Societa Italiana di Genetica Umana MALFORMAZIONI CARDIACHE PRIMA E DOPO LA NASCITA: SINERGIA TRA CLINICA E DIAGNOSI GENETICA VERSO UN COUNSELLING EFFICACE Cosa puo dirci il Laboratorio? Corso post congressuale Antonio Novelli Roma, 28 settembre 2013
Consulenza PRE-TEST ANALISI di LABORATORIO e MEDICHE Consulenza POST-TEST
Parlando di DP bisogna rispondere a due domande: COME fare DP? Quando fare DP?
COME fare DP? Screening per anomalie cromosomiche su siero materno marker biochimici di origine fetale e placentare Diagnosi ecografica delle malformazioni fetali Diagnosi biochimica,molecolare e citogenetica effettuata su prelievo di villi coriali,amniocentesi, cordocentesi o altri tessuti Diagnosi Preimpianto Diagnosi Fetale su sangue periferico materno
Indicazioni alla diagnosi prenatale QUANDO fare DP? Eta materna > 35 anni (l'aumento del rischio di aneuploidie cromosomiche correla con l'età materna) Genitori con precedente figlio affetto da aneuploidia (rischio di ricorrenza circa 1%) Genitori eterozigoti per anomalie cromosomiche bilanciate (aumento del rischio di concepimenti sbilanciati) Anamnesi familiare positiva per patologia cromosomica (analisi del cariotipo su sangue del genitore a rischio) Anamnesi familiare positiva per malformazioni congenite Evidenza ecografica di malformazioni fetali Alterazioni biochimiche nella madre (aumento dei valori di gonadotropina corionica, riduzione dell'alfafetoproteina e dell'estriolo non coniugato predicono nel Triplo-test il 70% delle gravidanze con feto affetto da trisomia 21; >NT+free-beta hcg+papp-a predicono nel Bitest l 80-85% delle gravidanze con feto affetto da trisomia 18 o 21 ) Malattie mendeliane (analisi del DNA su villi coriali)
Le cardiopatie congenite hanno una prevalenza di 5-8/1000 nati Anomalia cromosomica % di CHD Tipo di CHD le malattie genetiche potenzialmente associate a cardiopatie congenite sono migliaia Trisomia 21 50% CAV, DIV, TF, DIA CoA Trisomia 18 100% DIV, VDDU, TOF, CSI la diagnosi prenatale è possibile per quelle poche per le quali è stato identificato il gene responsabile dell anomalia Trisomia 13 80% DIA, DIV, StAo, StPol Delezione 22q 95% TF, TA, IAA Trisomia parziale 22q 60% DIA, DIV, DAP E nota l associazione tra anomalie congenite del cuore e alterazioni dell assetto cromosomico Trisomia 9 80% DIV Trisomia 8 25% DIV Turner (monosomia X) 35% CoA, CSI, StAo, StMit Triploidia 50% DIV, DIA, DAP Delezione 4p 30% Stpol DIA Delezione 5p 40% DIA, StPol, DIV Klinefelter XXY 50% Insufficienza Mitralica CAV: canale atrioventricolare; DIV: difetto del setto ventricolare; TF: tetralogia di Fallot; DIA: difetto del setto atriale; CoA: coartazione aortica; VDDU:ventricolo destro a doppia uscita; CSI:cuore sinistro ipoplasico; StAo: stenosi aortica; StPol: stenosi della polmonare; IAA:interruzione dell arco aortico; TA: tronco arterioso; DAP: dotto arterioso pervio; StMit:stenosi della mitrale
Risoluzione cromosomica 400 550 800 bande differente RISOLUZIONE citogenetica
Il cariotipo: una sola analisi per diverse patologie
DALLA CITOGENETICA CLASSICA ALLA CITOGENETICA MOLECOLARE Risoluzione mediante bandeggio FISH ~3-10Mb ~40-100kb Visione d insieme dell intero genoma, ma bassa risoluzione Aumenta la risoluzione, ma l analisi diventa locus- specifica
Quando utilizzare tecniche di citogenetica molecolare Per ampliare il numero delle cellule analizzate in caso di mosaicismo sui nuclei in interfase) Per definire la ploidia sugli amniociti non coltivati Per definire la natura di un extra cromosoma Per definire lo stato di metilazione di un marcatore (ad es. piccolo X ad anello) Per analizzare la segregazione di un riarrangiamento criptico Per caratterizzare un anomalia di struttura, dopo avere studiato i genitori
ESAC autosomico ad anello 47,XY,r(9)
DP: approccio locus-specifico - anomalia ecoevidenziata Tetralogia di Fallot Delezione 22q11.2 cariotipo Sindrome Di George / Velocardiofaciale Tetralogia di Fallot con atresia della polmonare 27% Tetralogia di Fallot classica 26%
