L evoluzione tecnologica dell immunofluorescenza: verso la completa automazione degli ANA IFI Claudia Alpini, Laboratorio Analisi Chimico Cliniche, Fondazione I.R.C.C.S. Policlinico San Matteo Pavia
CENNI STORICI La storia della diagnostica autoimmune inizia negli anni 40 e 50 1948 1950 Antigen 1957 1980 Anti-nuclear antibodies: Contemporary techniques and clinical application to connective tissue diseases G. A. McCarty, D. W. Valencia and M. J. Fritzler Oxford University Press, Oxford, 1984
Metodi di dosaggio degli autoanticorpi Renato Tozzoli LigandAssay 15 (4) 2010 Tra i metodi convenzionali di prima generazione l IFI rappresenta la prima tecnica per la rivelazione degli autoanticorpi e nella sua applicazione principale (ANA-IFI) rappresenta anche il primo esempio di test Multiplex nella storia.
Nell ultimo ventennio, la ricerca ha prodotto una vera rivoluzione nell ambito delle tecnologie diagnostiche dirette alla rivelazione/quantificazione degli autoanticorpi, che si è tradotta in un aumento esponenziale della capacità analitica in un rapido incremento numerico delle richieste Tozzoli et al.: Current state of diagnostic technologies in the autoimmunology laboratory Figure 1 The evolution of technologies for autoantibody detection: the role of automation (see text for legends).
L evoluzione delle tecnologie : la determinazione degli ANA un aumento esponenziale della capacità analitica
L evoluzione delle tecnologie : la determinazione degli ANA un rapido incremento numerico delle richieste Journal of Immunology Research
ANA anno 2013 Statistica richieste ANA A S L B E L G C C H I R Incremento ANA negli anni A S L E M A T INF A M B A P E D REU Laboratorio Analisi Chimico Cliniche, Fondazione I.R.C.C.S. Policlinico San Matteo Pavia M E D. I N T
Anticorpi anti-antigeni nucleo-citoplasmatici : ANA Definizione sono autoanticorpi appartenenti a tutte le classi di immunoglobuline, più spesso IgG, diretti verso i normali costituenti e compartimenti cellulari, comuni a tutti i tipi di cellule,rappresentati da acidi nucleici, macromolecole, proteine associate acidi nucleici, enzimi e loro cofattori; sono presenti in modo stabile nel nucleo e nelle principali strutture cellulari (membrana, nucleoplasma e cromatina, nucleolo); migranti dal nucleo al citoplasma, durante le fasi del ciclo cellulare; sono presenti in modo stabile nel citoplasma; sono la conseguenza della perdita, da parte dell organismo, della tolleranza verso antigeni self.
Ann Rheum Dis July 2014 Vol 73 No 7
ANA - Sono un test di screening utilizzato per la diagnosi di quasi tutte la malattie reumatiche autoimmuni, e in alcuni casi, ne rappresentano un parametro diagnostico/classificativo. - Utili da un punto di vista clinico/diagnostico in altre patologie autoimmuni e non. Journal of Immunology Research Volume 2014, Article ID 315179, 18 pages
rapido incremento numerico delle richieste disponibilità di tecnologie ad elevato throughput ANA test?? ANA new technologies ANA-IFI
vecchio ANA-IFI nuovo ANA test Screening Ma..il problema: Consolidamenti in atto: necessità di assorbire aumentati carichi di lavoro Esigenza di integrazione ed accentramento su stazioni analitiche multiparametriche Aumento richieste esami Ha evidenziato crescenti preoccupazioni circa l adozione unilaterale di questi nuovi metodi. Alla domanda : Quale metodo utilizzare? del controllo della qualità ( riproducibilità, sensibilità, specificità); dell interpretazione clinica dei risultati ; dell accuratezza dei metodi
Comitati internazionali ad hoc, come: - IUIS/WHO/AF/CDC Comitato per la standardizzazione di autoanticorpi correlati a malattie autoimmuni - Task Force della American College of Rheumatology (ACR)
