REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA
Solo una piccola parte dei 4000 geni che costituiscono il genoma batterico o dei circa 30000 geni del genoma umano viene espressa in maniera costante (GENI COSTITUTIVI) La quantità dei prodotti genici varia a seconda della specializzazione funzionale e del momento della vita della cellula La modulazione dell espressione genica è importante per la regolazione del metabolismo cellulare e per la creazione ed il mantenimento delle differenze funzionali esistenti tra le cellule durante lo sviluppo Dato l elevato costo energetico della sintesi proteica, la regolazione dell espressione genica è essenziale se la cellula deve utilizzare al meglio l energia disponibile Lo studio della regolazione dell espressione genica nei batteri è progredito più rapidamente rispetto ad altri organismi sperimentali Molto di ciò che si è imparato dai sistemi procarioti si è dimostrato importante per lo studio della regolazione genica negli eucarioti
La regolazione della concentrazione intracellulare di una proteina richiede l equilibrio di numerosi processi Ci sono almeno 6 potenziali punti di regolazione
PRINCIPI GENERALI DELLA REGOLAZIONE GENICA I geni per prodotti che sono costantemente necessari, come quelli che codificano enzimi che catalizzano le principali vie metaboliche, sono espressi ad un livello costante in tutte le cellule di un dato organismo. Sono i GENI COSTITUTIVI (housekeeping). L espressione costante, non sottoposta a regolazione, di questi geni è detta ESPRESSIONE GENICA COSTITUTIVA. I livelli cellulari di altri prodotti genici variano in risposta a vari segnali molecolari. Si parla di ESPRESSIONE GENICA REGOLATA. PRODOTTI GENICI INDUCIBILI (INDUZIONE) la concentrazione aumenta in risposta a segnali molecolari PRODOTTI GENICI REPRIMIBILI (REPRESSIONE) la concentrazione diminuisce in risposta a segnali molecolari. L attività genica è regolata da interazioni tra proteine e sequenze specifiche del DNA.
Regolazione dell inizio della trascrizione La trascrizione ha inizio a livello dei siti promotori sul DNA stampo, a livello dei quali di lega l RNA polimerasi. La regolazione dell inizio della trascrizione si basa molto spesso su cambiamenti dell interazione tra RNA polimerasi e promotore.
Sequenze consenso del promotore di E.coli La variazione delle sequenze dei diversi promotori influenza l affinità di legame delle RNA polimerasi e conseguentemente la frequenza di inizio della trascrizione. Mutazioni a livello della sequenza riducono in genere la funzione del promotore. L interazione tra RNA polimerasi e promotore è regolata da proteine 1) Fattori di specificità - alterano la specificità della RNA polimerasi per un promotore o un gruppo di promotori 2) Repressori - si legano ad un promotore impedendo l accesso della RNA polimerasi 3) Attivatori - si legano vicino ad un promotore favorendo l interazione RNA polimerasi-promotore. Aumentano l affinità di RNA polimerasi per il promotore
Un esempio di fattore di specificità è la subunità σ 70 dell oloenzima di RNA polimerasi di E.coli che media il riconoscimento del promotore. In condizioni di shock termico, σ 70 viene sostituita da σ 32. In queste condizioni RNA polimerasi non si lega ai comuni promotori di E.coli, ma si associa ad un gruppo specializzato di promotori che controllano l espressione di un gruppo di geni che governano la risposta allo shock termico Sequenze consenso di promotori che regolano l espressione dei geni coinvolti nella risposta allo shock termico in E.coli Questo sistema risponde ad aumenti di temperatura e ad alcuni stress ambientali. Induzione della sintesi di un gruppo di proteine E uno dei meccanismi per mezzo dei quali un insieme di geni correlati può essere regolato in modo coordinato
COMUNI SISTEMI DI REGOLAZIONE DELL INIZIO DELLA TRASCRIZIONE
REGOLAZIONE DELL INIZIO DELLA TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI
MOLTI GENI PROCARIOTICI SONO REGOLATI NELL AMBITO DI UNITA GENETICHE CHIAMATE OPERONI Nei batteri geni correlati sono raggruppati sul cromosoma, possiedono un unico promotore, e vengono trascritti insieme. Le molecole di mrna sono policistroniche. L insieme di geni, promotore e altre sequenze che hanno funzione di regolazione sono complessivamente chiamati OPERONE. Gli operoni più comuni contengono da 2 a 6 geni, alcuni ne contengono più di 20. (geni strutturali)
OPERONE lac Molti principi che regolano l espressione genica nei batteri sono stati definiti in studi sulla regolazione del metabolismo del lattosio in E.coli. E.coli può utilizzare il lattosio come fonte di unità carboniose e di energia in alternativa al glucosio. L operone lac è stato il primo sistema di questo tipo individuato e caratterizzato
OPERONE lac La trascrizione dei geni LacZYA è controllata da una proteina regolatrice sintetizzata dal gene LacI LacZ: codifica per la β-galattosidasi che scinde i β-galattosidi nei loro componenti. Es. lattosio in glucosio e galattosio. LacY: codifica per la β-galattoside permeasi, una proteina di 30kDa legata a membrana che costituisce il sistema di trasporto dei β-galattosidi nella cellula. LacA: codifica per la β-galattoside transacetilasi, che trasferisce un gruppo acetile dall acetil-coa ai β-galattosidi (è possibile che la reazione di acetilazione costituisca un vantaggio quando i batteri crescono in presenza di certi analoghi di β-galattosidi che non possono essere utilizzati; l acetilazione comporta detossificazione ed escrezione).
