle necessarie attività di divulgazione, implementazione, verifica e aggiornamento delle LG, avendo tra i compiti prioritari quello di stabilire relazioni organiche con gruppi e società scientifiche potenzialmente interessate. Le uniche LG sulle EB sono quelle recentemente proposte da un gruppo di studio giapponese per un'applicazione a livello nazionale; esse tuttavia fanno riferimento solo alle forme di EB giunzionali e distrofiche, sono prevalentemente orientate alla terapia e non approfondiscono gli aspetti diagnostici sia immunopatologici che molecolari (6). E disponibile inoltre una considerevole letteratura su casi isolati e vari lavori su casistiche, che sono state sistematicamente riviste. Per tutte le indicazioni fornite nelle presenti LG si è seguito il criterio della migliore evidenza possibile, secondo la letteratura internazionale. 4

CLASSIFICAZIONE Le Epidermolisi Bollose ereditarie (EB) sono un gruppo eterogeneo di malattie genetiche della cute e delle mucose, caratterizzate dalla formazione di bolle a seguito di traumi di varia entità e dovute a difetti dell adesione epitelio-mesenchimale. L eredità è mendeliana, autosomica dominante o recessiva. In base al livello di formazione delle lesioni bollose nella cute, si distinguono tre tipi di EB: le EB semplici o epidermolitiche (EBS), le EB giunzionali (EBG) e le EB distrofiche o dermolitiche (EBD) (1,2,7,8). All interno di ciascun tipo si osservano quadri clinici e genetici distinti. Questa trattazione fa riferimento all attuale classificazione formulata nel 2000 da un gruppo di studio internazionale comprendente i maggiori esperti del settore (9), classificazione che è stata integrata con i dati della letteratura disponibili. Per una trattazione specifica della giunzione dermo-epidermica, dei componenti proteici dei complessi di adesione epitelio-mesenchimale e della loro funzione si rimanda ad articoli di revisione (10,11). EPIDERMOLISI BOLLOSE SEMPLICI O EPIDERMOLITICHE (EBS) Le EBS sono caratterizzate dalla presenza di lesioni bollose prevalentemente cutanee, che risolvono senza esiti cicatriziali maggiori. Le EBS sono definite dalla presenza di lesioni bollose intraepidermiche che si formano per citolisi dei cheratinociti basali. Le EBS sono trasmesse con modalità autosomica dominante o recessiva e comprendono diverse varianti cliniche dovute a mutazioni nei geni KRT5, KRT14 e PLEC1 (Tabelle I e II). EBS di Weber-Cockayne (OMIM 131800), ad esordio tra il primo anno e la seconda decade di vita. E caratterizzata da lesioni bollose limitate alle mani e ai piedi e da frequente iperidrosi. E la forma più comune di EBS. E dovuta ad una mutazione autosomica dominante nei geni KRT5, che codifica per la cheratina 5, oppure KRT14, che codifica per la cheratina 14 (1, 2, 9, 12). EBS di Köbner (OMIM 131900), ad esordio connatale o perinatale, presenta lesioni preferenzialmente acroposte, ma che possono interessare tutta la superficie corporea, occasionali e modeste distrofie ungueali e lesioni della mucosa orale, frequente cheratodermia palmo-plantare, miglioramento del quadro clinico dopo la pubertà. E dovuta ad una mutazione autosomica dominante nei geni KRT5 e KRT14 (1, 2, 9, 12). EBS di Dowling-Meara (OMIM 131760), ad esordio alla nascita, è caratterizzata da lesioni cutanee diffuse con caratteristica distribuzione erpetiforme e lesioni del cavo orale e, raramente laringee, particolarmente gravi nel primo anno di vita, con progressivo miglioramento fino all età adulta; presenza di distrofie ungueali ipercheratosi palmo-plantare; frequente formazione di milia; occasionali 5

anomalie dentarie. E dovuta ad una mutazione autosomica dominante nei geni KRT5 e KRT14 (1, 2, 9, 12, 13). EBS con distrofia muscolare (OMIM 226670), poco frequente, è caratterizzata da lesioni bollose cutanee congenite generalizzate che possono risolvere con modesti esiti cicatriziali atrofici e milia; si associano lesioni della mucosa orale e, raramente, laringea e distrofie ungueali; possono essere presenti anomalie dello smalto e alopecia localizzata. La distrofia muscolare, che determina la prognosi, ha esordio tra il primo anno e la quarta decade di vita e presenta un decorso progressivo. E dovuta a mutazioni autosomiche recessive nel gene PLEC1 (14, 15). Varianti rare di EBS EBS con pigmentazione mottled (OMIM 131960), variante estremamente rara, con caratteristiche simili alla forma di Köbner e presenza di macule ipopigmentate e iperpigmentate. E dovuta ad una mutazione autosomica dominante nel gene KRT5 (16). EBS recessiva (OMIM 601001), variante molto rara, con modalità di presentazione clinica variabile, definita solo in base alla trasmissione autosomica recessiva (17-19). Il gene-malattia è KRT14. EBS di Ogna (OMIM 131950) variante estremamente rara, descritta originariamente in una piccola comunità norvegese, caratterizzata dalla formazione di bolle emorragiche e lesioni ecchimotiche. E dovuta ad una mutazione autosomica dominante. L'autonomia nosologica di questa EBS è confermata dalla presenza di una mutazione missenso nel gene PLEC1 (20). La rarissima variante EBS superficialis, descritta in due famiglie, è dovuta ad una mutazione nel gene COL7A1 che codifica per il collagene di tipo VII. Pertanto non si tratta di una variante autonoma, ma di una Epidermolisi Bollosa Distrofica dominante (21). E noto un solo caso di EB, definita semplice, con lesioni bollose prevalentemente acroposte, interessamento congiuntivale e ipoplasia dello smalto, dovuto a mutazione nel gene ITGB4, che codifica per l integrina β4, caratteristicamente mutata nella EB giunzionale con atresia pilorica (22). EPIDERMOLISI BOLLOSE GIUNZIONALI (EBG) Le EBG sono un gruppo clinicamente e geneticamente eterogeneo di malattie ad interessamento non solo cutaneo, ma anche mucoso. Le EBG sono definite dalla formazione di lesioni bollose tra l epidermide e il derma, a livello della lamina lucida della membrana basale, che guariscono con formazione di tessuto di granulazione ipertrofico e/o esiti atrofici. Le EBG originano da mutazioni trasmesse con modalità autosomica recessiva e comprendono diverse varianti cliniche dovute a mutazioni nei geni LAMA3, LAMB3, LAMC2, COL17A1, ITGB4 e ITGA6 (Tabelle I e II). EBG di Herlitz (OMIM 226700), ad esordio connatale, con lesioni bollose ed erosioni localizzate non solo all intera superficie cutanea, ma anche a tutte le mucose degli apparati digerente, respiratorio e 6

