Enterobacteriaceae morfologia e generalità

Enterobacteriaceae La famiglia delle Enterobacteriaceae comprende una grande varietà di bastoncini Gram-negativi aerobi e anaerobi facoltativi, asporigeni, ossidasi negativi, dotati di caratteristiche morfologiche e colturali comuni. (32 generi, 120 specie)

Enterobacteriaceae Morfologia e generalità Le dimensioni medie sono di 3 x 0,5 micron con lunghezza molto variabile, da forme bastoncellari, a volte molto corte, a forme filamentose. Possono essere mobili per flagelli peritrichi e produrre capsula o esopolisaccaridi.

Enterobacteriaceae Habitat Gli enterobatteri si ritrovano comunemente nel tratto intestinale dell'uomo e degli animali, ma sono talora presenti, come semplici colonizzatori, sulla cute, nell'apparato genitale femminile e nell'albero tracheo-bronchiale. Data la preminente localizzazione intestinale di questi microorganismi, la presenza di E. coli è assunta quale indice di contaminazione fecale delle acque

Enterobacteriaceae Crescita Crescono con facilità nei terreni di coltura complessi o selettivi (Agar desossicolato-citrato, eosina-blu di metilene). Al fini identificativi possono essere utili i terreni differenziali quali il McConkey che permette di discriminare i ceppi fermentanti il lattoso (es. E. coli) da quelli privi di ß-galattosidasi.

Enterobacteriaceae struttura antigenica H flagelli K (Vi) capsula O LPS 150 Ag somatici O 100 Ag capsulari K + di 50 Ag flagellari H

Enterobacteriaceae Antigenicità e patogenicità capsula La patogenicità degli enterobatteri è strettamente legata alla struttura antigenica della parete cellulare che contiene tre categorie principali di antigeni. La sostanza K, di natura polisaccaridica, circonda il germe e rappresenta nel genere Klebsiella la base per la suddivisione in sierotipi. La sua localizzazione periferica può mascherare gli antigeni sottostanti e quindi falsare le prove di agglutinazione utilizzate per la diagnosi sierologica. Compito principale di questa struttura capsulare è quello di eludere la fagocitosi e la successiva attivazione del complemento.

Enterobacteriaceae Antigenicità e patogenicità Enterotossina L antigene somatico 0, di natura polisaccaridica, è identificabile con l'endotossina la cui parte attiva, di natura lipidica (lipide A), affonda nel corpo batterico ed è causa delle manifestazioni generali comuni a tutti i Gram-negativi quali febbre, leucopenia, attivazione della cascata del complemento, coagulazione intravascolare disseminata, shock.

Enterobacteriaceae Antigenicità e patogenicità Antigeni Gli antigeni proteici H, flagellari, sono deputati alla mobilità. Nelle specie uropatogene questo carattere viene considerato importante per l invasività e la possibile risalita al parenchima renale. Fimbrie o pili (P) che iniziano la colonizzazione in distretti specifici e la produzione di proteine che, trasportate all'esterno della cellula, manifestano attività cito- ed entero-tossiche.

Enterobacteriaceae Antigenicità e patogenicità Sequestro di fattori di crescita La capacità di chelare il ferro attraverso la sintesi di enzimi con altissima affinità per questo cofattore favorisce la sopravvivenza e lo sviluppo delle Enterobacteriaceae nelle possibili fasi invasive. Questi microorganismi liberano i siderofori (enterobactina e aerobactina) che si contrappongono alla transferrina e lattoferrina del siero). Il ferro può essere liberato da cellule uccise con enzimi litici.

Patogenicità La sostanza K: di natura polisaccaridica compito di eluderela fagocitosi e la successiva attivazione del complemento. L antigene somatico O: di natura polisaccaridica, è identificabile con l'endotossina. Gli antigeni proteici H: flagellari, sono deputati alla mobilità. Pili (P): iniziano la colonizzazione in distretti specifici e la produzione di proteine che, trasportate all'esterno della cellula, manifestano attività cito- ed entero-tossiche.