LacI nella sua forma attiva è costituita da 4 subunità di 38kDa
LacI, legandosi alle sequenze operatore, impedisce l accesso della polimerasi al promotore Quindi, i geni lac sono controllati da REGOLAZIONE NEGATIVA: sono trascritti solo se non disattivati dalla proteina laci. Mutazioni in grado di disattivare laci causano il permanere dei geni strutturali nella condizione espressa. LacI è chiamata REPRESSORE LAC perché la sua funzione è di prevenire l espressione di geni strutturali
In assenza di lattosio il gene regolatore è trascritto ed i geni strutturali sono repressi
Quando alle cellule viene fornito lattosio l operone viene INDOTTO L induttore è allolattosio, che si forma non appena il lattosio penetra nella cellula ad opera delle poche copie di β-galattosidasi presenti nella cellula Dopo la dissociazione del repressore la concentrazione intracellulare di β-galattosidasi aumenta di un fattore 1000 IPTG è un induttore non metabolizzabile
L OPERONE LAC È SOGGETTO ANCHE A UNA REGOLAZIONE POSITIVA Se sono presenti sia glucosio che lattosio, per evitare che la cellula metabolizzi zuccheri diversi dal glucosio, si attiva un meccanismo regolatorio chiamato REPRESSIONE DA CATABOLITA o REPRESSIONE CATABOLICA (il glucosio media la repressione dei geni per il catabolismo del lattosio) L effetto repressivo del glucosio è mediato da camp e dalla proteina CRP: camp Receptor Protein - Proteina Recettore per camp CAP: Catabolite gene-activator Protein - proteina che attiva i geni per i cataboliti
REPRESSIONE DA CATABOLITA CRP è un omodimero (2 x 22000) contenente siti di legame per il DNA e per camp. Quando il glucosio è assente, CRP si lega ad un sito specifico vicino al promotore lac e incrementa di 5 volte la frequenza di trascrizione. Le differenze tra la sequenza del promotore lac e la sequenza consenso comportano minore affinità di RNA polimerasi nei confronti del promotore lac L affinità aumenta quando CRP si lega al DNA. CRP attiva RNA polimerasi (attivazione allosterica)
EFFETTI COMBINATI DI GLUCOSIO E LATTOSIO SULL ESPRESSIONE DELL OPERONE lac L effetto del glucosio su CRP è mediato da camp Bassi livelli di glucosio (alti livelli di camp): camp si lega a CRP che in questa forma si lega al DNA Alti livelli di glucosio (bassi livelli di camp): CRP non si lega all operone, che viene espresso in quantità molto minore Quindi l induzione dell operone richiede sia la presenza di lattosio (per inattivare il repressore) sia l assenza o bassa concentrazione di glucosio (per aumentare la concentrazione di camp e facilitare il legame di CRP)
CRP è un elemento regolatore positivo, che risponde alla concentrazione di glucosio, mentre il repressore Lac è un elemento regolatore negativo che risponde ai livelli di lattosio. CRP e camp sono coinvolti nella regolazione coordinata di molti operoni, principalmente quelli che codificano enzimi del metabolismo di zuccheri secondari come galattosio e arabinosio. Questa rete di operoni con un regolatore comune è detta REGULON REGULON : meccanismo che coordina grandi cambiamenti delle funzioni cellulari in risposta a modificazioni ambientali Può controllare la funzione di centinaia di geni Altri esempi di regulon: sistema genico dello shock termico risposta SOS agli agenti che danneggiano il DNA
Operone Trp di E.coli Nei procarioti i geni necessari per sintetizzare un aa sono in genere raggruppati in un solo operon che viene espresso ogni volta che le riserve di quell aa sono insufficienti al fabbisogno cellulare mrna dell operon ha un emivita di circa 3 minuti: la cellula reagisce rapidamente alle modificazioni del fabbisogno cellulare dell aa