genito-urinario. La guarigione avviene con formazione di tessuto di granulazione ipertrofico; sono anche presenti alterazioni ungueali, dentarie e oculari. La prognosi è infausta, di solito entro il primo anno di vita, per complicanze infettive o secondarie al coinvolgimento mucoso. E dovuta a mutazioni autosomiche recessive nei geni LAMA3, LAMB3, LAMC2, che codificano rispettivamente per le tre catene della laminina 5: α3, β3, γ2 (1, 2, 9, 23). EBG non Herlitz (OMIM 226650), ad esordio connatale, presenta uno spettro di alterazioni cliniche simili a quelle dell EBG di Herlitz, ma di minore gravità e quindi compatibili con la vita. Le lesioni bollose cutanee guariscono con formazione di tessuto di granulazione ipertrofico e/o esiti cicatriziali atrofico-discromici. Sono costanti, anche se di entità variabile, le lesioni mucose (orale, nasale, oculare, genitale). Sono anche presenti distrofie ungueali e dentarie con ipoplasia dello smalto. E frequente l alopecia da atrofia follicolare, evidente già nell adolescenza, che interessa il cuoio capelluto e, in vario grado, i peli terminali. E possibile l insorgenza di carcinomi squamocellulari. E dovuta a mutazioni autosomiche recessive nei geni COL17A1, che codifica per il collagene di tipo XVII, e LAMA3, LAMB3, LAMC2 (1, 2, 9, 23, 24). E noto un singolo caso da mutazione nel gene ITGB4, che codifica per la subunità β4 delle integrine, caratteristicamente mutato nelle EBG con atresia pilorica (25). EBG con atresia pilorica (EBG-AP) (OMIM 226730), di solito ad esordio connatale, con estese lesioni cutanee e mucose; si distingue per la costante associazione con un ostruzione congenita completa dello sbocco gastrico. La prognosi è nella maggioranza dei casi infausta entro il primo anno di vita, anche dopo correzione chirurgica dell atresia. La gravidanza dei feti con EBG-AP è spesso complicata da polidramnios. E relativamente frequente l associazione con l aplasia cutis congenita e con le lesioni mucose del tratto genito-urinario, con stenosi ureterali o uretrali. I casi non letali sono rari: le lesioni cutanee possono essere localizzate ed esordire solo nell infanzia, mentre l atresia pilorica è sempre congenita. E dovuta a mutazioni autosomiche recessive nei geni ITGA6 e ITGB4, che codificano per l integrina α6β4 (1, 2, 9, 26). Varianti rare di EBG: le varianti inversa e quella ad esordio tardivo sono estremamente rare e poco caratterizzate (27, 28). EPIDERMOLISI BOLLOSE DISTROFICHE O DERMOLITICHE (EBD) Le EBD si definiscono in base alla localizzazione delle lesioni bollose al di sotto della lamina densa della membrana basale cutanea nel derma papillare e per la loro lenta guarigione, con cicatrici retraenti e milia. Le EBD sono trasmesse con modalità autosomica recessiva o dominante e sono dovute a mutazioni nel gene COL7A1, che codifica per il collagene di tipo VII (29-32). Le EBD comprendono un ampio spettro di forme cliniche riassunte nella Tabella I. 7

EBD recessiva di Hallopeau-Siemens (OMIM 226600), ad esordio connatale, con lesioni bollose e ulcerazioni diffuse della cute e delle mucose rivestite da epitelio squamoso stratificato; si caratterizza per la gravità degli esiti cicatriziali retraenti (completa fusione delle dita delle mani e dei piedi, anchilosi in flessione degli arti e del capo, microstomia, anchiloglossia e obliterazione vestiboli orali, stenosi esofagea, ectropion e aderenze congiuntivali, ecc). Sono costanti la perdita delle lamine ungueali e le carie dentali multiple. Le complicanze più frequenti sono: ritardo di accrescimento staturoponderale, anemia multifattoriale, sovrainfezioni. A partire dalla terza decade di vita è pressoché costante la comparsa di carcinomi squamocellulari, che sono la causa più comune di morte. E trasmessa con modalità autosomica recessiva (1, 2, 9). EBD recessiva non Hallopeau-Siemens: viene distinta dalla forma di Hallopeau-Siemens per l assenza delle gravi deformità. Comprende uno spettro di forme cliniche, ad esordio connatale o perinatale, di gravità estremamente variabile, per entità del coinvolgimento cutaneo e mucoso. Può essere presente una aplasia cutis congenita. E trasmessa con modalità autosomica recessiva (1, 2, 9). EBD dominante (OMIM 131750), ad esordio connatale o perinatale, con lesioni bollose localizzate prevalentemente agli arti. Sono frequenti le cicatrici atrofiche a buccia d arancia ai gomiti, alle ginocchia e al dorso delle mani, mentre è occasionale la presenza di cicatrici albo-papuloidi. Sono inoltre presenti distrofie ungueali, modeste lesioni al cavo orale; è possibile, ma non frequente, l interessamento dell esofago. Può essere presente una aplasia cutis congenita. E trasmessa con modalità autosomica dominante (1, 2, 9). Varianti rare di EBD EBD Inversa (OMIM 226450), ad esordio connatale o perinatale, ha una distribuzione prevalente alle zone di piega; è trasmessa con modalità autosomica recessiva (32, 33). EBD pretibiale (OMIM 131850), ad esordio tra il primo anno e la seconda decade di vita, ha una tipica localizzazione limitata alla regione pretibiale con distrofie ungueali. E trasmessa con modalità autosomica dominante o recessiva (32, 34, 35). Dermolisi bollosa transitoria del neonato (OMIM 131705), è caratterizzata dalla regressione delle lesioni bollose entro il primo anno di vita. E trasmessa con modalità dominante o recessiva (36, 37). EBD pruriginosa (OMIM 604129), definita in base al prurito particolarmente intenso; è caratterizzata dalla formazione di lesioni papulo-nodulari lichenoidi prevalenti agli arti inferiori e da distrofie ungueali. E trasmessa con modalità dominante o recessiva (38). EBD centripeta, variante estremamente rara ad esordio connatale; è caratterizzata dalla distribuzione delle lesioni inizialmente acroposte con successiva estensione centripeta e distrofie ungueali. E trasmessa con modalità recessiva (9). 8

