RISOLUZIONE OIV-OENO 488-2013 REVISIONE DELLA MONOGRAFIA SULLA DETERMINAZIONE DELL ATTIVITÀ DELLA ß-GLUCANASI (ß-1,3; ß-1,6) NELLE PREPARAZIONI ENZIMATICHE (OIV-OENO 340-2010) L'ASSEMBLEA GENERALE, Visto l'articolo 2 paragrafo 2 iv, dell Accordo del 3 aprile 2001 che istituisce l Organizzazione Internazionale della Vigna e del Vino, Tenuto conto dei lavori del gruppo di esperti Specificazione dei prodotti enologici, Considerata la risoluzione OIV-OENO 340-2010 adottata dall OIV, DECIDE, su proposta della Commissione II Enologia, di modificare la risoluzione OIV OENO 340 2010 pubblicata nel Codex Enologico Internazionale in base alle seguenti modifiche: DETERMINAZIONE DELL ATTIVITA DELLA β-glucanasi (β-1,3; β-1,6) NELLE PREPARAZIONI ENZIMATICHE Caratteristiche Generali Queste attività enzimatiche sono normalmente presenti all interno di una preparazione enzimatica complessa. Durante la degradazione dei ß-glucani di Botrytis cinerea, sono coinvolte le attività della endo-ß-glucanasi di tipo endo-ß-1,3, le attività della eso-1,6-ß-glucosidasi nonché le attività di tipo eso-ß-1,3. Queste attività vengono di seguito riassunte utilizzando il termine comune ß-glucanasi. Queste preparazioni enzimatiche sono anche in grado di degradare i ß-glucani presenti nella parete delle cellule morte dei lieviti Saccharomyces sostenendo il processo chiamato élevage de vin sur lie (affinamento del vino sulle fecce). In questo processo, sono coinvolte le attività endo-ß-1,3, endo-ß-1,6 nonché le attività eso-ß-1,3 ed eso-ß-1,6. Salvo diverse disposizioni, le caratteristiche devono essere conformi alla risoluzione OENO 365 2009 riguardante le caratteristiche generali per le preparazioni enzimatiche incluse nel Codex Enologico Internazionale. 1. PROVENIENZA Si raccomanda di consultare il paragrafo 5 Fonti di enzimi e ambienti di fermentazione della Monografia Generale sulle Preparazioni Enzimatiche. Le preparazioni enzimatiche contenenti le attività delle ß-glucanasi sono prodotte dalla fermentazione diretta, ad esempio, di Trichoderma harzianum, Trichoderma longibrachiatum (T. reesei) e Penicillium funiculosum. 1
2. SCOPO E CAMPO D APPLICAZIONE Si raccomanda di consultare il Codice Internazionale delle Pratiche Enologiche, OENO 11/04; 12/04; 15/04 e 3/85. Le preparazioni enzimatiche contenenti le attività della 1,3-ß-glucanasi e della 1,6-ß-glucanasi sono in grado di idrolizzare il glucano prodotto da Botrytis cinerea (muffa nobile e muffa grigia). Questo polisaccaride causa problemi significativi durante i processi di chiarificazione e filtrazione del vino. Conseguentemente, le ß-glucanasi sono utilizzate in modo specifico per la chiarificazione e la filtrazione dei vini ottenuti da uve botritizzate. Queste ß-glucanasi idrolizzano altresì i glucani contenuti nelle pareti cellulari dei lieviti. Esse possono essere utilizzate per migliorare il processo di affinamento sulle fecce e la filtrabilità. 3. PRINCIPIO Il metodo di analisi si basa sul dosaggio del glucosio liberato dall enzima di cui si vuole misurare l attività, impiegando una soluzione standardizzata di glucano proveniente da Schizophyllum sp. come substrato. 3.1 Definizione delle unità Una unità di β-glucanasi (β-glu-u) è definita come la quantità di zuccheri riduttori, espressa in glucosio, che viene liberata, in condizioni sperimentali, da 1 g (o 1 ml) di enzima per minuto. 3.2 Ruolo dell enzima Botrytis cinerea secerne, durante la sua crescita sulle uve infettate (muffa grigia o nobile), un 1,3-βglucano che possiede, su ogni terza unità di glucosio, un residuo di glucosio legato mediante legame glicosidico in posizione β-1,6 (Fig.1). Tale glucano è molto simile a quello sintetizzato da Schizophyllum sp. 2
