Parte I I principi fondamentali della clonazione dei geni e dell analisi del DNA

6746 BROWN Iniziali I-XIV 13-04-2007 11:57 Pagina VII Indice Parte I I principi fondamentali della clonazione dei geni e dell analisi del DNA Capitolo 1 L importanza della clonazione dei geni e dell analisi del DNA 3 1.1 Le prime fasi dello sviluppo della genetica 3 1.2 L avvento della clonazione dei geni e della reazione a catena della polimerasi 3 1.3 Che cos è la clonazione dei geni? 4 1.4 Che cos è la PCR? 5 1.5 Perché la clonazione dei geni e la PCR sono così importanti? 6 1.5.1 Isolamento dei geni mediante clonazione 6 1.5.2 Isolamento dei geni mediante PCR 10 1.6 In che modo orientarsi in questo libro 11 Letture ulteriori 12 Capitolo 2 Vettori per la clonazione dei geni: plasmidi e batteriofagi 13 2.1 I plasmidi 13 2.1.1 Caratteristiche fondamentali dei plasmidi 13 2.1.2 Dimensioni e numero di copie 15 2.1.3 Coniugazione e compatibilità 16 2.1.4 Classificazione dei plasmidi 17 2.1.5 Plasmidi di organismi diversi dai batteri 17 2.2 I batteriofagi 18 2.2.1 Le caratteristiche fondamentali dei batteriofagi 18 2.2.2 I fagi lisogeni 19 2.2.3 I virus come vettori di clonaggio in altri organismi 26 Letture ulteriori 26 Capitolo 3 Purificazione di DNA da cellule vive 27 3.1 Preparazione di DNA cellulare totale 27 3.1.1 Crescita e raccolta di una coltura batterica 28 3.1.2 Preparazione di un estratto cellulare 30 3.1.3 Purificazione del DNA da un estratto cellulare 32 3.1.4 Concentrazione dei campioni di DNA 35

6746 BROWN Iniziali I-XIV 13-04-2007 11:57 Pagina VIII VIII Indice 3.1.5 Misurazione della concentrazione del DNA 35 3.1.6 Altri metodi di preparazione di DNA cellulare totale 36 3.2 Preparazione di DNA plasmidico 39 3.2.1 Separazione in base alle dimensioni 39 3.2.2 Separazione in base alla conformazione 40 3.2.3 Amplificazione del plasmide 44 3.3 Preparazione del DNA di batteriofago 45 3.3.1 Crescita delle colture per ottenere un alto titolo di 45 3.3.2 Preparazione di fagi non lisogeni 46 3.3.3 Raccolta dei fagi da una coltura infettata 48 3.3.4 Purificazione del DNA da particelle di fago 49 3.3.5 La purificazione del DNA di M13 pone pochi problemi 49 Letture ulteriori 51 Capitolo 4 Manipolazione di DNA purificato 52 4.1 La gamma degli enzimi di manipolazione del DNA 52 4.1.1 Nucleasi 53 4.1.2 Ligasi 55 4.1.3 Polimerasi 56 4.1.4 Enzimi di modificazione del DNA 57 4.1.5 Topoisomerasi 58 4.2 Gli enzimi che tagliano il DNA le endonucleasi di restrizione 58 4.2.1 La scoperta e la funzione delle endonucleasi di restrizione 60 4.2.2 Le endonucleasi di restrizione di tipo II tagliano il DNA a livello di sequenze nucleotidiche specifiche 61 4.2.3 Estremità nette ed estremità coesive 62 4.2.4 La frequenza delle sequenze di riconoscimento in una molecola di DNA 63 4.2.5 Esecuzione di una digestione di restrizione in laboratorio 64 4.2.6 Analisi del risultato del taglio delle endonucleasi di restrizione 66 4.2.7 Stima delle dimensioni delle molecole di DNA 70 4.2.8 Mappatura delle posizioni di siti di restrizione diversi in una molecola di DNA 71 4.3 La legatura l unione di molecole di DNA 73 4.3.1 Il meccanismo di azione della DNA ligasi 74 4.3.2 Le estremità coesive fanno aumentare l efficienza della legatura 75 4.3.3 Aggiunta di estremità coesive a una molecola a estremità nette 75 Letture ulteriori 81 Capitolo 5 Introduzione di DNA in cellule vive 82 5.1 Trasformazione l assunzione di DNA da parte di cellule batteriche 85 5.1.1 Non tutte le specie batteriche assumono DNA con la stessa efficienza 85 5.1.2 Preparazione di cellule competenti di E. coli 85 5.1.3 Selezione delle cellule trasformate 85 5.2 Identificazione dei ricombinanti 88 5.2.1 Selezione dei ricombinanti con pbr322 inattivazione inserzionale di un gene della resistenza a un antibiotico 88 5.2.2 L inattivazione inserzionale non riguarda sempre la resistenza agli antibiotici 90