E(RI)VOLUZIONE DELLA CITOGENETICA: DAL CROMOSOMA ALL ARRAY 10 Mb Visione d insieme dell intero genoma, ma bassa risoluzione 40-100Kb Aumenta la risoluzione, ma l analisi diventa locus-specifica Array-CGH: Alta risoluzione (10-12Kb) e analisi dell intero genoma in un unico esperimento
CGH -ARRAY si basa sul principio della ibridazione competitiva di due campioni di DNA della stessa specie marcati con fluorocromi diversi, utilizzando come base di riferimento migliaia di sequenze di DNA (spot) ordinatamente fissate su un vetrino (microarray). Per ogni cromosoma i rapporti di fluorescenza vengono trasformati su scala logaritmica e visualizzati su un grafico rispetto alla posizione sul cromosoma. DNAt DNAc valore = 0 normale valore < 0 delezione valore > 0 duplicazione DUPLICAZIONE DELEZIONE
Quali test rapidi oggi.. 3 metodi FISH QF-PCR MLPA
QF-PCR Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) è una tecnica semplice e rapida che consente la diagnosi molecolare delle aneuploidie più comuni (trisomia 21, 13, 18 e aneuploidie dei cromosomi sessuali) Questo tipo di approccio non richiede colture cellulari: la diagnosi può essere completata in <12h Il metodo si basa sull'amplificazione di brevi sequenze del DNA che contengono blocchi ripetuti di 2-6 basi (marcatori STRs). Queste sequenze sono specifiche per il cromosoma che si intende analizzare. Usando marcatori per i cromosomi 21, 13, 18, X e Y è possibile diagnosticare le aneuploidie più frequenti.
Test rapidi in diagnosi prenatale Vantaggi Svantaggi Tempi rapidi di risposta Risultato entro 24-48h Il rischio di falsi positivi e falsi negativi riportato in letteratura è basso E necessario poco materiale di partenza QF-PCR è meno costosa e laboriosa della FISH e della citogenetica classica QF-PCR può essere automatizzata La QF-PCR può essere eseguita anche se nel campione è presente una certa contaminazione da sangue materno Identificano solo le aneuploidie dei cromosomi in analisi Non è in grado di diagnosticare traslocazioni e delezioni La contaminazione con DNA materno può rappresentare un problema La presenza di mosaicismo fetale è un problema La FISH non si può eseguire se è presente una piccola contaminazione da sangue materno
Utilizzo del BACs On Beads in Diagnosi Prenatale:
Prenatal BACs On Beads (BoBs) Permette di individuare le più comuni aneuploidie Permette di indagare 9 regioni associate a Sindromi da microdelezione, scelte in base a: Incidenza Mortalità e morbidità Assenza di segni ecografici o anomalie specifiche Chiara correlazione genotipo-fenotipo (non riguarda le duplicazioni) Meccanismo prevalente: delezione
Cosa sono Prenatal Bacs On Beads è una nuova tecnologia in grado di fornire risultati preliminari riguardo la presenza di aneuploidie dei cromosomi 13, 18,21, X e Y Rispetto alla QF-PCR permette di indagare anche 9 regioni associate a sindrome da microdelezione In pochi casi particolari può individuare monosomie/trisomie parziali in relazione alla copertutra BAC della specifica regione Utile anche in epoca neonatale se si dispone di esigue quantià di sangue E' importante considerare che tale tecnica non può individuare: Poliploidie Contaminazione materna (attenzione con liquidi amniotici ematici, villi e materiali abortivi)
Vantaggi: Tecnica rapida e semplice Colture cellulari non necessarie Resultati ottenibili in 24 ore Possibilità di individuare mosaicismi > 30% Interpretazione semplice e univoca Poco DNA di partenza (240 ng) Limiti: Non permette il riscontro di contaminazione materna Non permette di individuare triploidie Non fornisce informazioni riguardo a regioni non coperte Non permette l'individuazione di mosaicismi < 30%
In questa ottica il Prenatal BoBs può essere considerato in una posizione intermedia tra FISH e CGH-array targeted
Quando il cariotipo non ce la fa