Tabella I. Classificazione delle epidermolisi bollose (EB) ereditarie. Variante clinica Ereditarietà Gene coinvolto EB semplici (EBS) EBS di Weber-Cockayne EBS di Köbner EBS di Dowling-Meara EBS con distrofia muscolare EBS, varianti rare EBS con pigmentazione mottled EBS recessiva EBS di Ogna AD AD AD AR AD AR AD KRT5/KRT14 KRT5/KRT14 KRT5/KRT14 PLEC1 KRT5 KRT14 PLEC1 EB giunzionali (EBG) EBG di Herlitz EBG non Herlitz EBG con atresia pilorica EBG, varianti rare EBG inversa EBG a esordio tardivo AR AR AR AR AR LAMA3/LAMB3/LAMC2 LAMA3/LAMB3/LAMC2/COL17A1/ITGB4 (1) ITGB4/ITGB6 LAMA3/LAMB3/LAMC2 NN (2) EB distrofiche (EBD) EBD recessiva di Hallopeau-Siemens EBD recessiva non Hallopeau-Siemens EBD dominante EBD, varianti rare EBD inversa EBD pretibiale Dermolisi bollosa transitoria del neonato EBD pruriginosa EBD centripeta AR AR AD AR AD o AR AD o AR AD o AR AR COL7A1 COL7A1 COL7A1 COL7A1 COL7A1 COL7A1 COL7A1 COL7A1 (3) (1) Descritto un singolo caso dovuto a mutazione di ITGB4; (2) NN, non noto; (3) COL7A1 è il gene candidato, ma non sono ancora state identificate mutazioni. 9

Tabella II. Caratteristiche dei geni alterati nelle EB. Tipo di EB Gene Cromosoma Dimensioni gene (kb) N esoni Dimensioni cdna (bp) Semplice KRT5 12q13 6 8 2164 KRT14 17q12-q21 4,5 8 1377 PLEC1 8q24 32 32 13722 Giunzionale LAMA3 18q11.2 90 38 5142 LAMB3 1q32 37,5 23 3518 LAMC2 1q25-q31 55 23 3581 ITGA6 2q24-q31 8 26 3221 ITGB4 17q25 36 41 5468 COL17A1 10q24.3 52 56 4493 Distrofica COL7A1 3p21.1 32 118 9300 DIAGNOSI DIFFERENZIALE La diagnosi differenziale delle EB ereditarie pone problemi diagnostici nel periodo neonatale, a causa della loro rarità. Una diagnosi precoce permette di instaurare tempestivamente terapie sintomatiche adeguate e misure preventive atte ad evitare l esposizione a traumatismi fisici, riducendo quindi la formazione di nuove lesioni bollose. Quasi tutte le EBG, le EBD e le forme più gravi di EBS si manifestano nelle prime ore di vita con lesioni bollose della cute e delle mucose. Le bolle cutanee sono ampie, distribuite simmetricamente nelle sedi sottoposte a traumi, perciò sui piedi (dita, dorso, calcagno), sulle mani, sulla superficie estensoria del gomito e delle ginocchia e sulle sedi di contatto con cerotti. Le bolle si rompono facilmente dando origine ad erosioni con orletti periferici scollati e croste. Nei primi giorni di vita la cute interposta alle bolle è caratteristicamente indenne da flogosi e apparentemente normale. Le bolle mucose interessano in genere le labbra e il cavo orale, a seguito del traumatismo indotto dalla suzione. Nel periodo perinatale, le EB pongono problemi di diagnosi differenziale con: 1. altre malattie genetiche ereditarie che esordiscono alla nascita, con possibile presenza di lesioni bollose [in particolare eritrodermia ittiosiforme bollosa congenita (OMIM 113800), ittiosi bollosa di Siemens (OMIM 146800), incontinentia pigmenti (OMIM 308310), ma anche la sindrome di Theresa Kindler (OMIM 173650), la porfiria eritropoietica congenita (OMIM 263700), la displasia ectodermica 10

da deficienza di placofilina (OMIM 604536), l acrodermatite enteropatica (OMIM 201100)], che possono essere distinte sulla base dell obiettività clinica e dei reperti istopatologici; 2. patologie bollose su base infettiva (in particolare piodermite bollosa stafilococcica, necrolisi epidermica combustiforme o sindrome delle 4 S - staphylococcal scalded skin syndrome - ma anche herpes simplex neonatale, varicella neonatale, pemfigo sifilitico), che sono differenziabili sulla base delle caratteristiche anamnestiche e cliniche e dei reperti istopatologici e laboratoristici; 3. malattie bollose autoimmuni che possono essere trasmesse passivamente attraverso la placenta (pemfigoide gestationis neonatale, pemfigo neonatale), nelle quali, ai fini diagnostici, sono dirimenti l'anamnesi e i reperti immunopatologici; 4. la mastocitosi bollosa e l aplasia cutis congenita, distinguibili in base ai reperti clinici e istopatologici; 5. lesioni bollose da cause fisiche e chimiche, in particolare ustioni da acqua calda o da soluzioni disinfettanti non diluite, nelle quali è dirimente l anamnesi (2, 9). Nell'infanzia, le forme di EB ad esordio postnatale possono richiedere, in rari casi, una diagnosi differenziale con le dermatosi bollose autoimmuni (dermatite bollosa a IgA lineari, pemfigo, pemfigoide bolloso e cicatriziale, epidermolisi bollosa acquisita), nelle quali l'immunopatologia è caratteristica, nonché con la "peeling skin syndrome" (OMIM 270300), la pachionichia congenita (OMIM 167200 e 167210) e la mastocitosi bollosa, facilmente distinguibili sulla base dei reperti istopatologici (Tabella III) (2, 9). Tabella III. Diagnosi differenziale delle epidermolisi bollose in epoca perinatale e nell infanzia Malattie genetiche ereditarie Malattie autoimmuni Eritrodermia ittiosiforme bollosa congenita Herpes gestationis neonatale Ittiosi bollosa di Siemens Pemfigo neonatale Incontinentia pigmenti Dermatite bollosa a IgA lineari Sindrome di Theresa Kindler Pemfigo Porfiria eritropoietica congenita Pemfigoide bolloso e cicatriziale Displasia ectodermica da deficienza di placofilina Epidermolisi bollosa acquisita Acrodermatite enteropatica Altre Pachionichia congenita Mastocitosi bollosa Peeling skin syndrome Aplasia cutis congenita Malattie infettive Lesioni bollose da cause fisiche e chimiche Piodermite bollosa stafilococcica Necrolisi epidermica combustiforme Herpes simplex neonatale Varicella neonatale Pemfigo sifilitico Un atlante che illustra la diagnosi differenziale delle EB è reperibile all indirizzo: http://www.dermatologiapediatrica.com/it/epidermolisibollosa.pdf 11

