IV CONVEGNO DEGLI ISTITUTI ZOOPROFILATTICI SPERIMENTALI SULL ALIMENTAZIONE UMANA TUTTO SULLE MICOTOSSINE I CONTROLLI DEI LABORATORI UFFICIALI: L ESPERIENZA DELL ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA PUGLIA E DELLA BASILICATA dott. A. Eugenio Chiaravalle Struttura Complessa Chimica IZS-PB TORINO 11 Novembre 2011 Lingotto Fiere
Composto da: Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Una Sede Centrale a Foggia Sei strutture periferiche, denominate Sezioni diagnostiche provinciali : - Torre S. Susanna (BR) - Campi Salentina (LE) - Matera - Tito Scalo (PZ) - Taranto - Putignano (BA)
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata DIREZIONE DIREZIONE DIREZIONE QUALITA - SICUREZZA -FORMAZIONE QUALITA - SICUREZZA -FORMAZIONE OSSERVATORIO EPIDEMIOLOGICO OSSERVATORIO EPIDEMIOLOGICO MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI DIAGNOSTICA DIAGNOSTICA VIROLOGIA VIROLOGIA TARANTO TARANTO PUTIGNANO PUTIGNANO AMMINISTRAZIONE AMMINISTRAZIONE CHIMICA CHIMICA BIOTECNOLOGIE E VACCINI BIOTECNOLOGIE E VACCINI SIEROLOGIA SIEROLOGIA LECCE LECCE BRINDISI BRINDISI POTENZA POTENZA MATERA MATERA
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Struttura Complessa Chimica E organizzata in sei strutture semplici: Struttura Semplice CNR Radioattività Struttura Semplice Anabolizzanti e Pesticidi Struttura Semplice Farmaci e Tossicologia Struttura Semplice Analisi bromatologiche, biotossine e farine animali Struttura Semplice Micotossine e Tecniche Immunoenzimatiche Struttura Semplice Metalli Pesanti e Mangimi
PRINCIPALI ATTIVITA Piano Nazionale Residui - PNR Piano Nazionale Alimentazione Animale PNAA Piano Alimenti Ricerca e controllo Biotossine Algali nei prodotti ittici Ricerca e controllo delle Micotossine Ricerca e controllo dei contaminanti negli alimenti di origine non animale (vegetali) Ricerca e controllo di additivi e conservanti negli alimenti Ricerca e controllo della radioattività negli alimenti
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata Struttura Complessa Chimica Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca della Radioattività nel Settore Zootecnico-Veterinario Istituito con Decreto del Ministero della Salute del 27 agosto 2004 (G.U. N 43 del 22 febbraio 2005).
Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca della Radioattività nel Settore Zootecnico-Veterinario (D.M. 27 Agosto 2004) Settori di attività Controlli Radiometrici e ricerca di alimenti irradiati Progetti di ricerca e programmi di interconfronto Indagini epidemiologiche e piani di monitoraggio Attività di informazione formazione e consulenza
Food irradiation: metodi analitici validati IN FASE DI ACCREDITAMENTO
I CONTROLLI UFFICIALI SULLE MICOTOSSINE Metodi di screening: Tecniche immunoenzimatiche Metodi di conferma: HPLC
CORRETTE MODALITÀ DI CAMPIONAMENTO (Reg. CE n. 401/2006 e s.m.i.)
CORRETTE MODALITÀ DI CAMPIONAMENTO (Reg. CE n. 401/2006 e s.m.i.) Nelle pratiche routinarie, le aliquote sono solitamente inferiori ai 100 kg. In questi casi devono essere preparati 10 campioni di cui uno destinato all analisi. Se il campione globale è di peso inferiore a 20 kg, si procede nel seguente modo: < 12 kg: nessuna suddivisione in campioni di laboratorio; 12 kg: suddivisione in due campioni di laboratorio. Per rendere omogeneo tale campione si effettua una corretta macinazione.
