Chimica Analitica e Laboratorio 2 Modulo di Spettroscopia Analitica
Metodo dei minimi quadrati Si siano raccolte sperimentalmente N coppie di valori X i, Y i Y X 0.0123 1.025 0.0134 2.050 0.0139 2.075 0.0205 2.100 0.0261 2.525.... 0.1012 10.250 0.1153 11.500 Consideriamo che X sia la variabile affetta da un errore sperimentale minore rispetto a quello della variabile Y.
Metodo dei minimi quadrati Si riportino questi valori nel piano X,Y. 14 12 10 8 6 4 2 0 0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120 0,140 Si ha una relazione lineare Y = a + bx
Metodo dei minimi quadrati Si cerchi di tracciare con un righello quella retta che lascia i punti egualmente dispersi sopra e sotto la retta. Per fare questo posso operare su due gradi di libertà: ü posso fare variare l inclinazione del righello (pendenza) ü posso far variare la distanza del righello dall asse delle X (intercetta). 14 12 10 8 6 4 2 0 0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120 0,140
Metodo dei minimi quadrati In termini matematici si tratta di individuare quella retta che renda minima la somma dei quadrati degli scarti (residui) tra i valori sperimentali Y i ed i corrispondenti valori (stesso valore X i ) calcolati sulla retta a + b X i Z = i Y i ( a + bx i ) "# $ % 2
Metodo dei minimi quadrati Per individuare questa retta, e cioè i valori di a e b, bisogna trovare il minimo di Z rispetto alle variabili a e b. Per trovare il minimo di una funzione si devono trovare i valori delle variabili per cui la derivata prima è zero. Quindi devo derivare Z rispetto ad a e b. Z = i Y i ( a + bx i ) "# $ % 2! =!!! +!!! +!!!!!! 2!!! 2!!!! + 2!"!!!=!!!! +!!! +!!!!!!!!2!!!2!!!!! +!2!"!!!!!
Metodo dei minimi quadrati Derivo rispetto ad a e b, ed eguaglio a zero le derivate
Metodo dei minimi quadrati Che si riducono a due equazioni risolvibili col metodo di Kramer
Metodo dei minimi quadrati 25 20 Y = 1.945 x X + 3.1638 15 Y 10 5 0 0 2 4 6 8 10 X
Sensibiltà Per sensibilità di un metodo o di uno strumento si intende la sua capacità di discriminare tra piccole differenze di concentrazione di analita Per una risposta lineare la sensibilità corrisponde alla pendenza della retta.
Sensibiltà Retta di taratura di una soluzione di K 2 Cr 2 O 7 258 nm 350 nm 430 nm
Sensibiltà A 258 nm A 350 nm A 430 nm RETTA DI TARATURA 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10-5 0.0001 0.00015 0.0002 0.00025 0.0003
Sensibiltà A 258 nm A 350 nm A 430 nm RETTA DI TARATURA 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10-5 0.0001 0.00015 0.0002 0.00025 0.0003
Sensibiltà
Limite di rivelabilità Per limite di rivelabilità di un metodo o di uno strumento si intende la concentrazione (o quantità) di sostanza che può essere rivelato ad un livello di fiducia noto È possibile distinguere tra un segnale analitico e le fluttuazioni statistiche del bianco quando il primo è almeno k volte superiore alle variazioni casuali del secondo.
Limite di rivelabilità Segnale 0.8 0.4 Segnale x 1000 2 0 Dev. St. Media Dev. St. -2 0 4 8 12 16 20 Tempo 0 4 8 12 16 20 Tempo
Limite di rivelabilità 3 Dev. St. 2 2 2 Dev. St. Segnale x 1000 0 Dev. St. Media Dev. St. Segnale x 1000 0 Dev. St. Media Dev. St. -2-2 2 Dev. St. 0 4 8 12 16 20 Tempo 0 4 8 12 16 20 Tempo 3 Dev. St.
Limite di rivelabilità 30 Un segnale di intensità pari a tre volte la standard deviation del rumore di fondo viene riconosciuto come un segnale reale. K = 3 Il limite di confidenza è 3S, cioè il valore dell errore relativo è 33,3%. Segnale x 100 20 10 0 LR 0 4 8 12 16 20 Tempo
Limite di rivelabilità Il limite di rivelabilità è molto importante, per es. nelle analisi ambientali per le sostanze tossico nocive. Queste sostanze, che siano elementi inorganici (Pb, Hg, As,..) o sostanze organiche (pesticidi, ), devono tutte essere determinate a valori di concentrazioni bassissimi. Nei certificati d analisi deve essere riportato il metodo utilizzato nella determinazione con il suo limite di rivelabilità.