L operone Trp è sottoposto a 2 sistemi di regolazione: Per alte concentrazioni intracellulari di Trp: REGOLAZIONE NEGATIVA da repressore. Trp è il segnale molecolare Il repressore è un omodimero (2 subunità di 107 aa) Questo sistema on/off risponde alle variazioni di [Trp] e aumenta o diminuisce la velocità di sintesi degli enzimi di circa 700 volte
Quando la repressione è rimossa e la trascrizione riprende, la velocità del processo viene finemente regolata da un secondo meccanismo di regolazione detto ATTENUAZIONE DELLA TRASCRIZIONE La frequenza di trascrizione dipende dalla [Trp] e dallo STRETTO ACCOPPIAMENTO TRA TRASCRIZIONE E TRADUZIONE, tipico dei sistemi procariotici
Il meccanismo dell attenuazione utilizza segnali codificati da 4 sequenze contenute all interno di una regione leader di 162 nt al 5 di mrna (a monte del codone di inizio del primo gene strutturale)
Attenuazione perché la trascrizione inizia normalmente ma si arresta prima della trascrizione dei geni strutturali dell operon
Molti operoni che contengono geni che codificano per la biosintesi di aa utilizzano strategie di attenuazione simili Operone phe peptide guida di 15 aa con 7 Phe Operone leu peptide guida di 15 aa con 4 Leu Operone his peptide guida di 15 aa con 7 His Per la maggior parte di questi operoni l attenuazione è l unico sistema di regolazione
La risposta SOS di E.coli Esempio di regolazione coordinata di numerosi geni non adiacenti I geni SOS vengono indotti quando il cromosoma batterico viene severamente danneggiato; sono coinvolti nei processi di riparazione del DNA Gli elementi regolatori principali sono il repressore LexA e la proteina RecA a) Circa 1000 monomeri di proteina RecA sono normalmente presenti nella cellula b) Quando il DNA è danneggiato si arresta la replicazione e aumenta il numero di intervalli del DNA a singola elica c) RecA si lega al DNA a singola elica; si attiva la funzione proteasica della proteina Scissione proteolitica e inattivazione di LexA d) Induzione dei geni SOS, compreso reca (la concentrazione della proteina RecA aumenta di 50-100 volte)
REGOLAZIONE DELL INIZIO DELLA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI
In vivo e in assenza di sequenze regolatrici, l attività dei promotori e del macchinario di trascrizione viene definito Stato trascrizionale di base Nei batteri l RNA polimerasi ha in genere accesso a qualsiasi promotore e può legarsi e iniziare la trascrizione con un certo livello di efficienza in assenza di attivatori o repressori Lo stato trascrizionale di base non è restrittivo Negli eucarioti, in assenza di sequenze regolatrici, i forti promotori eucariotici sono in genere inattivi in vivo Lo stato trascrizionale di base è restrittivo Questa differenza porta ad alcune caratteristiche rilevanti che distinguono la regolazione dell espressione genica negli eucarioti e nei procarioti
- l accessibilità ai promotori eucariotici è limitata dalla struttura della cromatina e l attivazione della trascrizione è associata a modificazioni nella struttura della cromatina nella regione trascritta (gli effetti della struttura cromosomica sulla regolazione genica degli eucarioti non hanno un corrispettivo nei procarioti). - nei sistemi eucariotici studiati fino ad oggi predominano i meccanismi di regolazione positivi. - dato che lo stato trascrizionale di base è restrittivo, ogni gene eucariotico richiede un attivazione per essere trascritto. - maggiore complessità delle grandi proteine regolatrici multimeriche presenti negli eucarioti - negli eucarioti la trascrizione nucleare è temporalmente e fisicamente separata dalla traduzione citosolica.