1,6-B-glicosidasi 1,6-B-Glicoside ß-1,3-Glicoside eso-1,3-b-glucosidasi 3.3 Principio di misurazione L attività enzimatica libera glucosio che, in soluzione basica, riduce l acido 3,5-dinitrosalicilico in acido 3-ammino-5-nitrosalicilico. Un aggiunta di fenolo aumenta la sensibilità della reazione. L idrogenosolfito di sodio serve a stabilizzare la colorazione. 4. STRUMENTAZIONE 4.1 Spettrofotometro e cuvette con cammino ottico di 1 cm; 4.2 bagnomaria a 40 C, 100 C; 4.3 agitatore magnetico standard; 4.4 agitatore magnetico multiplo per immersione, regolato a 300 gpm; 4.5 vetreria da misurazione (palloni graduati, cilindri, beute coniche, ecc.); 4.6 becher; 4.7 micropipette; 4.8 cronometro; 3
4.9 bagno a ultrasuoni; 4.10 ph-metro. 5. REATTIVI E PRODOTTI 5.1 Substrato Soluzione madre di glucano fornito dall Università di Braunschweig 1 il cui tenore in glucano è stato determinato dalla stessa. 5.2 Prodotti puri 5.2.1 Acido citrico monoidrato (n. CAS: 5949-29-1); 5.2.2 idrossido di sodio (n. CAS: 1310-73-2); 5.2.3 tartrato di sodio e di potassio (n. CAS: 304-59-6); 5.2.4 metabisolfito di sodio Na 2 O 5 S 2 (n. CAS: 7681-57-4); 5.2.5 fenolo (n. CAS: 108-95-2); 5.2.6 glucosio anidro; 5.2.7 acido 3,5-dinitro-2-idrossibenzoico (3,5-dinitrosalicilico) (n. CAS: 609-99-4); 5.2.8 acqua distillata. 5.3 Soluzioni 5.3.1 Soluzione di idrossido di sodio 1 M In un pallone graduato da 100 ml sciogliere 4,0 g di idrossido di sodio (5.2.2) e portare a volume con acqua distillata (5.2.8). 5.3.2 Soluzione tampone citrato (ph 4,0) - 0,2 mol/l In un pallone graduato da 500 ml, sciogliere 21,0 g di acido citrico monoidrato (5.2.1) in 400 ml di acqua distillata, poi aggiustare il ph a 4,0 con una soluzione di idrossido di sodio 1 M (5.3.1) e portare a volume con acqua distillata (5.2.8). 5.3.3 Soluzione di tampone citrato (ph 4,0) - 0,1 mol/l In un pallone graduato da 1000 ml, sciogliere 21,0 g di acido citrico monoidrato (5.2.1) in 900 ml di acqua distillata (5.2.8), poi aggiustare il ph a 4,0 con una soluzione di idrossido di sodio 1 M (5.3.1) e portare a volume con acqua distillata (5.2.8). 5.3.4 Soluzione titolante: reattivo colorimetrico acido DNS (dinitrosalicilico) in soluzione fenolica È preparato partendo dalle soluzioni A, B, C sotto indicate: 5.3.4.1 Soluzione A: Pesare 154,2 g di tartrato di sodio e di potassio (5.2.3) in un becher da 800 ml e disciogliere completamente in 500 ml di acqua distillata (5.2.8). Aggiungere 9,7 g di idrossido di sodio (5.2.2). 1 Prof. Dr. Udo Rau, Technical University Braunschweig, Department of Biochemistry and Biotechnology Spielmannstr. 7, 38106 Braunschweig - Germany 4