Enterobacteriaceae enterotossine Fattori di virulenza LT : A-B ADP-ribosilante +++ AMPc ST +++cgmp alterazione trasporto ionico escrezione liquidi +++ SLT: A-B stacca un adenina 4324 in rrna 28S sintesi proteica

Enterobacteriaceae emolisine Fattori di virulenza Emolisine spesso associate a m.i. con fimbrie P e emolisine

Escherichia coli Bacilli G- Aerobi/anaerobi facoltativi Fattori di patogenicità: Adesine colonizzazione mucose flagelli motilità siderofori cattura nutrienti capsula blocco fagocitosi LPS endotossina citossine veleni responsabili della sintomatologia

E. coli Alcuni ceppi di E. coli, in particolare quelli provvisti di polisaccaride capsulare KI, sono tra i maggiori responsabili di meningiti neonatali, presentando analogie di struttura e patogenesi con altri agenti eziologici quali lo Streptococco di gruppo B (S. agalactiae), N. meningitidis e H. influenzae

E. coli E.coli può anche comportarsi da patogeno opportunista, specie in ambito nosocomiale, sostenendo infezioni delle vie respiratorie, dell'apparato urogenitale sia nel maschio che nella femmina ed inoltre peritoniti, osteomieliti, artriti, sepsi, ecc.. Tali quadri sono favoriti sia da una diminuita sorveglianza da parte delle difese dell'ospite, sia dalla circolazione di ceppi particolarmente virulenti.

Escherichia coli E il patogeno opportunista più frequente, rappresentando circa il 25% dei ceppi che vengono identificati e saggiati nell'antibiogramma. E l agente eziologico dell'80-90% delle infezioni delle vie urinarie in ambito comunitario.

Enterobacteriaceae Escherichia coli Enterotossigeni (ETEC) Enteropatogeni (EPEC) Enteroinvasivi (EIEC) Enteroemorragici (EHEC) Enteroadesivi (EAEC)

Enterobacteriaceae ETEC La prima fase: colonizzazione epitelio intestinale (plasmide trasferibile = adesine tossine). ETEC responsabili di sindromi diarroiche dovute alla produzione di enterotossine termolabili e termostabili. Aumentano i livelli intracellulari di AMP-ciclico o di GMP-cilcico, con richiamo di liquidi ed elettroliti nel lume intestinale. L infezione è caratterizzata da diarrea acquosa e crampiforme (diarrea del viaggiatore)

Enterobacteriaceae EPEC È responsabile di diarrea con febbre e leucocitosi nei neonati. La malattia è dovuta a geni plasmidici che codificano per un particolare fattore di adesività e geni cromosomici che dominano la sintesi di una intima capce di rafforzare l adesione dei patogeni alla superficie degli enterociti. Il risultato è la scomparsa di microvilli ed il riarrangiamento del citoscheletro (A/E attachment/effacement), fenomeni che conducono ad una diarrea che può anche cronicizzare.

Enterobacteriaceae EIEC I ceppi EIEC provocano una sintomatologia simile a quella presente nella dissenteria bacillare sostenuta da Shigella. Il meccanismo patogenetico è infatti analogo, con invasione degli enterociti e moltiplicazione intracellulare di E. coli cui conseguono lesioni necrotico-emorragiche della mucosa. La sintomatologia comprende pertanto diarrea mucosanguinolenta, febbre, compromissione dello stato generale e presenza di leucociti nelle feci.

Enterobacteriaceae EHEC Ceppi enteroemorragici (EHEC), sono produttori di una tossina citotossica simile a quella sintetizzata da Shigella che inibisce la sintesi proteica. Dopo una iniziale fase di adesione del germe alla mucosa, la tossina determina una vera e propria colite emorragica non accompagnata da febbre. L eventuale passaggio in circolo della tossina può determinare la sindrome emolitico-uremica provocando danni al letto vascolare del rene. Il principale serbatoio è rappresentato da alimenti provenienti da animali contaminati: carni macinate mal cotte e latte crudo (0157:H7)

Enterobacteriaceae EAEC C I microorganismi di tipo EAEC attualmente si distinguono solo per la capacità di aderire in vitro a cellule diploidi ed in vivo agli enterociti, provocando diarrea acquosa con tendenza alla cronicizzazione.