La trascrizione di un gene eucariotico è fortemente repressa quando il DNA è condensato all interno della cromatina. Le regioni cromosomiche attivate per la trascrizione contengono siti di legame per le proteine regolatrici, il cui legame al DNA è facilitato dalla mancanza di strutture nucleosomiche. I nucleosomi sono assenti in regioni trascritte attivamente come i geni degli rrna. Nella cromatina trascrizionalmente attiva in genere c è poco H1 e gli altri istoni sono probabimente modificati per acetilazione e in seguito a legame con ubiquitina. Mentre il DNA eucariotico è in genere metilato a livello di residui di citosina in 5 in sequenze CG, la cromatina trascrizionalmente attiva tende ad essere sottometilata. Inoltre, nello stesso organismo multicellulare, particolari geni hanno diversa entità di metilazione a livello dei siti CG a seconda delle diverse cellule.
La cromatina attiva viene preparata alla trascrizione mediante la rimozione di barriere strutturali RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA
Le RNA polimerasi eucariote hanno in genere scarsa affinità per i loro promotori. L inizio della trascrizione dipende quasi sempre dall azione di uno o più attivatori proteici. Perché negli eucarioti predomina il meccanismo di regolazione positivo? -la struttura della cromatina rende molti dei promotori inaccessibili, per cui i geni, in assenza di regolazione, sono normalmente silenti. -l impossibilità di accesso ai promotori rende la funzione di eventuali repressori, legati al DNA per impedire l accesso della polimerasi, ridondante.
- le grandi dimensioni del genoma degli eucarioti aumentano la probabilità di aspecificità delle proteine regolatrici nei confronti del DNA. La specificità può essere aumentata se aumenta il numero dei siti regolatori di un singolo gene (il numero medio in un organismo multicellulare è 5). Ogni sito è riconosciuto da un fattore specifico che con gli altri forma un complesso che attiva la trascrizione. Con un meccanismo di questo tipo la regolazione positiva è la più efficace perché consente alla cellula di sintetizzare solo un gruppo selezionato di attivatori proteici necessari per attivare la trascrizione solamente dei geni necessari per quella data cellula, mentre la maggior parte dei geni è inattiva.
RNA Polimerasi II: enzima responsabile della sintesi di mrna eucariotico Oltre alle sequenze TATA box e alla sequenza di inizio (Inr) i promotori di RNA polimerasi II contengono sequenze regolatrici addizionali: ENHANCER: eucarioti superiori centinaia o migliaia bp prima del sito di inizio oppure dopo il sito di inizio all interno del gene SEQUENZE ATTIVATRICI DISTALI (UAS): lieviti poche centinaia di basi prima dell inizio
Proteine regolatrici: 1.FATTORI DI TRASCRIZIONE DI BASE si legano al promotore 2.TRANSATTIVATORI CHE LEGANO IL DNA si legano alle enhancer o alle UAS 3.COATTIVATORI non si legano al DNA. Agiscono indirettamente mediando la comunicazione tra transattivatori ed il complesso RNA polimerasifattori di trascrizione di base 4. REPRESSORI possono interferire con la comunicazione tra RNA polimerasi e transattivatori producendo una repressione della trascrizione.
Promotori eucariotici e proteine regolatrici L RNA polimerasi II associata ai suoi FATTORI DI TRASCRIZIONE DI BASE forma un complesso di preinizio a livello delle sequenze TATA e Inr dei promotori. Questo processo è facilitato dai TRANSATTIVATORI che legano il DNA e che agiscono attraverso TFIID e/o un mediatore TFIID: è il complesso COATTIVATORE più studiato. È un complesso molto grande che comprende la proteina TBP e altri fattori associati a TBP. TBP (TATA Binding Protein): proteina che lega la sequenza TATA. Prima proteina che si lega durante la formazione del complesso di preinizio. Tale complesso non si può formare se il promotore è oscurato all interno della cromatina.
La RNA polimerasi interagisce con il mediatore e con altri complessi proteici attraverso il dominio C-terminale (CTD) I transattivatori possiedono un dominio che lega il DNA e un dominio di attivazione. I REPRESSORI della trascrizione degli eucarioti possono agire -legando direttamente il DNA e rimuovendo le proteine necessarie all attivazione -interagendo con i complessi di attivazione o di trascrizione e impedendo la trascrizione Alcuni transattivatori possono agire da repressori grazie a variazioni conformazionali in genere mediate da segnali ormonali
Come fa il transattivatore a funzionare a distanza? Formazione di un ansa. Il ripiegamento è facilitato da proteine non istoniche (HMG High Mobility on Gel) molto abbondanti nella cromatina e che svolgono un importante funzione nel rimodellamento.