CORRETTE MODALITÀ DI MACINAZIONE
MACINAZIONE A SECCO
MACINAZIONE A SECCO
RISULTATI FINALI
MACINAZIONE A SECCO
MACINAZIONE A SECCO
MACINAZIONE IN UMIDO
SGUSCIATRICE
GRATTUGGIATRICE FRUTTA SECCA La capacità varia da 25 80 kg/h a seconda del disco e del prodotto utilizzato
I METODI DI SCREENING ELISA Metodi interni di prova validati ed accreditati per le determinazioni di: Aflatossine B e G; Aflatossina M1; Ocratossina A; Zearalenone; Deossinivalenolo; Fumonisine B1 e B2.
VALIDAZIONE METODI DI SCREENING ELISA (Reg. CE n.401/2006) Metodi quantitativi di screening: Precisione Robustezza Specificità Verifica CCβ
METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELLE AFLATOSSINE TOTALI NEI MANGIMI E NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA Campo di misura (µg/kg in matrice): 0.5 8.0 CCβ: 0.5 µg/kg in matrice Recupero medio: 81.0% Precisione intermedia: CV% = 4.6%
METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELL AFLATOSSINA M1 NEL LATTE Campo di misura (µg/l in matrice): 0.005 0.08 CCβ: 0.005 µg/l in matrice Recupero medio: 102.0% Precisione intermedia: CV% = 9.5%
METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELL OCRATOSSINA A NEI MANGIMI E NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA PARAMETRO DI VALIDAZIONE MANGIMI ALIMENTAZIONE UMANA Campo di misura (µg/kg in matrice) CCβ (µg/kg in matrice) 0.012 0.450 1.25 45.00 0.012 1.25 Recupero medio 106.0% 82.0% Precisione intermedia: (CV%) 5.0% 5.5%
METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DI ZEARALENONE NEI MANGIMI E NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA PARAMETRO DI VALIDAZIONE MANGIMI ALIMENTAZIONE UMANA Campo di misura (mg/kg in matrice) CCβ (µg/kg in matrice) 0.008 0.700 0.0035 0.2800 0.008 0.0035 Recupero medio 96.8% 86.0% Precisione intermedia: (CV%) 13.0% 15.0%
METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DEL DEOSSINIVALENOLO NEI MANGIMI E NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA PARAMETRO DI VALIDAZIONE MANGIMI ALIMENTAZIONE UMANA Campo di misura (mg/kg in matrice) CCβ (mg/kg in matrice) 0.55 15.00 0.09 2.50 0.55 0.09 Recupero medio 91.0% 89.4% Precisione intermedia: (CV%) 10.6% 7.4%
METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELLE FUMONISINE NEI MANGIMI E NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA PARAMETRO DI VALIDAZIONE MANGIMI ALIMENTAZIONE UMANA Campo di misura (mg/kg in matrice) CCβ (mg/kg in matrice) 0.2 20.0 0.2 20.0 0.2 0.2 Recupero medio 117.0% 104.0% Precisione intermedia: (CV%) 4.0% 4.0%
I METODI DI CONFERMA HPLC/FLD Metodi interni di prova validati per la determinazione di: Aflatossine B e G (acceditato); Aflatossina M1 (accreditato); Fumonisine B1 e B2 (in corso di accreditamento); Deossinivalenolo e Nivalenolo (in corso di accreditamento).
VALIDAZIONE METODI DI CONFERMA HPLC/FLD (Dec. 657/2002/CE) Parametri di validazione: Linearità strumentale; Specificità; LOD e LOQ; Precisione (CV%); Recupero %; Robustezza; Incertezza di misura.