Enterobacteriaceae Acquisizione dei patogeni Via ascendente: dall esterno sino al rene Via ematogena o discendente: da setticemie Via linfatica

Enterobacteriaceae Fattori che influenzano l instaurarsi di una IVU Malattia di base Malattie metaboliche, ostruttive e iatrogene Cateteri Rapporti sessuali, che promuovono il reflusso vescicale nella donna, malformazioni, urolitiasi, ipertrofia prostatica. L ampia diffusione di questa patologia da E. coli è sostenuta da pochi sierotipi, circa 10, sugli oltre 150 riconoscibili in base a tipizzazione degli antigeni 0, H e K.

Enterobacteriaceae Escherichia coli Se dotati di fimbrie P i batteri possono progredire e causare infezioni di notevole gravità del parenchima renale (pielonefriti). I sintomi, quando presenti (è frequente anche una "batteriuria asintomatica"), sono costituiti da: pollachiuria (frequente), stranguria (dolorosa)e, in caso di infezione delle alte vie si aggiungono febbre e dolore in sede lombare.

Enterobacteriaceae Con l eccezione della mucosa uretrale le vie urinarie sono resistenti alla colonizzazione Il glucosamminoglicano che è distribuito sugli epiteli inibisce l adesività

Enterobacteriaceae Spiccate proprietà adesive alle cellule uroepiteliali e vaginali Presenza di fimbrie (codificate dal cromosoma) Molte adesine sono resistenti al mannoso Alcuni microorganismi aderiscono con strutture diverse dalle fimbrie I ceppi isolati da IVU sono più invasivi di quelli isolati dalle feci

Enterobacteriaceae I ceppi uropatogeni dispongono come fattori di virulenza, oltre a quelli già citati e comuni agli enterobatteri, di una citotossina con attività anche emolitica ( -emolisina) e di siderofori (aerobactina) che provvedono all'indispensabile sequestro del ferro in un ambiente che ne contiene poco.

MANIFESTAZIONI CLINICHE DI KLEBSIELLA PNEUMONIAE K.pneumoniae si distingue dagli altri enterobatteri per essere assolutamente immobile. In compenso essa sintetizza una cospicua capsula che conferisce alle colonie un aspetto mucoso su terreni di coltura solidi e costituisce la base della tipizzazione degli oltre 80 sierotipi (antigene K). Ospitata, come i precedenti microorganismi, nel tratto intestinale essa è ugualmente causa di infezioni delle vie urinarie di natura per lo più comunitarie.

K. pneumoniae A livello ospedaliero K. pneumoniae esprime tutta la sua potenziale patogenicità. L acronimo K.E.S. (Klebsiella, Enterobacter-, Serratia) definisce infatti un gruppo di patogeni accomunati dalla prevalente diffusione nosocomiale e dalla difficoltà di eradicazione. K.pneumoniae come altri germi capsulati (emofili, pneumococchi) causa polmoniti lobari, favorite da situazioni quali alcolismo, broncopneumopatie croniche ostruttive, deficit immunitari. A partenza dal foci urinari o respiratori può evolvere verso sepsi o meningiti.

Proteus mirabilis Questo bastoncino dallo spiccato pleomorfismo si distingue per la sua capacità di sciamare sul terreni di coltura ricoprendo tutti gli altri batteri con una patina che lo rende subito riconoscibile. Non fermenta il lattoso ed è un forte produttore di ureasi. P.mirabilis colonizza normalmente il tratto intestinale dell'uomo e, al pari di E. coli, può determinare infezioni delle vie urinarie, specie in ambito comunitario.

MANIFESTAZIONI CLINICHE DI PROTEUS MIRABILIS Fattori di virulenza: i flagelli, i pili e l'attività ureasica che determina alcalinizzazione delle urine, la formazione di calcoli di fosfatoammonico-magnesiaco che, comportandosi come corpi estranei, diminuiscono le difese locali e proteggono dall'azione degli antibiotici. Altra specie di frequente isolamento, ma più spesso in ambito nosocomiale, è P. vulgaris, che si diversifica da P.mirabilis per la capacità di produrre indolo. Il germe dimostra inoltre più spiccata chemioresistenza. E causa di infezioni delle vie urinarie, setticemie, infezioni addominali e sovrainfezioni di ferite ed ustioni.

Salmonella S.typhi, S.paratyphi, S.choleraesuis, S.typhimurium, S.enteritidis, ecc. Agente eziologico dell enterite, setticemia, febbre enterica. Ingestione> superamento dello stomaco e arrivo nell interstino L adesione (cellule M) del batterio (inv) ai microvilli causa riarrangiamento dell actina, ingresso con meccanismo di endocitosi. Replicazione rapida nelle cellule e uccisione, (placche di Peyer) quindi invasione dei macrofagi.