ANA-IFI deve la sua riaffermata superiorità ad una elevata sensibilità. Sensibilità non riscontrabile nei metodi alternativi e caratteristica fondamentale ed obbligatoria in un saggio destinato ad essere utilizzato come screening. Meroni et al. BMC Medicine2014, 12:38 Journal of Immunology Research Volume 2014, Article ID 315179, 18 pages
Nella pratica clinica, una corretta interpretazione del test ANA deve essere d aiuto a stabilire Qual è la probabilità di un paziente di avere la malattia quando il test di laboratorio è positivo o non avere la malattia quando il test di laboratorio è negativo. difficile in termini di specificità e sensibilità PVN di SPA è inferiore al PVN di IFI
In virtù della riaffermata superiorità.. rivoluzione e modernizzazione del test ANA-IFI
Negli ultimi anni si sono intensificati gli sforzi per migliorarne in modo significativo i principali svantaggi 1 2 3 Piattaforme tecnologiche avanzate per l automazione di ANA-IFI 4 3 5 4 4 5 Piattaforme tecnologiche avanzate per la lettura e l interpretazione di ANA-IFI 1 2
Agmon-Levin N, et al. Ann Rheum Dis 2013;0:1 7. doi:10.1136/annrheumdis-2013-203863
Agmon-Levin N, et al. Ann Rheum Dis 2013;0:1 7. doi:10.1136/annrheumdis-2013-203863
Piattaforme tecnologiche avanzate per l automazione di ANA-IFI
LIS LIS Oggi: stato dell arte
Questi Sistemi Intelligenti utilizzano: microscopi automatizzati con sorgente luminosa a LED; vassoi porta vetrini robotizzati; video camere ad alta sensibilità; hardware e software diversi dedicati all acquisizione, alla analisi e alla valutazione dell immagine ANA-IFI. Piattaforme tecnologiche avanzate per la lettura e l interpretazione di ANA-IFI
Criticità sono state rilevate: interpretazione di alcuni quadri fluoroscopici; pattern con reattività multiple. Metodo robusto nello screening Tale interpretazione errata può avere dei campioni positivi/negativi; implicazioni in ambito clinico, sottolineando la necessità e l importanza dell interpretazione dell esperto.
Autoimmunity Reviews 13 (2014) 292 298
Complessivamente l efficacia analitica dei sistemi è notevole: 40/756 errori pari al 5,3% Sensibilità 96,7% Specificità 89,2% Imprecisione analitica buona < 1,99% x< 25,26% 18 falsi negativi* 22 falsi positivi (manuale 39,12%) * 2 sieri critici anche per operatori esperti; Buona correlazione tra valore analitico del segnale e titolo errore manuale 3,3% con sens.media 96,7% 16 sieri 50% pattern citoplasmatici (1 Jo1non riconosciuto da 4/6) (titoli 50% bassi pattern e morfologia inusuali complessa penalizzano corretta classificazione) 65% con titolo 1:160 (1/3 pattern citoplasmatico e 2/3 pattern inusuale) 35% con titolo 1:320 ( 60% pattern citoplasmatico e 40% pattern inusuale) % errori calcolata sul totale delle osservazioni pari al 10,8%
Interpretazione ANA-IFI * * * * non sono stati valutati sieri con pattern misti Corretta identificazione L interpretazione dei quadri dei quadri morfologici fluoroscopici classici dipende : Difficoltà nell interpretazione limitazioni dichiarate quadri dai produttori; fluoroscopici inusuali e citoplasmatici Difficoltà qualità nella del corretta substrato; interpretazione di quadri fluoroscopici misti preparazione vetrini.
Time...verso la completa automazione degli ANA-IFI.siamo vicini alla meta! Throughput ANA-IFI Standardizzazione e completa automazione procedura di esecuzione Armonizzazione dei risultati in IFI: -riduzione soggettività; -riduzione variabilità intra-inter laboratorio; -throughput più elevato flusso di lavoro