Limite di quantificazione 30 LQ Un segnale di intensità pari a trenta volte la standard deviation del rumore di fondo fornisce una valutazione con errore relativo pari a 3,3%. Questa è la concentrazione (quantità) minima del range operativo per un analisi chimica quantitativa. Segnale x 100 20 10 0 LR 0 4 8 12 16 20 Tempo
Limite di rivelabilità e limite di quantificazione Ricordiamo che Se la St. Dev. del bianco rappresenta il rumore di fondo dello strumento in assenza di analita. Il segnale corrispondente al limite di rilevabilità è S LR = 3 x SD bianco
Limite di rivelabilità e limite di quantificaione Errore percentuale di una misura al limite di rilevabilità E LR = 3 x SD bianco x 100 = 33% Errore percentuale di una misura al limite di quantificazione E LQ = 30 x Sd bianco x 100 = 3%
Intervallo di lavoro limit of detection (LOD), limit of quantification ( LOQ), dynamic range, and limit of linearity (LOL)
g Valore limite per il Pb
Effetto matrice
Leggi limite Le relazioni che legano la risposta strumentale alla concentrazione sono leggi limite. soluzioni diluite assenza di interferenti monocromaticità della radiazione forza ionica costante...
Curve di calibrazione Per ovviare alle deviazioni delle risposte, nelle analisi strumentali è norma lavorare con una curva di calibrazione. Le finalità di questo procedimento sono: valutare la risposta segnale concentrazione stimare le costanti di proporzionalità
Deviazioni La risposta strumentale spesso presenta delle deviazioni. 1.4 1.2 assorbanza Magnesio assorbanza 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0.6 0.5 0.4 assorbanza Potassio 0 0 2 4 6 8 10 12 ppm 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8 10 12 ppm
Effetto matrice La composizione del campione può essere alquanto complessa ed influenzare la risposta strumentale. La variazione di segnale analitico causata da tutto ciò che è presente nel campione escluso l analita viene definita come effetto matrice.
Effetto matrice Le cause dell effetto matrice possono essere di tipo chimico o fisico complessazione dell analita formazioni di composti mascheranti variazione dell attività alterazione del ph... variazioni delle proprietà fisiche del mezzo...
Matrice Alcune esempi di matrici: soluzioni ad alta concentrazione di soluti (scarichi, acque salmastre, salamoie, bibite zuccherine,..) miscele acqua-solvente organico (processi industriali, vini, bibite alcooliche,...) soluzioni con alto contenuto proteico (fluidi biologici, alimenti,...) soluzioni ad elevata acidità (scarichi, estrazione di metalli da matrici solide,...)
Effetto matrice In spettroscopia atomica la risposta strumentale è funzione della concentrazione dell analita presente in fiamma o nel plasma. La determinazione analitica è basata sull assunzione che il numero di atomi presenti in fiamma plasma, N, sia proporzionale a quelli nel campione, N c. N = kn c La costante k è funzione di tutti i processi che contribuiscono all atomizzazione del campione.
Effetto matrice in spettroscopia atomica In spettrofotometria atomica, l effetto matrice si presenta con: interferenze spettrali interferenze chimiche interferenze fisiche
Interferenze spettrali in Assorbimento Atomico in fiamma Formazione di composti con bande di assorbimento sovrapposte alla riga dell analita formazione di CaOH con banda che copre la riga analitica del Ba a 553.6 nm Presenza di elementi facilmente ionizzabili gli elettroni della ionizzazione del Na fanno retrocedere la ionizzazione dell Al (aumento del segnale) Formazione di particelle che diffondono la radiazione ossidi refrattari di Ti, Zr, W sostanze organiche mal combuste danno luogo a particelle di carbone
Interferenze chimiche in Assorbimento Atomico in fiamma fosfati e solfati formano con il Calcio composti stabili poco volatili l Alluminio forma con il Magnesio ossidi misti l assorbimento del Sodio diminuisce in presenza di HCl per il probabile spostamento verso la forma indissociata dell equilibrio in fiamma NaCl D Na + Cl, a causa del Cloro
Interferenze fisiche La quantità di campione e le dimensioni delle gocce dell aerosol che arrivano alla fiamma dipendono da viscosità, densità e tensione superficiale. La viscosità interferisce nella velocità di aspirazione flusso = f 1 vis cosità viscosità relativa all acqua flusso Metanolo 0.62 +61% HNO 3 1M 1.15-13% NaCl 1M 1.22-18% Ca(NO 3 ) 2 1M 1.44-31% La tensione superficiale, la densità e la viscosità sono responsabili della dimensione delle particelle dell aerosol.