Salmonella La salmonella è ingerita con alimenti ecc. passa indenne attraverso lo stomaco perché ha un sistema genetico (ATR) di resistenza agli acidi. Raggiunge le cellule M (microfold) dell intestino ove stimola la endocitosi, le supera e viene a contatto con i macrofagi. Sfugge alla fagocitosi e viene portata in circolo attraverso il sistema linfatico e quindi nel circolo ematico.

Salmonella Presente in quasi tutti gli animali, Contagio oro-fecale, pollame, uova, prodotti caseari, cibi poco cotti o manipolati da persone infette La carica infettiva varia con il variare delle persone da <1000 organismi a oltre 10 milioni Dopo ingestione (13 giorni incub.) >>febbre, +-diarrea, da intestino, linfat. noduli mesenterici, circ. sangue isolabile da sangue, feci, urine Vi sono portatori sani

Salmonella caratteri di patogenicità Resistenza agli acidi (ATR) Mobilità Resistenza ai fattori intestinali antimicrobici dell ospite Induzione di segnali sulle cellule epiteliali Ruffling della membrana endocitosi secrezione IL8 Sopravvivenza nei macrofagi (catalasi, superossidismutasi) Entrata e formazione di spazio nei fagosomi Ritardo ed attenuazione dell acidificazione

Shigella S.dysenteriae, S.sonnei, S.flexneri e S.boydii Trasmissione orofecale, cotaminazioni, bimbi. Bastano 200 cellule per dare infezione, cond. Sanit. Cellule bersaglio: mucosa del colon. Geni della virulenza localizzati su un grande plasmide regolati da geni cromosomici. Adesione cellule M, lisano i vacuoli, si replicano nel citoplasma. Invadono altre cellule adiacenti, sono eliminate dai macrofagi. La fase intracellulare protegge.

Le shigelle non essendo in grado di accedere all interno degli enterociti della mucosa del colon, attraverso la membrana apicale di tali cellule, guadagnano l accesso alla sottomucosa attraverso le cellule M per transcitosi. I pochi batteri che arrivano alla sottomucosa vengono prontamente fagocitati dai macrofagi residenti nella sottomucosa. 40

Shigella Produce una tossina, subunità A e cinque B. Le sub. B si legano ad un glicolipide (Gb3) favorendo l ingresso di A. Questa taglia rrna 28S della sub rib. 60S. Legame t-rna, blocco sintesi proteica. Sintomi dopo 3 giorni, diarrea sanguinolenta e pus, crampi addominali, infezione autolimitante ma trattamento antibiotico. Rari i portatori sani.

Enterobacteriaceae Classificazione Svariati sono gli schemi tassonomici utilizzati per incasellare le numerose specie, generi e tipi di enterobatteri. Si differenziano con test colturali e biochimici nonchè metodi sierologici. Bastoncini gram-negativi Fermentano il glucoso Riducono i nitrati Test ossidasi negativo (p-feniletilendiamina)

DIAGNOSI MICROBIOLOGICA Partendo da campioni clinici congrui alle varie sedi di infezione l'identificazione delle diverse specie di enterobatteri non presenta particolari difficoltà. L aspetto delle colonie, su terreni indicatori o selettivi, risulta caratteristico; l'idrolisi del lattosio, l'eventuale sciamatura, l'aspetto mucoso delle colonie possono consentire già dal primo isolamento una diagnosi presuntiva. La successiva identificazione attraverso gallerie biochimiche miniaturizzate permette di raggiungere agevolmente una speciazione.

Enterobacteriaceae Diagnosi microbiologica Isolamento da campioni di infezioni localizzate Terreni selettivi o non, dipende dal campione Arricchimento a freddo per Yersinia Identificazione mediante prove biochimiche e sierologiche Terapia, spesso per infezioni nosocomiale richiesto l antibiogramma

DIAGNOSI MICROBIOLOGICA La tipizzazione del ceppi di E. coli causa di diarrea (,EPEC, ETEC, EIEC, EHEC, e EAEC già descritti) pone problemi più complessi che sono di solito affrontati in centri specializzati. Superati i metodi sierologici, sono divenute attualmente disponibili sonde genetiche estremamente specifiche ma costose che permettono di abbreviare notevolmente i tempi delle indagini e che sono preziose ai fini epidemiologici.