APPROCCIO DIAGNOSTICO Esame obiettivo e anamnesi personale Il primo dato importante è l accertamento degli elementi clinici (anamnesi personale e esame obiettivo) che possono orientare la diagnosi nell ambito delle EB ereditarie (EBS, EBG, EBD). A questo scopo viene proposto un modello di cartella clinica riferita specificamente al momento della diagnosi (Allegato 1). Ricerca della familiarità Il secondo dato importante è la raccolta dell'anamnesi familiare, per tentare di stabilire le modalità di trasmissione, attraverso la costruzione dell'albero genealogico che, fatta eccezione per i casi sporadici, evidenzia una trasmissione autosomica dominante o recessiva. Trasmissione autosomica dominante: quasi tutti i casi di EBS, una parte dei casi di EBD -EBS di Weber-Cockayne, OMIM 131800; -EBS di Köbner, OMIM 131900; -EBS di Dowling-Meara, OMIM 131760; -EBS con pigmentazione mottled, OMIM 131960 (rarissima); -EBD dominante, OMIM 131750; Trasmissione autosomica recessiva: tutte le EBG e la maggior parte dei casi di EBD -EBS recessiva, OMIM 601001 (rarissima); -EBS con distrofia muscolare, OMIM 226670; -EBG di Herlitz, OMIM 226700; -EBG non Herlitz, OMIM 226650; -EBG con atresia pilorica, OMIM 226730, -EBG inversa (rarissima); -EBG a esordio tardivo (rarissima); -EBD recessiva di Hallopeau-Siemens, OMIM 226600; -EBD recessiva non Hallopeau-Siemens; -EBD inversa, OMIM 226450; -EBD centripeta (rarissima); Trasmissione autosomica dominante o recessiva: alcune rare varianti di EBD -EBD pretibiale, OMIM 131850; -Dermolisi bollosa transitoria del neonato, OMIM 131705; -EBD pruriginosa, OMIM 604129. 12

I casi sporadici che originano da mutazioni de novo sono frequenti nelle forme dominanti di EBS e di EBD (15, 39-45), mentre sono rari, anche se descritti, nelle EBG (46-48). E noto almeno un caso di EBD dominante da mosaicismo germinale materno (45) e un caso di EBG recessiva di Herlitz nella quale una delle due mutazioni era trasmessa attraverso un mosaicismo germinale paterno (46). Tra i possibili meccanismi genetici che causano le EB deve essere compresa la rara disomia uniparentale (entrambe le mutazioni sono trasmesse dallo stesso genitore eterozigote), dimostrata in almeno tre pazienti affetti da EBG recessiva di Herlitz (49-51). La definizione delle modalità di trasmissione e del meccanismo genetico responsabile della EB, a volte rivelata solo dall analisi genetico-molecolare, è fondamentale per precisare il rischio di ricorrenza in fase di consulenza genetica, soprattutto nei casi sporadici. Indagini immunopatologiche e ultrastrutturali La definizione del tipo di EB e di proteina mutata viene effettuata con indagini immunopatologiche ed ultrastrutturali su biopsia cutanea prelevata dal margine di una lesione bollosa insorta da non più di 12 ore o, preferibilmente, da cute perilesionale preventivamente sottoposta a sfregamento, al fine di indurre la formazione di microdistacchi. Un prelievo bioptico idoneo rappresenta un requisito necessario per la diagnosi; infatti la presenza, in lesioni bollose non recenti, di estesi fenomeni di vacuolizzazione e necrosi cellulare o anche di una parziale riepitelizzazione non permette talora di determinare la localizzazione del distacco iniziale (1, 2). L analisi istopatologica consente di differenziare l EBS, che presenta un distacco intraepidermico, ma non ha un potere di risoluzione sufficiente a distinguere le EGB dalle EBD. Il prelievo bioptico finalizzato all esame istologico è quindi raccomandato per la diagnosi differenziale tra le EB e altre malattie, ma non è utile per la diagnosi del tipo e della variante di EB. Nell iter diagnostico delle EB possono essere teoricamente distinte due fasi: 1. definizione del tipo di EB e 2. definizione di singole varianti di EB caratterizzate da alterata espressione di specifiche componenti proteiche dei complessi di adesione epiteliali. Per la prima fase possono essere usate indifferentemente tecniche immunopatologiche o ultrastrutturali. Le tecniche di mappaggio antigenico in immunofluorescenza e l analisi ultrastrutturale in microscopia elettronica a trasmissione sono infatti equivalenti per definire il sito di clivaggio nella cute e quindi distinguere le EBS (clivaggio intraepidermico) dalle EBG (clivaggio nella lamina lucida della giunzione dermo-epidermica, GDE) e dalle EBD (clivaggio sotto la lamina densa della GDE) (Tabelle IV e V). L'indagine ultrastrutturale permette inoltre di evidenziare alterazioni morfologiche quantitative e/o qualitative delle strutture di adesione dermo-epidermiche: 1. aggregati di tonofilamenti nell'ebs di Dowling-Meara; 2. alterazioni nell inserzione dei tonofilamenti sugli emidesmosomi nell EBS con distrofia muscolare; 3. riduzione di numero e alterazioni strutturali degli emidesmosomi nelle EBG; 4. 13