6746 BROWN Iniziali I-XIV 13-04-2007 11:57 Pagina IX Indice IX 5.3 Introduzione di DNA fagico in cellule batteriche 92 5.3.1 Trasfezione 93 5.3.2 Packaging in vitro di vettori di clonaggio 93 5.3.3 L infezione fagica si visualizza sotto forma di placche su un mezzo di agar 93 5.4 Identificazione di fagi ricombinanti 95 5.4.1 Inattivazione inserzionale di un gene lacz portato dal vettore fagico 95 5.4.2 Inattivazione inserzionale del gene ci di 96 5.4.3 Selezione mediante utilizzo del fenotipo Spi 97 5.4.4 Selezione in base alle dimensioni del genoma di 97 5.5 Introduzione di DNA in cellule non batteriche 97 5.5.1 Trasformazione di singole cellule 97 5.5.2 Trasformazione di interi organismi 99 Letture ulteriori 100 Capitolo 6 Vettori di clonaggio per E. coli 101 6.1 Vettori di clonaggio basati su plasmidi di E. coli 101 6.1.1 La nomenclatura dei vettori di clonaggio plasmidici 102 6.1.2 Le proprietà utili di pbr322 102 6.1.3 Il pedigree di pbr322 103 6.1.4 Vettori di clonaggio plasmidici di E. coli più sofisticati 103 6.2 Vettori di clonaggio basati sul batteriofago M13 108 6.2.1 Sviluppo dei vettori di clonaggio M13 108 6.2.2 Vettori ibridi plasmide-m13 113 6.3 Vettori di clonaggio basati sul batteriofago 113 6.3.1 Segmenti del genoma di possono essere deleti senza alterarne la vitalità 115 6.3.2 Si può usare la selezione naturale per isolare modificato privo di certi siti di restrizione 116 6.3.3 Vettori di inserzione e di sostituzione 116 6.3.4 Esperimenti di clonazione con vettori di inserzione o di sostituzione 119 6.3.5 Usando un cosmide si possono clonare lunghi frammenti di DNA 120 6.4 I vettori e altri vettori ad alta capacità permettono la costruzione di librerie genomiche 122 6.5 Vettori per altri batteri 123 Letture ulteriori 123 Capitolo 7 Vettori di clonaggio per gli eucarioti 125 7.1 Vettori per lievito e altri funghi 125 7.1.1 Marcatori selezionabili per il plasmide da 2 m 126 7.1.2 Vettori basati sul plasmide da 2 m plasmidi episomici di lievito 127 7.1.3 Uno YEp si può inserire nel DNA cromosomico del lievito 128 7.1.4 Altri tipi di vettori di clonaggio di lievito 128 7.1.5 I cromosomi artificiali possono essere usati per clonare lunghi frammenti di DNA nel lievito 130 7.1.6 Vettori per altri lieviti e per i funghi 133 7.2 Vettori di clonaggio per le piante superiori 133 7.2.1 Agrobacterium tumefaciens l ingegnere genetico più piccolo esistente in natura 133