5.3.4.2 Soluzione B: In un becher da 2000 ml sciogliere completamente 5,3 g di acido 3,5-dinitrosalicilico (5.2.7) in 500 ml di acqua distillata (5.2.8). I migliori risultati sono ottenuti utilizzando un bagno a ultrasuoni. 5.3.4.3 Soluzione C: In un becher da 100 ml sciogliere 4,2 g di fenolo (5.2.5) in 50 ml di acqua distillata (5.2.8). Aggiungere quindi 1 g di idrossido di sodio (5.2.2) e, dopo il completo scioglimento, 4,2 g di metabisolfito di sodio (5.2.4) e sciogliere nuovamente. 5.3.4.4 Soluzione di glucosio allo 0,3 % In un pallone graduato da 100 ml mettere esattamente 300 mg di glucosio (5.2.6), sciogliere in acqua distillata (5.2.8) e poi portare a volume con acqua distillata. 5.3.4.5 Reattivo colorimetrico DNS in soluzione fenolica Le soluzioni A e C sono mescolate con la soluzione B in un becher da 2000 ml che è in seguito coperto con carta d alluminio. Prima dell uso, conservare al buio per almeno tre giorni. Travasare il reagente in un contenitore di vetro marrone. Se disposta in un luogo buio e a una temperatura compresa tra 15-20 C, la soluzione può essere conservata per un mese. Per ogni reagente appena preparato e prima di ogni misurazione, viene eseguita una nuova calibrazione prima di ogni analisi enzimatica. Prima di ogni utilizzo, devono essere aggiunti 3 ml di una soluzione di glucosio allo 0,3% (5.3.3.4) a 200 ml del reattivo colorimetrico DNS in soluzione fenolica. 5.3.5 Glucano in soluzione allo 0,1%, ph 4,0 Pesare la quantità esatta di soluzione madre di glucano (5.1), per ottenere una concentrazione finale di 1 g/l. La soluzione finale di substrato deve contenere il 50% della soluzione tampone citrato (ph 4,0), 0,2 mol/l (5.3.2). Per ottenere 100 ml della soluzione di substrato a partire dalla soluzione madre di glucano (5.1) (contenente attualmente 5.2 g/l), pesare 19,2 g in un becher da 100 ml. Aggiungere 50 ml della soluzione tampone citrato (ph 4,0), 0,2 mol/l (5.3.2). Omogeneizzare la miscela di glucano mescolando per almeno 15 minuti. Quando ben omogeneizzata, aggiustare il ph a 4,0 con la soluzione di idrossido di sodio 1 M (5.3.1). Quindi trasferire la soluzione in un pallone graduato da 100 ml e portare a volume con acqua distillata (5.2.8). Conservare ogni soluzione madre di glucano a temperatura ambiente. Se viene utilizzata una nuova soluzione madre di glucano, si deve determinare un fattore di substrato di glucano (Gf = fattore di glucano) tramite l enzima standard. Il fattore Gf è indispensabile per confrontare i risultati delle soluzioni madri di glucano precedenti con le nuove. Il fattore Gf è calcolato con i valori misurati considerando che l attività enzimatica standard nella formula (vedi: Calcolo dell attività enzimatica) è di 10000 β-glu U/g. 5.4 Preparazioni enzimatiche 5.4.1 Soluzione Standard di enzimi glucanasi: Disciogliere 0,5 g di preparazione enzimatica standard di glucanasi in 25 ml della soluzione tampone citrato (ph 4,0; 0,1 mol/l) (5.3.3) e portare a volume fino a 100 ml con acqua distillata (5.2.8). 5.4.2 Per tutte le altre preparazioni enzimatiche: 5