riduzione di numero e alterazioni strutturali delle fibrille di ancoraggio in una parte dei casi di EBD (Tabella IV) (1, 52, 53). Per la seconda fase, l'uso di anticorpi policlonali o monoclonali specifici consente di distinguere singole varianti di EB caratterizzate da alterata espressione di componenti proteiche dei complessi di adesione epiteliali e, in particolare, di differenziare (Tabella V) (1, 2, 9,15, 17, 23, 26, 29, 32, 33, 35, 37, 48, 52): 1. L EBS recessiva da deficit di cheratina 14; 2. L EBS con distrofia muscolare (o EBS di Ogna) da deficit di plectina; 3. Le EBG di Herlitz e non Herlitz da deficit di laminina 5; 4. L EBG non Herlitz da deficit di BP180 (collagene di tipo XVII); 5. L EBG con atresia pilorica da deficit di integrina α6β4; 6. L EBD con alterata espressione di collagene di tipo VII. Questa seconda fase viene eseguita contemporaneamente al mappaggio antigenico ed è particolarmente rilevante ai fini di: 1. una precoce (periodo perinatale) e rapida definizione diagnostica di alcune varianti di EB, con implicazioni prognostiche importanti, 2. restringere il numero dei geni candidati su cui effettuare, se richiesta ed indicata, la successiva analisi genetico-molecolare. In base a questi dati, l analisi immunopatologica, eseguita su criosezioni con un adeguato pannello di anticorpi specifici, rappresenta la tecnica di elezione per la diagnosi delle EB in quanto permette, con un singolo prelievo bioptico, di determinare il tipo di EB e di identificare le diverse varianti. L indagine ultrastrutturale è un utile ausilio diagnostico, in quanto fornisce informazioni complementari sulla morfologia delle strutture di adesione epiteliale. E quindi consigliabile eseguire, ove possibile, in parallelo i due esami per una definizione completa delle caratteristiche della forma. La Tabella VII riassume l iter diagnostico che consente di definire le diverse varianti di EB e rappresenta un prerequisito per la successiva diagnosi genetico-molecolare, se indicata. Questo iter diagnostico è necessario per effettuare la diagnosi, in particolare, in epoca perinatale, quando il quadro clinico non consente di distinguere le forme di EB che comportano prognosi radicalmente differenti (ad esempio EBS di Dowling-Meara rispetto all EBG di Herlitz o non-herlitz o all EBD di Hallopeau- Siemens). Indagini strumentali A completamento dell iter diagnostico e dopo aver posto la diagnosi del tipo e variante di EB, è opportuno eseguire le seguenti indagini strumentali: 1. Esofagogramma (tutti i pazienti affetti da EBD), per valutare l esistenza e l entità dell interessamento esofageo; 2. Clisma opaco con doppio contrasto (pazienti affetti da EBD, sintomatici) per evidenziare un eventuale megacolon; 14

3. Urografia (pazienti affetti da EBG, sintomatici) per evidenziare eventuali stenosi ureterali; 4. Ecografia cardiaca (pazienti affetti da EBD, sintomatici) per un'eventuale miocardiopatia dilatativa. Tabella IV. Reperti ultrastrutturali nei diversi tipi di epidermolisi bollosa (EB) e in alcune varianti. Tipo o variante di EB Sito di clivaggio Altri reperti EB semplice (EBS) Citoplasma dei cheratinociti basali EBS di Weber-Cockayne e Citoplasma dei cheratinociti basali (subnucleare) - EBS di Köbner EBS di Dowling-Meara Citoplasma dei cheratinociti basali (subnucleare) Aggregati elettrondensi di tonofilamenti nei cheratinociti basali EBS con distrofia Citoplasma dei cheratinociti basali, subito sopra la Frequentemente diminuita inserzione muscolare placca citoplasmatica degli emidesmosomi dei tonofilamenti sugli emidesmosomi EB giunzionale (EBG) Lamina lucida EBG di Herlitz Lamina lucida Emidesmosomi ridotti di numero e rudimentali EBG non Herlitz Lamina lucida Emidesmosomi ridotti di numero e ipoplastici EBG con atresia pilorica Lamina lucida e, focalmente, cheratinociti basali Emidesmosomi ridotti di numero e subito sopra la placca citoplasmatica degli variamente ipoplastici emidesmosomi EB distrofica (EBD) Sub-lamina densa EBD recessiva di Sub-lamina densa Fibrille di ancoraggio assenti o quasi Hallopeau-Siemens EBD recessiva non Hallopeau-Siemens Sub-lamina densa Fibrille di ancoraggio ridotte di numero e di solito marcatamente ipoplastiche, in rarissimi casi normali EBD dominante Sub-lamina densa Fibrille di ancoraggio ridotte di numero Dermolisi bollosa transitoria del neonato Sub-lamina densa e variamente ipoplastiche o normali Inclusioni elettrondense nei cheratinociti basali, fibrille di ancoraggio diminuite e ipoplastiche Tabella V. Epidermolisi bollose (EB): localizzazione nelle aree di distacco della marcatura per proteine strutturali implicate nell adesione epitelio-mesenchimale. Tipo di EB Plectina BP230 Integrina α6β4 BP180 Laminina 5 Collagene IV Collagene VII EB semplice P* P P P P P P EB giunzionale T T T* o T/P T* o T/P P* P P EB distrofica T T T T T T T* o T/P* P, pavimento dell area di distacco, T, tetto dell area di distacco; * La marcatura può essere ridotta o assente (vedere Tabella VI). 15