Array-CGH Vantaggi Non ha bisogno di coltura cellulare Capacità di analizzare l intero genoma in un esperimento Elevata specificità, sensibilità e risoluzione Rapidità Svantaggi Incapacità di rilevare riarrangiamenti bilanciati e poliploidie Limitata abilità di individuare mosaicismi. Presenza di polimorfismi del numero di copie (CNV), di difficile interpretazione
Una rivoluzione in corso Array da 1 milione di SNPs
Crescita esponenziale delle malattie genomiche nella patologia umana Stevenson et al, Am J Med Genet 123A: 29-32, 2003
UTILIZZO DEI MICROARRAY GENOMICI Possibilità di individuare sbilanciamenti di piccole dimensioni (poche Kb). CNVs: Segmenti di DNA maggiori di 1 kb che variano per numero di copie da individuo a individuo Ruolo delle CNVs (Copy Number Variations) in: Variazioni fenotipiche Patogenesi di un ampio spettro di patologie umane mendeliane e multigeniche
Risoluzione: dipende dalla grandezza e dal numero delle sonde utilizzate Aumentare la risoluzione -> incrementare il numero degli spot e ridurre la lunghezza delle sonde (NON E POSSIBILE SPOTTARE PIU DI 60,000 SEQUENZE) TIPI DI SONDE ARRAY: _ cloni BAC: lunghezza 80-200 kb. Buona copertura, forte segnale di ibridazione _ fosmidi e cosmidi: lunghezza 40 kb _ cloni di cdna: individuazione di CNVs che coprono un singolo gene o parte di esso. Copertura genomica non omogenea _ prodotti di PCR: risoluzione elevata. Segnale di ibridazione debole. Produzione per copertura genomica costosa _ OLIGONUCLEOTIDE-ARRAY: fino a 244,000 sonde DIRETTAMENTE SINTETIZZATE SUL SUBSTRATO SNPs array: Altissima risoluzione. Copertura non omogenea. Possibilita di individuare omodisomie Debole segnale di ibridazione: Necessità di riduzione della complessità genomica tramite PCR
SFIDA MAGGIORE: difficoltà interpretative Come distinguere tra CNV benigna e CNV effettivamente implicata in un fenotipo patologico
1) ESTENSIONE DELLA CNV anche in relazione alla risoluzione della piattaforma utilizzata 2) UTILIZZO DELLE BANCHE DATI (Pubbliche e Private) Valutazione del contenuto genico, confronto con pazienti, confronto con controlli, studio della letteratura 3) VERIFICA DELL INSORGENZA (studi familiari) Valutazione del pattern di insorgenza, valutazione del rischio di ricorrenza, valutazione di sintomi minori 4) VERIFICA DELLA PRESENZA DI RIARRANGIAMENTI STRUTTURALI migliore comprensione della CNV valutazione del rischio di ricorrenza,
Come procedere se la CNV non e descritta né in associazione a fenotipi patologici né come variante benigna? Confermare il dato con altre tecniche (FISH, RT-PCR, MLPA) Verifica della localizzazione di una CNVs (duplicazione in tandem, marker sovrannumerario, inserzione, traslocazione) Verifica del pattern di segregazione
Verifica del pattern di segregazione tenendo conto del fatto che una CNV ereditata non sempre è benigna _ difetti di penetranza ed espressività _ fattori epigenetici _ effetti diversi di CNVs del chr X tra maschi e femmine e tra femmine con pattern di inattivazione della X differenti una CNV insorta de novo non necessariamente e patologica La verifica pattern di segregazione aiuta nell interpretazione di una CNV e permette la valutazione del rischio di ricorrenza
Database Pubblici: UCSC http://genome.ucsc.edu/index.html Ensembl http://www.ensembl.org/index.html Genome browsers Valutazione del contenuto genico e della natura della regione in esame
Database Pubblici: Database of Genomic Variants http://projects.tcag.ca/variation/ Dechipher http://decipher.sanger.ac.uk/ Confronti Fenotipici
Database Pubblici: Pubmed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ OMIM http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim Letteratura scientifica
Database Pubblici Nazionali: Database di Troina (http://dbcnv.oasi.en.it/gvarianti/index.php Dott. M. Fichera) Varianti Popolazione-specifiche Database Interni: confronto con pazienti e controlli interni individuazione di artefatti sperimentali