6746 BROWN Iniziali I-XIV 13-04-2007 11:57 Pagina X X Indice 7.2.2 Clonazione di geni nelle piante mediante trasferimento genico diretto 139 7.2.3 I tentativi di usare virus vegetali come vettori di clonaggio 141 7.3 Vettori di clonaggio per gli animali 142 7.3.1 Vettori di clonaggio per gli insetti 143 7.3.2 La clonazione nei mammiferi 144 Letture ulteriori 147 Capitolo 8 Il modo in cui si ottiene un clone di un gene specifico 149 8.1 Il problema della selezione 149 8.1.1 Esistono due strategie fondamentali per ottenere il clone desiderato 149 8.2 Selezione diretta 151 8.2.1 La sopravvivenza dovuta al marcatore estende le applicazioni della selezione diretta 151 8.2.2 Gli scopi e le limitazioni della sopravvivenza dovuta al marcatore 153 8.3 Identificazione di un clone in una libreria di geni 154 8.3.1 Librerie di geni 154 8.3.2 Non tutti i geni sono espressi contemporaneamente 154 8.3.3 L mrna può essere clonato come DNA complementare 155 8.4 Metodi per identificare il clone 158 8.4.1 I filamenti complementari di acido nucleico ibridano fra loro 158 8.4.2 Sondaggio di colonie e placche mediante ibridazione 159 8.4.3 Esempi dell uso pratico del sondaggio mediante ibridazione 162 8.4.4 Metodi di identificazione basati sulla rivelazione del prodotto della traduzione del gene clonato 167 Letture ulteriori 169 Capitolo 9 La reazione a catena della polimerasi 171 9.1 I principi generali della reazione a catena della polimerasi 171 9.2 La PCR in maggiori dettagli 173 9.2.1 Il progetto dei primer oligonucleotidici per una PCR 174 9.2.2 Scelta delle temperature corrette 176 9.2.3 Dopo la PCR: studio dei prodotti della PCR 178 9.3 I problemi dovuti alla frequenza di errore della Taq polimerasi 183 Letture ulteriori 184 Parte II Le applicazioni della clonazione dei geni e dell analisi del DNA nella ricerca Capitolo 10 Lo studio della posizione e della struttura dei geni 187 10.1 Il modo in cui si studia la posizione di un gene 187 10.1.1 Individuazione della posizione di un gene su una piccola molecola di DNA 187 10.1.2 Determinazione della posizione di un gene su una grande molecola di DNA 190 10.2 Il sequenziamento del DNA la definizione della struttura di un gene 193 10.2.1 Il metodo di Sanger-Coulson nucleotidi che terminano la catena 194 10.2.2 Sequenziamento automatizzato del DNA 198

6746 BROWN Iniziali I-XIV 13-04-2007 11:57 Pagina XI Indice XI 10.2.3 Sequenziamento dei prodotti della PCR 199 10.2.4 Il metodo di Maxam-Gilbert degradazione chimica del DNA 201 10.2.5 Costruzione di una lunga sequenza di DNA 203 10.2.6 I risultati ottenuti con il sequenziamento del DNA 204 Letture ulteriori 205 Capitolo 11 Studio dell espressione e della funzione dei geni 206 11.1 Studio del trascritto di un gene clonato 207 11.1.1 Microscopia elettronica di molecole di acidi nucleici 207 11.1.2 Analisi degli ibridi DNA-RNA mediante trattamento con nucleasi 208 11.1.3 Analisi del trascritto mediante estensione del primer 210 11.1.4 Altre tecniche per lo studio dei trascritti di RNA 212 11.2 Studio della regolazione dell espressione genica 214 11.2.1 Identificazione dei siti di legame di proteine su una molecola di DNA 215 11.2.2 Identificazione delle sequenze di controllo mediante analisi delle delezioni 220 11.3 Identificazione e studio del prodotto della traduzione di un gene clonato 223 11.3.1 HRT e HART possono identificare il prodotto della traduzione di un gene clonato 224 11.3.2 Analisi delle proteine mediante mutagenesi in vitro 225 11.3.3 Studio delle interazioni proteina-proteina 232 Letture ulteriori 235 Capitolo 12 Lo studio dei genomi 236 12.1 La genomica il modo in cui si sequenzia un genoma 236 12.1.1 L approccio a shotgun al sequenziamento del genoma 238 12.1.2 L approccio dei contig di cloni 241 12.1.3 Uso di una mappa per assistere l assemblaggio della sequenza 244 12.2 La postgenomica il tentativo di comprendere una sequenza genomica 248 12.2.1 Identificazione dei geni in una sequenza genomica 248 12.2.2 Determinazione della funzione di un gene sconosciuto 251 12.3 Lo studio del trascrittoma e del proteoma 252 12.3.1 Lo studio del trascrittoma 252 12.3.2 Lo studio del proteoma 254 Letture ulteriori 257 Parte III Le applicazioni della clonazione dei geni e dell analisi del DNA in biotecnologia Capitolo 13 Produzione di proteine a partire da geni clonati 261 13.1 Vettori speciali per l espressione di geni estranei in E. coli 263 13.1.1 Il promotore è il componente cruciale di un vettore di espressione 265 13.1.2 Cassette e fusioni di geni 269 13.2 Problemi generali inerenti alla produzione di proteine ricombinanti in E. coli 272