Tabella VI. Espressione di proteine strutturali implicate nell adesione epitelio-mesenchimale nei diversi tipi e varianti di epidermolisi bollose (EB). Tipo e variante di EB K14 Plectina Laminina 5 Integrina BP180 Collagene VII α6β4 EB semplice (EBS) EBS di Weber-Cockayne N N N N N N EBS di Köbner N N N N N N EBS di Dowling-Meara N N N N N N EBS con distrofia muscolare N A o R N N N N EBS di Ogna EBS, autosomica recessiva A N N N N N EB giunzionale (EBG) EBG di Herlitz N N A N N N EBG non Herlitz N N N o R N* N o R o A N EBG con atresia pilorica N N N R o A N N EBG inversa N N R N N N EB distrofica (EBD) EBD recessiva (EBDR) Hallopeau-Siemens N N N N N A o R EBDR non Hallopeau-Siemens N N N N N N** o R EBD dominante N N N N N N** EBD pretibiale N N N N N N** EBD progressiva N N N N N N** EBD inversa N N N N N N o R Dermolisi bollosa transitoria del neonato N N N N N N*** N, marcatura di intensità normale; R, espressione ridotta; A, assente; * Descritto un caso di EBG non Herlitz da deficit di integrina α6β4; ** Spesso marcatura alterata (p. e. intracitoplasmatica nei cheratinociti basali o granulare nel derma papillare); *** Intensa marcatura intracitoplasmatica nei cheratinociti basali. 16

Tabella VII. Schema dell approccio diagnostico al paziente con epidermolisi bollosa - Clivaggio intraepidermico - Normale espressione dei componenti proteici del complesso di adesione epiteliale EBS di Weber-Cockayne o Köbner Ricerca di mutazioni in KRT5/KRT14 ANAMNESI FAMILIARE ANAMNESI PERSONALE ESAME OBIETTIVO Biopsia cutanea per ultrastruttura e immunopatologia - Clivaggio sub-lamina densa - Fibrille di ancoraggio assenti - Deficit completo o quasi di espressione del collagene VII EBDR di Hallopeau-Siemens Ricerca di mutazioni in COL7A1 - Clivaggio intraepidermico - Aggregati di tonofilamenti nei cheratinociti basali - Normale espressione dei componenti proteici del complesso di adesione epiteliale EBS di Dowling-Meara Ricerca di mutazioni in KRT5/KRT14 - Clivaggio intraepidermico - Deficit di espressione della cheratina K14 EBS recessiva Ricerca di mutazioni in KRT14 - Clivaggio intraepidermico - Deficit di espressione della plectina EBS con distrofia muscolare Ricerca di mutazioni in PLEC1 - Clivaggio in lamina lucida - Emidesmosomi ipoplastici e ridotti - Deficit di espressione della laminina 5 EBG di Herlitz e non Herlitz Ricerca di mutazioni in LAMA3 LAMB3, LAMC2 - Clivaggio in lamina lucida - Emidesmosomi ipoplastici e ridotti - Deficit di espressione del collagene XVII EBG non Herlitz Ricerca di mutazioni in COL17A1 - Clivaggio in lamina lucida - Emidesmosomi ipoplastici e ridotti - Deficit di espressione dell integrina α6β4 EBG con atresia pilorica Ricerca di mutazioni in ITGA6/ITGB4 17 - Clivaggio sub-lamina densa - Fibrille di ancoraggio ridotte e ipoplastiche - Intensità di espressione normale o ridotta del collagene VII EBDR non Hallopeau-Siemens o EBDR inversa o EBD pretibiale o EBDD Ricerca di mutazioni in COL7A1 - Clivaggio sub-lamina densa - Fibrille di ancoraggio normali morfologicamente e numericamente ridotte o normali - Intensità di espressione normale del collagene VII EBDD o EBDR non Hallopeau-Siemens Ricerca di mutazioni in COL7A1

INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI GENETICA Le EB sono malattie ereditarie eterogenee, sia a livello genetico (di locus), che allelico. Di fatto, nelle diverse forme sono state evidenziate numerose mutazioni. Nella maggior parte dei casi le mutazioni causali sono private e perciò la loro identificazione richiede sofisticate e costose analisi molecolari. La diagnosi molecolare è indicata nei seguenti casi: 1. Conferma di una diagnosi dubbia ottenuta sulla base dei criteri clinici, anamnestici, immunopatologici e ultrastrutturali; 2. Determinazione del meccanismo di trasmissione nei casi sporadici di EBD e di EBS di Dowling- Meara. Per quanto riguarda i casi sporadici di EBS di Weber-Cockayne e Köbner, in considerazione della gravità clinica limitata, della rarità delle forme recessive di EBS e dei costi della diagnosi genetico-molecolare, non è indicata l analisi molecolare per differenziare una mutazione de novo dominante da una rarissima forma recessiva. 3. Diagnosi prenatale in famiglie a rischio, indicata nei casi in cui la malattia sia grave. 4. Identificazione dello stato di portatore nelle persone con storia familiare di EB. Per le forme di EB recessiva può essere indicato lo screening della/e mutazione/mutazioni identificate o di eventuali mutazioni ricorrenti anche nel partner dei soggetti eterozigoti, in particolare in caso di consanguineità dei partners o di una loro origine da una area geografica ristretta. 5. Caratterizzazione della(e) mutazione(i) in previsione di un protocollo di terapia genica. 18