METODO INTERNO ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELLE AFLATOSSINE TOTALI (B1, B2, G1, G2) NEI CEREALI E NELLA FRUTTA A GUSCIO MEDIANTE HPLC/FLD CON DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA POST-COLONNA Validato secondo la Decisione 657/2002/CE Campo d applicazione: Grano, Mandorle, Pistacchi. AFLATOSSINA CAMPO DI MISURA (µg/kg in matrice) LOQ (µg/kg in matrice) Incertezza di misura: 13.1% RECUPERO MEDIO PRECISIONE INTERMEDIA (CV%) B1 0.22 4.00 0.22 84% 4.9% B2 0.08 1.00 0.08 86% 9.1% G1 0.48 4.00 0.48 88% 7.7% G2 0.10 1.00 0.10 86% 8.8%
METODO INTERNO ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELL AFLATOSSINA B1 NELLE MATERIE PRIME PER MANGIMI MEDIANTE HPLC/FLD CON DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA POST-COLONNA Validato secondo la Decisione 657/2002/CE Campo d applicazione: Grano, Avena, Mais. AFLATOSSINA CAMPO DI MISURA (µg/kg in matrice) LOQ (µg/kg in matrice) RECUPERO MEDIO PRECISIONE INTERMEDIA (CV%) B1 5.8 40.0 5.8 74% 7.0% Incertezza di misura: 8.8%
LA DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA Le procedure di conferma sfruttano la rivelazione fluorimetrica accoppiata ad opportune reazioni di derivatizzazione post-colonna. Nel caso delle Aflatossine viene impiegata la derivatizzazione fotochimica. Le Aflatossine B1 e G1 non sono naturalmente fluorescenti, grazie a questa reazione possono emettere in fluorescenza.
LA DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA
LA DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA B2 Senza G2 derivatizzazione G1 B1 B1 G1 B2 Con derivatizzazione G2
ANALISI DELLE AFLATOSSINE CON DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA POST-COLONNA
I VANTAGGI DELLA DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA ON-LINE POST-COLONNA La possibilità di lavorare in modo automatizzato, grazie al derivatizzatore fotochimico on-line, permette di aumentare notevolmente la riproducibilità dell analisi, semplificando inoltre la fase di pre-trattamento del campione; La derivatizzazione effettuata post-colonna rende notevolmente più ripetibili i t.r. degli analiti rispetto a quando viene effettuata pre-colonna. Muscarella, M; Iammarino, M; Nardiello, D; Lo Magro, S; Palermo, C; Centonze, D; Palermo, D. (2009).Validation of a confirmatory analytical method for the determination of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in foods and feed materials by HPLC with on-line photochemical derivatization and fluorescence detection. Food Addit. Contam. 26:1402-10.
METODO INTERNO PER LA DETERMINAZIONE DELL AFLATOSSINA M1 NEL LATTE MEDIANTE HPLC Campo d applicazione: Latte Validato secondo la Decisione 657/2002/CE Campo di misura: 0.015 10.0 µg/kg in matrice Limite di rivelabilità: 0.015 µg/kg in matrice Recupero medio: 91.3% Precisione intermedia: CV% = 10.0% Incertezza di misura: 7% Muscarella, M; Lo Magro S.; Palermo, C.; Centonze, D. (2007). Validation according to European Commission Decision 2002/657/EC of a confirmatory method for aflatoxin M1 in milk based on immunoaffinity columns and high performance liquid chromatography with fluorescence detection. Anal. Chim. Acta 594:257-64.
ANALISI DI CONFERMA PER AFLATOSSINA M1 CAMPIONE DI LATTE CONTAMINATO (AFLATOSSINA M1 =0.158 µg/l)
METODO INTERNO PER LA DETERMINAZIONE DELLE FUMONISINE B1 E B2 NEI PRODOTTI ALIMENTARI MEDIANTE HPLC/FLD CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA Validato secondo la Decisione 657/2002/CE Campo d applicazione: Grano, Avena, Mais. FUMONISINA CAMPO DI MISURA (µg/kg in matrice) LOQ (µg/kg in matrice) RECUPERO PRECISIONE MEDIO INTERMEDIA (CV%) B1 16 384 16 85% 4.1% B2 20 384 20 71% 4.7%
LA DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA Per le fumonisine è stata sfruttata la possibilità di derivatizzare chimicamente la funzione amminica primaria presente in questi composti mediante reazione con una miscela di agenti derivatizzanti composta da o-ftalaldeiede (OPA) e N,N-dimetil-2-mercaptoetilammina (Thiofuor ). HOOC COOH OPA CHO O O O O R OH OH NH 2 N CHO SH N N S OH FB HOOC COOH Thiofluor TM FB
ANALISI DELLE FUMONISINE CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA
ANALISI DI CONFERMA PER FUMONISINE Campione di farina di mais contaminato (FB1+FB2 = 169 µg/kg)
METODO INTERNO PER LA DETERMINAZIONE DI DEOSSINIVALENOLO E NIVALENOLO NEL GRANO E NEL MAIS MEDIANTE HPLC/FLD CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA Validato secondo la Decisione 657/2002/CE Campo d applicazione: Grano, Mais. MICOTOSSINA CAMPO DI MISURA LOQ (µg/kg in matrice) RECUPERO MEDIO PRECISIONE INTERMEDIA (µg/kg in matrice) (CV%) DON 47 384.0 47 99% 6.9% NIV 37 384.0 37 92% 7.9% Muscarella, M.; Lo Magro, S.; Nardiello, D.; Palermo, C.; Centonze. D. (2008) Development of a new analytical method for the determination of fumonisins B1 and B2 in food products based on high performance liquid chromatography and fluorimetric detection with post-column derivatization. J. Chromatogr. A 1203:88-93.