APPROCCIO TERAPEUTICO In presenza di una patologia sostenuta da Enterobacteriaceae s'impone, specie nelle infezioni nosocomiali, una terapia guidata dall'antibiogramma. L incidenza di resistenze sconsiglia infatti un approccio empirico poichè tra questi patogeni è frequente lo scambio di informazioni plasmidiche che veicolano numerosi geni capaci di conferire refrattarietà a più antibiotici contemporaneamente.

APPROCCIO TERAPEUTICO In Italia, i dati epidemiologici confermano una diminuita attività di alcuni ß-lattamici dato il larghissimo impiego clinico di cui ha goduto questa classe di antimicrobici. L analisi dell'ampicillinoresistenza (circa il 45%) e il suo superamento, anche se non totale, da parte di associazioni con inibitori suicidi, permette di confermare che il meccanismo alla base di questo fenomeno è l'acquisizione di una ß-lattamasi plasmidica.

APPROCCIO TERAPEUTICO Il ricorso a molecole intrinsecamente stabili all'azione delle ß-lattamasi quali le cefalosporine di terza generazione, i carbapenemici, gli aminoglicosidi e i fluorochinoloni appare giustificato in infezioni sistemiche nosocomiali gravi quando l'urgenza clinica non consenta di mirare la terapia. In ambito comunitario le refrattarietà rimangono a tutt'oggi di gran lunga meno incidenti di quelle riscontrate in ambito nosocomiale.

APPROCCIO TERAPEUTICO Appare ragionevole (infezioni delle vie urinarie non complicate) impostare una terapia empirica che consideri l'eziologia e l'epidemiologia locale, facendo ricorso a chemioterapici poco impiegati per via sistemica (cotrimossazolo, norfloxacina, fosfomìcinatrometamolo ecc.). Raramente in E. coli e Proteus, più facilmente in K. pneumoniae possono essere elaborate ß-lattamasi insensibili agli inibitori suicidi ma superabili da parte di monobattamici, cefalosporine di terza generazione e carbapenemici.

APPROCCIO TERAPEUTICO In K. pneumoniae ha iniziato a circolare anche nel nostro Paese una resistenza mediata da ß-lattamasi a spettro esteso capaci di idrolizzare anche le cefalosporine più recenti e i carbapenemici. In pazienti debilitati i batteri della popolazione microbica normale intestinale possono trasformarsi in temibili patogeni. Particolare attenzione va pertanto prestata al serbatoio delle infezioni ed alla prevenzione della trasmissione delle stesse, vista la facilità con cui le Enterobacteriaceae colonizzano le mani del personale sanitario e sopravvivono nel liquidi (umidificatori, soluzioni per terapia parenterale, ecc.)

APPROCCIO TERAPEUTICO Sarà pertanto essenziale mantenere l'asepsi e l'igiene delle mani durante le terapie parenterali. Lo strumentarlo delle cateterizzazioni dovrà essere perfettamente sterilizzato. Per quanto riguarda la diarrea del viaggiatore, ai soggetti che si recano in zone a rischio sarà sufficiente consigliare le comuni misure igieniche preventive, ed eventualmente l'utilizzo di farmaci come il cotrimossazolo, rifaximina o i chinolonici.

Problematiche di resistenza agli antibiotici in P.aeruginosa e nelle Enterobacteriaceae Cefalosporinasi cromosomiche inducibili TEM-1 resistenza alle penicilline antipseudomonas PSE 1-4 -lattamasi plasmidiche Adenil transferasi (resistenza all'amikacina) Impermeabilità (resistenza a tutti gli aminoglicosidi) Carbapenemasi Mutazione nella porina OprD (imipenem-resistenza) Resistenza alla ciprofloxacina (gyra, parc) Eflusso attivo (fluorochinoloni) Murray et al., 1999; Westbrock et al., 1999; Jalal et al.,2000;ciofu et al., 2001.

Klebsiella- Proteus- Enterobacter- Serratia- Citrobacter RESISTENZA ESBL EPIDEMIE Carbapenemasi