L ANALISI GENETICO-MOLECOLARE Epidermolisi Bollose Semplici o Epidermolitiche Quasi tutte le EBS sono causate da mutazioni dominanti che comportano sostituzioni di residui amminoacidici (mutazioni missense) o piccole inserzioni/delezioni (mutazioni frameshift) nei geni codificanti per le cheratine K5 e K14, o, raramente, da mutazioni PTC recessive negli stessi geni. La variante EBS con distrofia muscolare è causata da mutazioni recessive nel gene PLEC1, che codifica per la plectina. Il materiale biologico di elezione per la ricerca di mutazioni è il DNA genomico estratto da sangue venoso. EBS di Weber-Cockayne, Köbner, Dowling-Meara e con pigmentazione "mottled" Queste forme sono causate da mutazioni in KRT5 o KRT14 (HGMD, the Human Gene Mutation Database Cardiff). In entrambi i geni le mutazioni si concentrano in alcune regioni, come gli esoni 1, 5 e 7 di KRT5 e 1, 2, 4, 6 di KRT14 (39, 54-56). La ricerca del difetto genetico in KRT5 si esegue sul DNA genomico estratto dal sangue periferico, secondo un protocollo che prevede l amplificazione e il sequenziamento diretto degli esoni contenenti gli hot spots di mutazione (54). In caso di risultato negativo, lo screening viene esteso agli altri esoni, mediante sequenziamento del DNA. Anche per il gene KRT14, la strategia per la ricerca delle mutazioni è simile (39, 56). Date le dimensioni contenute di KRT14 (Tabella II), è anche possibile amplificare l intero gene da DNA genomico, mediante una singola reazione di PCR ad ampia estensione ( long-range PCR) e procedere poi al sequenziamento del prodotto di PCR, usando opportuni primers interni (57). EBS recessiva I nove casi noti di EBS recessiva, sono quasi tutti causati dalla presenza di mutazioni PTC su entrambi gli alleli del gene KRT14 (19, 58). Una volta confermata la diagnosi clinica di questa variante, sulla base delle indagini immunopatologiche, si procede con l analisi genetico-molecolare per la ricerca di mutazioni mediante amplificazione e sequenziamento diretto del gene KRT14. EBS con distrofia muscolare La malattia è dovuta a mutazioni nel gene PLEC1. Sono state descritte 25 mutazioni, la maggior parte di tipo PTC, concentrate nel rod domain della plectina, che è codificato dagli esoni 32 (3.3 Kb) e 33 (7.2 Kb) (HGMD). Una volta confermata la diagnosi clinica di questa variante, sulla base delle indagini immunopatologiche, si procede con l analisi genetico-molecolare. Per la ricerca di mutazioni in PLEC1 si procede dapprima allo screening degli esoni 32 e 33, mediante il test PTT (protein truncation test), o altre metodiche di screening delle mutazioni a partire da DNA genomico estratto da sangue venoso (8). Una volta identificata la presenza di una mutazione in un determinato frammento di DNA, si procede al sequenziamento del frammento e alla caratterizzazione della mutazione. Nel caso in cui la ricerca risulti negativa, vengono analizzati gli altri esoni, mediante analisi degli eteroduplex. 19

Per quanto riguarda le mutazioni in KRT5, KRT14 e PLEC1, non è disponibile al momento una casistica sufficiente a valutare il livello di attendibilità-sensibilità di questi metodi. Se l analisi genetico-molecolare non è informativa, la diagnosi prenatale può essere comunque eseguita nelle forme di Dowling-Meara e con distrofia muscolare utilizzando l'analisi immunopatologica e ultrastrutturale su biopsia di cute fetale. EPIDERMOLISI BOLLOSE GIUNZIONALI Le EBG sono causate da mutazioni dei geni LAMA3, LAMB3, LAMC2, COL17A1, ITGA6 e ITGB4 (HGMD). Pertanto la caratterizzazione genetico-molecolare di queste forme viene effettuata utilizzando protocolli diversi, in rapporto alla variante dell EBG. Il materiale di partenza per la ricerca di mutazioni può essere il DNA genomico estratto dal sangue o l RNA ottenuto da biopsia cutanea o da colture di cheratinociti primari. EBG di Herlitz. Sono causate da mutazioni in uno dei tre geni LAMA3, LAMB3 e LAMC2. Dato che non è possibile con le metodiche immunoistochimiche identificare con certezza il gene interessato, è necessario analizzare tutti e tre i geni. Dato che la frequenza con la quale sono interessati i tre geni è, in ordine decrescente, LAMB3, LAMC2 e LAMA3, si procede inizialmente alla ricerca delle mutazioni in LAMB3 e LAMC2 (59, 60). In particolare, si analizzano prima le mutazioni hot spots e quelle ricorrenti nel gene LAMB3 (R635X, W143X, 29insC) e nel gene LAMC2 (R95X), mediante amplificazione del DNA genomico e analisi di restrizione con gli enzimi BglII (R635X), BstNI (W143X), AlwNI (29insC) e TaqI (R95X) (59, 61, 62). In caso di risultato negativo, i geni LAMB3, LAMC2 e LAMA3 vengono analizzati nell ordine, utilizzando tecniche rapide di screening (analisi degli eteroduplex del DNA) su DNA genomico, seguite dalla determinazione della sequenza nucleotidica dei prodotti positivi allo screening (23, 60). Alternativamente, si può procedere all analisi diretta della sequenza nucleotidica su amplificati da RNA retrotrascritto in cdna (RT-PCR) per i geni LAMB3, LAMC2 e LAMA3 (59, 60, 63). La sensibilità globale di queste metodiche è superiore al 90% (62, 23). EBG non Herlitz. E causata più frequentemente da mutazioni nel gene COL17A1 e più raramente da mutazioni nei geni LAMB3, LAMC2 e LAMA3 (23, 24). Nei casi da deficit di BP180, determinato in base all analisi immunopatologica, la ricerca delle mutazioni si esegue con lo screening dell intero gene COL17A1, preceduto dalla ricerca della mutazione R795X, ricorrente nella popolazione italiana (50% delle mutazioni sinora identificate), mediante analisi di restrizione con l enzima HaeIII (64, 65), o alternativamente per analisi diretta della sequenza nucleotidica su amplificati da cdna (RT-PCR) (66). Per i geni LAMB3, LAMC2 e LAMA3 si procede come descritto sopra per la variante di Herlitz. In questo caso l analisi delle mutazioni più frequenti comprende anche la mutazione E210K nel gene LAMB3, da verificare mediante sequenziamento nucleotidico (62, 67, 68). In base ai dati della 20