Cases with Abnormal Ultrasound Findings 2004 2011, 5,003 prenatal cases were analyzed by microarray 2,859 cases had an indication of abnormal ultrasound findings 6.5% of cases with a structural anomaly had an abnormal microarray result 72% (2053/2859) had known normal fetal karyotypes; the remaining cases had concurrent karyotyping. All known abnormal karyotypes were removed Cases of fetal demise were removed to not bias the detection rates
Increased NT Nuchal Translucency Isolated Other findings Total Abnormal < 4mm 1/113 (0.9%) 1/7 (14.3%) 2/120 (1.7%) >4mm 6/96 (6.3%) 2/12 (16.7%) 8/108 (7.4%) Total 10/303 (3.3%) 6/49 (12.2%) 16/352 (4.5%) Detection rates in addition to those found by karyotyping Detection rates in addition to those found by karyotyping
Anomalies in a Single Organ System or Single Anomaly Organ System or Single Anomaly Detection Rate CNS 25/381 (6.6%) Heart 6/237 (2.5%) Facies (dysmorphism) 6/88 (6.8%) Diaphragmatic hernia 4/48 (8.3%) Omphalocele 4/49 (8.2%) Musculoskeletal 18/203 (8.9%) Genitourinary 7/115 (6.1%) Nuchal/other body fluid accumulation 27/628 (4.3%) Detection rates in addition to those found by karyotyping
Anomalies in Isolation or with Multiple Findings Anomaly Detection Rate Holoprosencephaly 9/85 (10.6%) Posterior fossa defects 21/144 (14.6%) Skeletal anomalies 15/140 (10.7%) Ventricular septal defect 14/132 (10.6%) Hypoplastic left heart 11/68 (16.2%) Club feet/hands 19/194 (9.8%) Cleft lip/palate 14/136 (10.3%) Detection rates in addition to those found by karyotyping
SINDROME DI NOONAN: incidenza 1:1000 1:2500 nati vivi Nella maggior parte dei casi dovuta a mutazioni attivanti in geni facenti parte della cascata di segnale RAS/MEPK. Nel 15-30% dei casi con sospetto clinico di sindrome di Noonan, non è possibile riscontrare una mutazione nei geni considerati causativi. Shchelochkov et al (2008) e Graham et al (2009) descrivono pazienti con duplicazioni sul braccio lungo del cromosoma 12, comprendenti PTPN11 (12q24.3). La duplicazione del gene potrebbe avere gli stessi effetti di una mutazione attivante e potrebbe spiegare alcuni dei casi con fenotipo clinico ma senza mutazione di sequenza
Soemedi et al, 2012 confrontano una coorte di 2436 soggetti con anomalie cardiache congenite non sindromi che con un gruppo di riferimento costituito da 1538 controlli, riscontrando un associazione tra delezioni geniche rare e rischio di anomalie cardiache. _ delezioni e duplicazioni in 1q21.1 (soprattutto in casi con tetralogia di fallot) confermando i dati di Greenway _ delezioni in 15q11.2, comprendenti TUGBCP5 e NIPA 1 altamente espressi nel cuore fetale (vedi tabella 5) _ delezioni in 8p23 comprendenti in gene GATA4, fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo cardiaco
individuano con acgh CNV verosimilmente causative nel 5.6% dei casi con anomalie troncoconali o cuore sinistro ipoplastico, su un totale di 223 famiglie studiate. Tra le CNV ricorrenti vengono riscontrate CNV in 8p23 (GATA4), 10q22.1 (NODAL), 1q21.1, 16p13.11, 15q11.2q13, 22q11.2, 2q23.1 Si tratta di studi di associazione con condizioni a espressività altamente variabile soggette a una possibile modulazione sia di tipo ambientale che genica (interazione con altri polimorfismi o mutazioni presenti in altri loci nel genoma)
SFIDA MAGGIORE: difficoltà interpretative Come distinguere tra CNV benigna e CNV effettivamente implicata in un fenotipo patologico
ALTERAZIONE PATOLOGICA MA NON ASSOCIATO AL FENOTIPO RIS ORIGINE Mb START END dup 16p13.12-p13.11 pat 1,5 14,687,665 16,218,541 dup 15q13.2-q13.3 mat 1,7 28,801,829 30,494,145 Locus di suscettibilità all'autismo e r.m. Fenotipo variabile con penetranza incompleta: 21 SG: 46,XX Ecografia: cardiopatia congenita complessa tipo troncoconale: Consulenza:? Variante normale o locus suscettibilita? Gravidanza interrotta per malformazione fetale Eccesso di info 50% di trasmissione prossima gravidanza?