Sciogliere 1 ml di preparazione enzimatica o 0,5 g di preparazione enzimatica solida in polvere o in granulato in 25 ml di soluzione tampone citrato (ph 4,0; 0,1 mol/l) (5.3.3) e portare a volume fino a 100 ml con acqua distillata (5.2.8). Se i valori di assorbanza sono troppo alti o troppo bassi, è necessaria una diluizione appropriata. La diluizione degli enzimi deve contenere il 25% della soluzione tampone citrato (5.3.3). 6. PROCEDIMENTO 6.1 Prova in bianco del reagente Aggiungere 7 ml di reattivo colorimetrico DNS in soluzione fenolica (5.3.4) a 3 ml di acqua distillata (5.2.8) in un pallone graduato da 50 ml e riscaldarlo per 10 minuti esatti in un bagnomaria di acqua bollente in ebollizione. Raffreddare quindi per 5 minuti in un bagnomaria di acqua ghiacciata, poi trasferire il pallone in un bagnomaria a 20 C e aggiungere acqua distillata (5.2.8) senza raggiungere la linea di graduazione. Dopo 10 minuti a 20 C portare a volume. 6.2 Curva di calibrazione del glucosio con il reattivo colorimetrico DNS in soluzione fenolica Sciogliere 2,00 g di glucosio (5.2.6) in un pallone graduato da 200 ml e portare a volume con acqua distillata (5.2.8). Partendo da questa soluzione, preparare le seguenti diluizioni: N V soluzione glucosio (µg) nella prova glucosio/100 ml standard/100 ml (= 0,5 ml) 1 2 ml 20 mg 100 µg 2 5 ml 50 mg 250 µg 3 10 ml 100 mg 500 µg 4 15 ml 150 mg 750 µg 5 20 ml 200 mg 1,000 µg 6 30 ml 300 mg 1,500 µg 7 40 ml 400 mg 2,000 µg Introdurre, con l aiuto di una pipetta, 0,5 ml di ogni diluizione contenente glucosio in dei palloni graduati da 50 ml, aggiungere 7 ml di reattivo colorimetrico DNS in soluzione fenolica (5.3.4) e 2,5 ml di acqua distillata (5.2.8). Riscaldare i palloni per 10 minuti esatti in un bagnomaria di acqua bollente. Raffreddare quindi per 5 minuti in un bagnomaria di acqua ghiacciata, poi trasferire i palloni in un bagnomaria a 20 C e aggiungere acqua distillata (5.2.8) senza raggiungere la linea di graduazione. Dopo 10 minuti a 20 C portare a volume. Nei 15 minuti successivi, misurare l assorbanza delle soluzioni, rispetto al bianco (solo reagente), tramite uno spettrofotometro e alla lunghezza d onda di 515 nm. Tracciare, in un diagramma, la quantità di glucosio liberata nel campione di prova in funzione dell assorbanza a 515 nm (Fig. 2). La curva di calibrazione viene eseguita lo stesso giorno, prima di ogni analisi enzimatica. 6
Glucosio Calibrazione mediante reattivo colorimetrico DNS in soluzione fenolica Figura 2 6.3 Prova in bianco degli enzimi Introdurre, con l aiuto di una pipetta, 0,5 ml di ogni soluzione contenente gli enzimi (5.4.1 o 5.4.2) in dei palloni graduati da 50 ml e aggiungere 7 ml di reattivo colorimetrico DNS in soluzione fenolica (5.3.4). Mescolare accuratamente e aggiungere 2,5 ml della soluzione di substrato (5.3.5). Mescolare bene agitando manualmente. In seguito riscaldare tutti i campioni in un bagnomaria di acqua bollente per 10 minuti esatti, in seguito raffreddare per 5 minuti in un bagnomaria di acqua ghiacciata, poi trasferire il pallone in un bagnomaria a 20 C e aggiungere acqua distillata (5.2.8) senza raggiungere la linea di graduazione. Dopo 10 minuti a 20 C portare a volume. Nei 15 minuti successivi, misurare l assorbanza delle soluzioni, rispetto al bianco (solo reagente), tramite uno spettrofotometro e alla lunghezza d onda di 515 nm. 6.4 Misurazione dell attività delle preparazioni enzimatiche Per ogni campione di enzimi, mettere 10 ml di substrato (5.3.5) in una beuta