letteratura e alla casistica Italiana nell EBG non Herlitz, la sensibilità cumulativa di queste metodiche è superiore al 90% (62). Complessivamente, nell EBG Herlitz e non Herlitz da deficit di laminina 5, le mutazioni R635X, W143X, 29insC, E210K in LAMB3 e R95X in LAMC2 comprendono il 40% degli alleli mutati caratterizzati sinora nella popolazione italiana (62). Due di queste mutazioni mostrano una distribuzione geografica regionale, essendo state identificate soltanto in pazienti provenienti dalla Campania (W143X) e dalla Sicilia (R95X). EBG con atresia pilorica. Anche in questa forma, causata da mutazioni dei geni ITGA6 e ITGB4, non è possibile individuare con certezza con metodiche immunoistochimiche il gene interessato. Dal momento che sono stati descritti soltanto 3 casi di EBG con atresia pilorica dovuta a difetti nel gene ITGA6, viene dapprima analizzato il gene ITGB4 e solo successivamente ITGA6 (26, 69). La ricerca delle mutazioni si esegue mediante screening dei geni su DNA genomico o per analisi diretta della sequenza nucleotidica su amplificati da cdna (RT-PCR) (70, 71). La sensibilità complessiva di queste metodiche è superiore all 80% (26). Nei casi in cui non sia possibile identificare la/e mutazione/i causali delle diverse forme di EBG e sia richiesta una diagnosi prenatale, possono essere utilizzate metodiche di diagnosi indiretta, basate sull analisi di marcatori polimorfici intragenici per i geni LAMA3, LAMB3, LAMC2, ITGB4, ITGA6, e COL17A1, previa dimostrazione della loro informatività nella famiglia in esame. A questo scopo è necessaria la disponibilità di campioni di DNA di almeno un figlio affetto e dei genitori. Tuttavia, data l eterogeneità di locus, la diagnosi prenatale indiretta è consigliata solo quando sia stata identificata una delle due mutazioni (72). Quando l analisi genetico-molecolare non è informativa, la diagnosi prenatale può essere effettuata nelle forme gravi mediante l'analisi immunopatologica e ultrastrutturale di una biopsia di cute fetale. EPIDERMOLISI BOLLOSE DISTROFICHE O DERMOLITICHE Tutte le varianti di EBD, sia dominanti che recessive, sono causate da mutazioni nel gene COL7A1 (HGMD). L identificazione di oltre 200 mutazioni ha evidenziato alcune correlazioni genotipo-fenotipo e ha permesso un approccio più mirato alla ricerca delle mutazioni (29-32). La caratterizzazione molecolare può essere condotta su DNA genomico estratto dal sangue periferico o sull RNA estratto dai fibroblasti dermici o dai cheratinociti primari coltivati in vitro, o da biopsia cutanea. EBD dominanti. Sono dovute, con poche eccezioni (73), a mutazioni missenso che portano alla sostituzione di residui di glicina o, più raramente, di altri aminoacidi, nel dominio collagenico del collagene di tipo VII. Di conseguenza, lo screening delle mutazioni viene dapprima eseguito sulle 21

sequenze codificanti per il dominio collagenico, mediante analisi degli heteroduplex del DNA, seguita dal sequenziamento del frammento positivo per la presenza di mutazioni. EBD recessive. Sono dovute a diversi tipi di mutazione (PTC, missense, ecc.), distribuite lungo tutta la sequenza del COL7A1. Sebbene la maggior parte di queste mutazioni siano private, sono note anche alcune mutazioni ricorrenti, diverse a seconda delle popolazioni. Nella Tabella VIII sono riportate le 6 mutazioni più comuni, che coprono complessivamente circa il 42% delle mutazioni recessive caratterizzate finora nei pazienti italiani (32, 74). Tabella VIII. Mutazioni frequenti in COL7A1 nei pazienti Italiani affetti da EBDR Mutazione N alleli % degli alleli malattia Origine geografica Metodo di identificazione 497insA 20 17.2 ubiquitaria Sequenziamento 4783-1G A 6 5.2 Sicilia Sequenziamento 7344G A 7 6.0 ubiquitaria Digestione con HphI 425A G 6 5.2 ubiquitaria Digestione con StyI G1664A 5 4.3 Puglia Digestione con PstI 8441-14del21 5 4.3 Sicilia Analisi su gel per dimensione o sequenziamento L analisi molecolare delle forme recessive di EBD viene perciò effettuata secondo un protocollo che prevede, dapprima, la ricerca delle 6 mutazioni più frequenti. Nel caso in cui questa ricerca dia risultati negativi, dato l elevato numero di esoni che compongono COL7A1, è consigliabile, per accelerare la procedura di screening, utilizzare come materiale di partenza l RNA, estratto dai fibroblasti o dai cheratinociti, retrotrascritto in cdna e quindi amplificato con 22 paia di primers (74, 75). In alternativa, si procede allo screening dell intera sequenza del COL7A1, amplificando il DNA genomico con 72 coppie di primers, sottoponendo poi i prodotti di PCR all analisi degli eteroduplex (76). Questi metodi permettono di evidenziare circa l'80% delle mutazioni. La caratterizzazione delle mutazioni viene successivamente eseguita mediante sequenziamento del DNA. Nei casi in cui non sia possibile identificare la/e mutazione/i causali delle diverse forme di EBD e sia richiesta una diagnosi prenatale, si possono utilizzare metodi di diagnosi indiretta, basati sull analisi di marcatori polimorfici intragenici di COL7A1, quali ad esempio gli RFLP per gli enzimi PvuII e AluI (77) o i microsatelliti strettamente concatenati al gene COL7A1 (75, 78), dopo dimostrazione della loro 22

informatività nella famiglia in esame. A questo scopo è necessaria la disponibilità di campioni di DNA di almeno un figlio affetto e dei genitori. Quando l analisi genetico-molecolare non è informativa, la diagnosi prenatale può comunque essere effettuata, nelle forme gravi, attraverso l'analisi immunopatologica e ultrastrutturale di una biopsia di cute fetale (79). DIAGNOSI PRENATALE Vista l eterogeneità allelica e, in alcune forme, anche di locus, delle EB, è auspicabile che la caratterizzazione della/e mutazione/i malattia, finalizzata alla diagnosi prenatale, sia ottenuta prima dell avvio della gravidanza, al fine di garantire l analisi genotipica del DNA fetale. Nelle forme recessive nelle quali è stato possibile identificare solo una delle due mutazioni ed almeno un polimorfismo informativo sull altro allele, la diagnosi prenatale basata sull analisi del DNA è risolutiva nel caso in cui la mutazione identificata sia assente nel feto. Questo risultato è sufficiente a stabilire che il feto non è affetto. In caso contrario, l analisi non fornisce un informazione certa, in quanto non è possibile escludere la presenza di un mosaicismo germinale. In questo caso la coppia deve ricevere un adeguata consulenza genetica con particolare riferimento ai rischi di ricorrenza e deve essere informata della possibilità di diagnosi prenatale mediante analisi immunoistochimica e ultrastrutturale della cute fetale (72, 79, 80). 23