ALTERAZIONE PATOLOGICA MA NON ASSOCIATO AL FENOTIPO RIS ORIGINE Mb START END dup 16p13.12-p13.11 pat 1,5 14,687,665 16,218,541 dup 15q13.2-q13.3 mat 1,7 28,801,829 30,494,145 Locus di sucettibilità alla schizofrenia Fenotipo variabile con penetranza incompleta: 20 SG: 46,XY Ecografia: NT alterata Consulenza:? Variante normale o locus suscettibilita? Informazione non richiesta sulla madre cosa comporta? Insorgeneza tardiva
NEXT-GENERATION SEQUENCING (NGS) È possibile leggere l intero patrimonio genetico di un individuo in un esperimento
POLIMORFISMI COME FATTORI DI RISCHIO Studi di associazione condotti analizzando il genoma di famiglie con anomalie cardiache congenite non sindromiche, hanno dimostrato come la presenza di alcuni SNP possa rappresentare un fattore di rischio. Identificazione di uno specifico aplotipo in posizione 12q24, significativamente associato a Tetralogia di Fallot (Cordell et al. 2013). Un'ipotesi è che l'aplotipo in questione possa essere stato selezionato in maniera positiva nel corso dell'evoluzione in quanto verosimilmente associato ad un'aumentata resistenza alle infezioni La regione 12q24 è già stata precedentemente associata ad un aumentato rischio di tetralogia di Fallot, dopo l'identificazione di un polimorfismo SNP nel gene PTPN11 (Goodship et al 2012), responsabile della sindrome di Noonan se soggetto a mutazioni attivanti.
Cordell et al (2013) descrivono uno SNP nella regione 4p16 (in prossimità dei geni MSX1 e STX18) in associazione ad un rischio aumentato di difetto interatriale tipo ostium secundum
Analizzare il genoma di un soggetto e oggi di fatto possibile con una definizione inimmaginabile fino a pochi anni fa dispositivi che permettono di esaminare in un unico esperimento e rapidamente le variazioni del numero di copie di tutti i loci genici (CNV) sino a comprendere ogni lettera dell intero patrimonio ereditario di un individuo (whole-genome sequencing). queste rivelazioni hanno permesso di accorciare la distanza tra l analisi del genetista molecolare (analisi dei geni) e quella del citogenetista (analisi dei cromosomi) portando il genetista verso un analisi genomica.
C O R E C O M P E T E N C E S Cytogeneticist 1. Work independently in the cytogenetic laboratory. 2. Work proficiently in the cultivation of cells for both prenatal and postnatal chromosomal examination, processing of cells, preparation of slides and karyotyping. 3.Interpret the results of cytogenetic and molecular cytogenetic findings. 4.Provide information to health care professionals based on both the results and interpretation of the results. 5. Participate in clinical research and in the introduction of new methods.
Lo scenario futuro Il genoma umano è stato in pratica decifrato Le nanotecnologie potranno consentire lo studio di decine di migliaia di geni La diagnosi prenatale potrà essere disponibile per tutte le malattie genetiche
Medicina Genetica
Take Home Message Un analisi genetica deve essere INTEGRATA in una consulenza genetica e NON essere un test di laboratorio
conclusioni Un test di laboratorio deve essere sottoposto ad una valutazione clinica prima di venire trasferito nella pratica. ogni test medico viene definito in base ad alcune caratteristiche, tra le quali sensibilità, specificità, valore predittivo positivo e negativo.- non esiste un test migliore: esiste il test appropriato per la specifica condizione clinica, discussa dal paziente e dal medico nell ambito di ogni singola e specifica situazione. Nel caso dei test genetici la consulenza genetica deve essere inserita nel percorso diagnostico.
Grazie!