conica, quindi porre la beuta per 5 minuti in un bagnomaria a 40 C. I campioni devono essere omogeneizzati con l aiuto di un agitatore magnetico multiplo a immersione regolato a 300 gpm. Dopo 5 minuti, vengono aggiunti 2 ml della soluzione di enzimi (5.4.1 o 5.4.2) nel primo campione e si fa partire un cronometro subito dopo l aggiunta della prima soluzione di enzimi. Aggiungere quindi le successive soluzioni di enzimi a tutti gli altri campioni con un intervallo di 30 secondi per ogni campione. I campioni devono essere agitati a 300 gpm per tutto il tempo di reazione. Dopo esattamente 15 minuti, prelevare 3 ml della prima miscela, quindi fare lo stesso per tutti gli altri campioni con un intervallo di 30 secondi. 7
Mediante l uso di una pipetta, introdurre ogni miscela da 3 ml in un numero corrispondente di palloni graduati da 50 ml, contenente ciascuno 7 ml di reattivo colorimetrico DNS in soluzione fenolica (5.3.4). In seguito riscaldare tutti i campioni in un bagnomaria di acqua bollente per 10 minuti esatti rispettando l intervallo di 30 secondi tra i campioni. Raffreddare quindi per 5 minuti in un bagnomaria di acqua ghiacciata, poi trasferire i palloni in un bagnomaria a 20 C e aggiungere acqua distillata (5.2.8) senza raggiungere la linea di graduazione. Dopo 10 minuti a 20 C, portare a volume. Nei 15 minuti successivi, misurare l assorbanza delle soluzioni, rispetto al bianco (solo reagente), tramite uno spettrofotometro e alla lunghezza d onda di 515 nm. La differenza di assorbanza tra la lettura del bianco degli enzimi e il valore dopo la reazione deve essere compresa tra 0,1 e 0,6 unità di assorbanza. Se i valori sono al di là dell intervallo di misura della curva di calibrazione, ripetere la prova con diluizioni adattate agli enzimi. Con tutti gli enzimi, preparare sempre 1 lettura del bianco degli enzimi e 2 valori dopo la reazione. I due valori dopo la reazione devono essere vicini. 7. Calcoli Per il calcolo dell attività enzimatica utilizzare il valore medio delle due misure. L attività enzimatica di una preparazione enzimatica è calcolata secondo la formula seguente: Attività β-glu-unità/g o ml = (G x 200)/(15 x E) x 1/Gf Nkat/g o ml = (Attività β-glu-unità/g o ml) x (1000/60) Dove G = quantità di zuccheri riduttori liberati durante la prova (zuccheri riduttori liberati da Δ = media di 2 ripetizioni dell assorbanza dopo la reazione - l assorbanza del bianco degli enzimi, calcolata in glucosio a partire dalla curva di calibrazione del glucosio in µg). E = quantità di enzima diluito a 100 ml in g o ml 200 = fattore di diluizione 15 = tempo di reazione in minuti Gf = fattore di glucano (da calcolare) Esempio di calcolo: Enzima Enzima utilizzato ß-Glucanasi da Penicillium funiculosum Valore misurato 1 2 Bianco degli enzimi E µg di glucosio Unità ß-Glu/g o ml 0,621 0,618 0,415 0,503 662 10325 0,417 0,416 0,023 1 1249 9799 8
Calcolo del Gf: 1 Effettuare la misura con un substrato utilizzato in precedenza e l enzima standard (Valore 1), 2 Effettuare la misura con un nuovo substrato e l enzima standard (Valore 2). Calcolo: Valore 1/Valore 2 8. Bibliografia Bertrand A. Determination de l'activite β-glucanase de Botrytis des preparations enzymatiques OIV FV 1263. 9