Gli eventi della attivazione della trascrizione nelle cellule eucariote Gli attivatori si legano per primi al DNA Gli attivatori reclutano i complessi che modificano gli istoni e che rimodellano i nucelosomi Gli attivatori reclutano il mediatore Il mediatore facilita il legame di TBP e di TFIIB Si legano gli altri fattori di trascrizione di base e la PolII Il dominio C-terminale di PolII (CTD) viene fosforilato e ha inizio la trascrizione
Un sistema eucariotico ben studiato è quello che regola la trascrizione dei geni del metabolismo del galattosio nel lievito. Gli enzimi necessari per l importazione del galattosio e il suo metabolismo sono 6 e sono codificati da geni disposti in 3 diversi cromosomi. Ognuno dei geni GAL è trascritto separatamente (le cellule del lievito non hanno operoni) Tutti i geni GAL hanno però promotori simili e sono regolati dallo stesso gruppo di proteine (Gal4p, Gal80p, Gal3p)
Regolazione della trascrizione dei geni del metabolismo del galattosio nel lievito -In assenza di galattosio, il complesso Gal80p-Gal4p non è in grado di funzionare da attivatore -Quando il galattosio è presente, si lega a Gal3p ed il complesso si lega a Gal80p provocando una modificazione conformazionale che consente l interazione di Gal4 con la polimerasi (fattore di inizio). Gal4p svolge il ruolo centrale di transattivatore che lega il DNA
Altri complessi proteici svolgono ruolo di attivatori della trascrizione dei geni Gal. I complessi si organizzano in una serie di tappe. I transattivatori che legano il DNA si legano per primi, poi arrivano i complessi che rimodellano la cromatina e finalmente la trascrizione può iniziare. Poiché, come nei batteri, il glucosio è la fonte di carbonio preferita dal lievito, quando il glucosio è presente la maggior parte dei geni Gal è repressa indipendentemente dalla disponibilità di galattosio. Il sistema di regolazione Gal è surclassato da un complesso sistema di regolazione da catabolita che comprende diverse proteine.
LE PROTEINE REGOLATORIE HANNO REGIONI CHE LEGANO IL DNA Le proteine di regolazione si legano a sequenze specifiche del DNA con un affinità in genere 10 5-10 7 volte maggiore di quella nei confronti di sequenze non specifiche. I siti di legame del DNA per le proteine regolatrici sono in genere brevi sequenze ripetute invertite (sequenze palindrome) alle quali si legano in modo cooperativo di più subunità di una proteina regolatrice
La maggior parte dei contatti tra proteine e DNA che determinano la specificità sono dei legami idrogeno. I residui aminoacidici delle proteine regolatorie le cui catene laterali si legano più frequentemente alle basi del DNA sono Asn, Gln, Glu, Lys, Arg Le regioni che legano il DNA sono generalmente di piccole dimensioni (da 60 a 90 residui). In numerose proteine regolatorie sono stati scoperti dei motivi strutturali che svolgono un ruolo chiave nel legame con il DNA
MOTIVO ELICA-GIRO-ELICA Motivo di circa 20aa: due brevi segmenti di α elica (da 7 a 9 aa) separati da un ripiegamento β. Primo studiato. In molte proteine regolatrici procariote. Presente anche negli eucarioti
ZINC FINGER Motivo di circa 30 aa. 4 residui (4 Cys o 2 Cys + 2 His) coordinano un atomo di Zn ++. Molto diffuso nelle cellule eucariote.
OMEODOMINIO Motivo di 60aa Simile al motivo elica-giro-elica Nelle cellule eucariote
Le proteine regolatrici possiedono anche domini di interazione proteina-proteina Mediano interazioni con RNA polimerasi, altre proteine regolatrici o altre subunità della stessa proteina regolatrice Tipico dei fattori di trascrizione eucariotici LEUCINA ZIPPER ELICA-ANSA-ELICA
L espressione dei geni eucariotici può essere regolata da segnali intra- ed intercellulari Meccanismo cellulare degli ormoni steroidei: esempio di modulazione di proteine regolatrici eucariotiche mediante l interazione con segnali molecolari Le proteine regolatrici sono il bersaglio (recettore) intracellulare degli ormoni Il complesso ormone-recettore si lega al DNA a livello delle sequenze HRE (Hormone Response Elements) alterando l espressione di geni specifici. Il legame con l ormone determina una variazione conformazionale del recettore che acquista capacità di interazione con altri fattori di trascrizione. Il complesso O-R può aumentare o diminuire l espressione dei geni. Sequenza del recettore per l estrogeno I residui in grassetto sono comuni a tutti i recettori di ormoni steroidei