LA DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA Per deossinivalenolo e Nivalenolo è stata impiegata una derivatizzazione chimica post-colonna a 2 step. Nella prima fase, il DON e NIV, a caldo ed in soluzione alcalina, si frammentano formando vari sottoprodotti, con rilascio di formaldeide. H 3 C O OH 115 C H 3 C O OH 115 C O CH 3 CH 2 OH OH O R OH - HO CH 3 CH 2 OH OH O R OH - O + P.D. DON (R = H) NIV (R = OH)
LA DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA Nella seconda camera di reazione, la formaldeide generata reagisce con metilacetoacetato ed ammonioacetato, producendo un derivato diipropiridinico fluorescente, secondo la reazione di Hantzsch. O O O O O O O O O O O O NH 3 O NH 2 N
ANALISI DI DEOSSINIVALENOLO E NIVALENOLO NEL GRANO E NEL MAIS CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA
ANALISI DI CONFERMA PER DEOSSISINIVALENOLO E NIVALENOLO Segnale / L.U. 4 2 0 (b) (a) N IV D O N 0 5 10 15 20 T em po / m in Campione di grano fortificato con 1.75 mg/kg di DON e NIV
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI I metodi di conferma HPLC per la determinazione di micotossine nei prodotti per alimentazione umana ed animale sono stati inseriti nel volume: MICROBIAL TOXINS A cura di: Otto Holst Editore: Humana Press Inc. Collana: Methods in Molecular Biology Inoltre sono disponibili, in lingua italiana, sul numero di Febbraio 2011 della rivista Laboratorio2000.
ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA PUGLIA E DELLA BASILICATA STRUTTURA COMPLESSA CHIMICA TOTALE CAMPIONI ANALIZZATI PER LA RICERCA DI MICOTOSSINE 200 150 243 177 ANNO 2009 (n. 1004) 186 172 221 163 147 148 100 50 0 66 1 Aflatossina B1 Aflatossine totali Deossinivalenolo 86 82 4 Ocratossina A 23 Fumonisine 25 12 5 7 83 55 28 T2 Vomitossina Aflatossina M1 73 Assente Presente ma conforme
N. Campioni 200 150 100 50 0 ATTIVITÀ ANNO 2009 MANGIMI (n.938) 236 171 181 65 21 25 170 9 171 85 4 160 146 83 28 161 81 9 7 5 55 Presente ma conforme Assente Aflatossina B1 Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A T2 Vomitossina Zearalenone
6 4 2 0 2 1 1 1 1 ATTIVITÁ ANNO 2009 (n.10) 5 1 4 250 4 1 2 2 Presente ma conforme Assente - - Aflatossina B1 Aflatossine totali Ocratossina A CEREALI AD USO UMANO (n.6) ALTRO 200 150 100 50 0 LATTE E DERIVATI (n.221) 73 148 Aflatossina M1 Ocratossina A Zearalenone - Aflatossina B1 Deossinivalenolo Fumonisine
N. Campioni 6 4 2 0 ATTIVITÀ ANNO 2009 CAMPIONI DI PROVENIENZA ESTERA 5 MANGIMI (n.11) LATTE E DERIVATI (n.4) 2 3 1 3 CEREALI AD USO UMANO (n.1) 1 1 1 1 3 ALTRO (n.2) 2 Presente ma conforme Assente Aflatossina B1 Fumonisine Ocratossina A Vomitossina Zearalenone - - Aflatossina B1 - - Aflatossina M1 - - Ocratossina A
ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA PUGLIA E DELLA BASILICATA STRUTTURA COMPLESSA CHIMICA TOTALE CAMPIONI ANALIZZATI PER LA RICERCA DI MICOTOSSINE 250 200 194 191 223 179 ANNO 2010 (n. 1172) 235 203 150 100 50 102 0 Aflatossina B1 1 Aflatossine totali 36 27 9 Deossinivalenolo 44 Ocratossina A 32 197 114 Fumonisine 83 10 6 4 T2 Aflatossina M1 187 110 76 1 Assente Presente ma conforme Non conforme
ANNO 2010 MANGIMI (n.945) N. Campioni 300 250 200 150 100 50 0 Aflatossina B1 235 1 172 172 182 173 17 172 24 30 76 148 165 143 62 96 10 4 6 Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A T2 Zearalenone Non conforme (1) Presente ma conforme Assente
N. Campioni 70 60 50 40 30 20 10 0 ATTIVITÁ ANNO 2010 CEREALI AD USO UMANO (n.271) 250 18 37 9 25 20 31 7 38 18 15 15 38 Non conforme Presente ma conforme Assente ALTRO 3 1 (n.7) 2 1 200 150 100 50 0 LATTE E DERIVATI (n.187) 1 76 110 Aflatossina M1 55 51 53 53 34 25 Fumonisine Ocratossina A Zearalenone - - Aflatossina B1 Aflatossine totali Ocratossina A Aflatossina B1 Aflatossine totali Deossinivalenolo
N. Campioni ATTIVITÀ ANNO 2010 CAMPIONI DI PROVENIENZA ESTERA CEREALI AD USO UMANO (n.256) 50 52 48 50 50 40 30 16 34 9 20 22 14 15 Presente ma conforme Assente 20 10 0 MANGIMI 1 4 (n.13) 1 1 5 1 36 25 28 7 36 15 35 LATTE E DERIVATI (n.4) 1 3 ALTRO 2 (n.2) Aflatossina B1 Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A Zearalenone - Aflatossina - B1 Aflatossine totali Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A Zearalenone Aflatossina M1 - - Ocratossina - A
ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA PUGLIA E DELLA BASILICATA STRUTTURA COMPLESSA CHIMICA TOTALE CAMPIONI ANALIZZATI PER LA RICERCA DI MICOTOSSINE 200 150 100 50 0 94 Aflatossina B1 241 146 Aflatossine totali 30 18 12 1 Deossinivalenolo 198 100 98 Ocratossina A ANNO 2011 (n. 978) 197 132 63 2 Fumonisine 153 80 73 11 8 3 T2 Aflatossina M1 148 93 55 Assente Presente ma conforme Non conforme
ANNO 2011 MANGIMI (n.809) N. Campioni 300 250 200 150 100 50 0 Aflatossina B1 197 2 125 70 Deossinivalenolo 140 142 76 74 Fumonisine 67 75 164 46 118 11 3 8 Ocratossina A T2 Zearalenone 144 74 70 Non conforme (2) Presente ma conforme Assente
N. Campioni 70 60 50 40 30 20 10 0 1 21 24 20 12 26 18 6 5 ANNO 2011 2 17 11 24 30 Zearalenone CEREALI AD USO UMANO Non conforme (3) Presente ma conforme Assente 250 200 150 100 50 0 LATTE E DERIVATI 50 55 93 1 Aflatossina M1 Aflatossine totali Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A Aflatossina B1
N. Campioni RISULTATI 2011 CAMPIONI DI PROVENIENZA ESTERA 50 40 30 20 10 0 2 6 24 6 2 8 CEREALI AD USO UMANO 37 1 16 29 12 189 39 16 MANGIMI 27 LATTE E 20 23 19 DERIVATI 17 9 2 39 34 20 7 3 15 14 11 3 Non conforme (1) Presente ma conforme Assente Aflatossina B1 Deossinivalenolo Ocratossina A - - Aflatossina B1 Aflatossine totali Deossinivalenolo Fumonisine Ocratossina A Zearalenone - Aflatossina M1 - -
Grazie per l attenzione