6746 BROWN Iniziali I-XIV 13-04-2007 11:57 Pagina XII XII Indice 13.2.1 Problemi derivanti dalla sequenza del gene estraneo 272 13.2.2 Problemi causati da E. coli 274 13.3 Produzione di proteine ricombinanti in cellule eucariotiche 275 13.3.1 Proteine ricombinanti da lievito e funghi filamentosi 275 13.3.2 Uso di cellule animali per la produzione di proteine ricombinanti 278 13.3.3 Pharming proteine ricombinanti da animali e vegetali vivi 279 Letture ulteriori 283 Capitolo 14 Clonazione di geni e analisi del DNA in medicina 284 14.1 Produzione di farmaci ricombinanti 284 14.1.1 Insulina ricombinante 284 14.1.2 Sintesi degli ormoni umani della crescita in E. coli 287 14.1.3 Fattore VIII ricombinante 289 14.1.4 Sintesi di altre proteine ricombinanti umane 290 14.1.5 Vaccini ricombinanti 291 14.2 Identificazione di geni responsabili di malattie umane 295 14.2.1 Identificazione di un gene di una malattia genetica 296 14.3 Terapia genica 299 14.3.1 Terapia genica di malattie ereditarie 299 14.3.2 Terapia genica e cancro 301 14.3.3 I problemi etici sollevati dalla terapia genica 302 Letture ulteriori 302 Capitolo 15 Clonazione dei geni e analisi del DNA in agricoltura 304 15.1 L approccio dell aggiunta di geni all ingegneria genetica delle piante 304 15.1.1 Piante che producono i propri insetticidi 305 15.1.2 Piante resistenti agli erbicidi 311 15.1.3 Altri progetti di aggiunta di geni 314 15.2 Sottrazione di geni 314 15.2.1 Il principio alla base della tecnologia antisenso 315 15.2.2 RNA antisenso e ingegnerizzazione della maturazione dei pomodori 316 15.2.3 Altri esempi dell uso di RNA antisenso nell ingegneria genetica delle piante 320 15.3 I problemi delle piante modificate geneticamente 321 15.3.1 Problemi di sicurezza con i marcatori selezionabili 321 15.3.2 La tecnologia del terminatore 322 15.3.3 La possibilità di effetti dannosi sull ambiente 323 Letture ulteriori 324 Capitolo 16 Clonazione dei geni e analisi del DNA in medicina legale e archeologia 236 16.1 L analisi del DNA nell identificazione di sospetti criminali 326 16.1.1 Fingerprinting genetico mediante sondaggio di ibridazione 327 16.1.2 Determinazione del profilo del DNA mediante PCR di brevi ripetizioni in tandem 328

6746 BROWN Iniziali I-XIV 13-04-2007 11:57 Pagina XIII 1. L importanza della clonazione dei geni e dell analisi del DNA XIII 16.2 Studi delle relazioni di parentela mediante determinazione del profilo del DNA 329 16.2.1 Individui correlati hanno profili di DNA simili 330 16.2.2 Determinazione del profilo del DNA e le spoglie dei Romanov 330 16.3 Identificazione del sesso mediante analisi del DNA 332 16.3.1 PCR dirette a sequenze specifiche del cromosoma Y 333 16.3.2 PCR del gene della amelogenina 334 16.4 Archeogenetica uso del DNA per lo studio dell evoluzione umana 335 16.4.1 Le origini degli esseri umani moderni 335 16.4.2 Il DNA può essere usato anche per studiare le migrazioni degli esseri umani nella preistoria 338 Letture ulteriori 340 Glossario 343 Indice analitico 357