Matrice salina Scarico di uno stabilimento metallurgico. R.F. ph 10,4 Cl - SO 4 = Na + Ca 2+ 7,66 g/l 1600 mg/l 3300 mg/l 1960 mg/l 440 mg/l K + 270 mg/l
Matrice acqua-etanolo Abbattimento dell intensità del segnale ICP-AES per effetto della concentrazione crescente di alcool. Intensità relativa 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Ba Fe Mn Zn 0 4 8 12 16 20 Percentuale d'alcol alcol % Ba Zn Mn Fe 0.5 0.9 0.7 0.8 0.9 1 0.8 0.5 0.7 0.8 1.5 0.7 0.4 0.6 0.7 2 0.6 0.4 0.5 0.7 2.5 0.6 0.3 0.5 0.6 3 0.6 0.3 0.5 0.6 6 0.5 0.2 0.3 0.5 9 0.4 0.2 0.3 0.4 12 0.3 0.1 0.2 0.3 15 0.2 0.1 0.2 0.2 18 0.2 0.08 0.1 0.2
Per la determinazione degli elementi in tracce in tessuti biologici, il campione viene disgregato in acido per 18h. Matrice acida
Come superare l effetto matrice? 1. eliminazione dell effetto aumento temperatura e tipo di fiamma per eliminare la formazione di ossidi tamponi di forza ionica nelle determinazioni con elettrodi ionoselettivi modificatori di matrice nel fornetto di grafite 2. riproduzione della matrice con soluzioni compensate 3. metodo dello standard interno 4. metodo delle aggiunte multiple
Metodo dello standard interno Il metodo consiste nell introdurre negli standard e nei campioni una quantità nota di un elemento sicuramente non presente nel campione ma con un comportamento simile all analita. Partendo dall assunzione che il segnale dello standard interno subisca la stessa alterazione di quello dell analita, il loro rapporto è indipendente dalla matrice e costante. Dalla curva di calibrazione si ricava il fattore di risposta che permette la determinazione della concentrazione dell analita nel campione.
Metodo delle aggiunte multiple Se nel metodo dello standard interno si è partiti dall assunto che aliquote di standard aggiunte al campione subiscano gli stessi effetti matrice degli analiti presenti, a maggior ragione questo assunto sarà verificato se si aggiunge l analita stesso.
Metodo delle aggiunte prelevare aliquote uguali del campione e trasferirle in matracci Metodo operativo aggiungere aliquote note e crescenti dell analita (0, 5, 10,...)
Metodo delle aggiunte
Metodo delle aggiunte Rispetto ad una calibrazione classica la retta non passa per l origine ma è traslata verso l alto dal contributo della concentrazione incognita dell analita. Determinata con i minimi quadrati l equazione della retta, il valore della concentrazione incognita X relativo all intercetta all origine (a) si ottiene ponendo Y = 0. La concentrazione C dell analita nel campione originario sarà quindi uguale a quella X trovata corretta del fattore di diluizione Y = a + bx a X = b C = X V V matraccio prelevato
Considerazioni Nella pratica di laboratorio la scelta della procedura analitica deve tener conto di diversi fattori accuratezza richiesta precisione tempo e costo
Fattori da tener presenti Sulla base di questi fattori si può dire che: la riproduzione della matrice comporta un grosso impegno iniziale per determinare la composizione e riprodurla il metodo dello standard interno è un metodo semplice ed economico affidabile nei limiti in cui lo standard risponde in modo analogo agli analiti Il metodo delle aggiunte multiple rappresenta sicuramente il metodo più accurato e preciso, ma il suo utilizzo su un numero elevato di campioni richiede tempi e costi che possono risultare eccessivi