Corso integrato di Genetica e Biologia Molecolare GENETICA a.a.2015-2016 Pier Franco Pignatti 15.10.2015 Lezioni N. 11-12 Malattie da mutazioni dinamiche e malattie da difetto di riparazione del DNA (Neri-Genuardi cap. 11, 17) Espansione di triplette, premutazioni, anticipazione. Xeroderma Pigmentoso, Atassia Teleangiectasia, Anemia di Fanconi, S. Bloom, S. Lynch
MALATTIE DA ESPANSIONE DI SEQUENZE INSTABILI
Espansione di ripetizioni instabili Es: FRAXA NEJM 332:1499, 1995
Instabilità delle ripetizioni In blu: interruzioni che rendono gli alleli stabili Mancano interruzioni e gli alleli si espandono: alleli instabili Es: SCA Nota una eccezione alla regola: una grossa espansione di un allele paterno interrotto in una grave forma di SCA-2 con esordio infantile ( Kobayshi H et al, 2011) Strachan e Read, Genetica Molecolare Umana UTET 2000
Meccanismo di espansione CAG:Gln
Malattie da mutazioni dinamiche DM2 XL AR AD AD >40 m. neurologiche, neurodegenerative, neuromuscolari Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999; JRGatchel & H Zoghbi 2005
Sindrome dell X fragile (FXS) S. di Martin-Bell (1943). La forma più comune di disabilità intellettiva ereditaria. Una delle più frequenti cause note di disabilità intellettiva e autismo. Affetti 1:4.000 maschi, 1:6.000 femmine. Sito fragile Xq27.3 (FRAXA) in terreno privo di folato (Lubs 1969). Alterazione della replicazione del DNA
Disabilità intellettiva (XLID) sindromica 102 geni associati con XLID Lubs HA et al. 2012
Espansione di FMR1 1991: identificazione del gene FMR1 e della prima mutazione dinamica (cioè che si modifica nel passaggio da una generazione all altra) Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999
Il paradosso di Sherman Si notino un trasmettitore sano e diverse femmine affette per inattivazione sbilanciata della X. Stephanie Sherman descrisse il fenomeno dell aumento del N casi col passare delle generazioni (aumento della penetranza), facendo notare che nelle famiglie affette da FXS i fratelli delle donne portatrici sono sani in proporzione superiore a atteso mentre i figli delle portatrici sono affetti nella proporzione attesa (paradosso di Sherman). Espansione preferenziale nella linea femminile. Fu YH et al. 1991 «Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox»
Funzione del gene FMR1 FMRP è una proteina che lega l RNA e regola la traduzione di un gruppo di mrna dei dendriti neuronali inibendo l attività di altri geni Topi con gene Fmr1 inattivato hanno perdita della proteina FMRP e alterata maturazione della trasmissione glutamatergica durante il periodo critico perinatale FMRP è necessaria per il normale procedere della maturazione sinaptica durante lo sviluppo. La sua assenza causa una eccessiva sintesi proteica nei dendriti postsinaptici e una alterazione della funzionalità sinaptica
Espansione di triplette gene FMR1 Santoro MR et al, Ann Rev Pathol Mech Dis 2012
Premutazioni FMR1 La premutazione (55-200 CGG) causa aumento di trascritti e diminuzione di FMRP probabilmente a causa di un sequestro da parte dell espansione CGG di proteine che legano l mrna. Può dare : Sindrome con Tremore e Atassia associata a X fragile (FXTAS) Malattia neurodegenerativa a inizio tardivo. La penetranza nei maschi di più di 70 anni è >50%, mentre nelle donne è minore Insufficenza ovarica primaria associata a X fragile (FXPOI) in circa il 20% delle donne portatrici della premutazione. Menopausa precoce
Atassia di Friedreich (FRDA) La sindrome atassica ereditaria più frequente nelle popolazioni caucasoidi (3-4:100.000, AR). Insorgenza pubertà, perdita progressiva coordinazione muovimenti ed equilibrio Deficit di energia: anche cardiomiopatia ipertrofica che può condurre a morte precoce Gene frataxina (FXN) mappato cr. 9q13 Triplette GAA nel primo introne: da 35-40 normale a 70-1000 espansioni causano silenziamento genico con grave deficit di frataxina Espansioni meno grandi sono correlate con un esordio più tardivo
Frataxina Proteina mitocondriale che mantiene omeostasi Fe mitocondriale ed ha ruolo protettivo dal danno nucleare FRDA: il deficit di frataxina altera la funzione mitocondriale determinando sovraccarico di Fe, diminuita produzione di ATP, difetto di funzionamento di neuroni e cardiomiociti; instabilità cromosomica, aumento della sensibilità a mutageni chimici e specie reattive dell ossigeno (ROS) Tentativi terapeutici: rimozione Fe mitocondri mediante sostanze chelanti come il deferiprone, contrasto allo stress ossidativo con antiossidanti, aumento dell espressione genica con eritropoietina e inibitori della deacetilasi istonica
Poliglutaminopatie (polyq) Un gruppo di patologie comprendente 9 malattie neurodegenerative da espansione Il tratto poliglutaminico conferisce alle proteine un guadagno di funzione tossico che porta a inizio tardivo della malattia e perdita progressiva di neuroni in regioni specifiche del SNC Possibile contributo di modificazioni posttraduzionali della proteina
Alcune Poliglutaminopatie NEJM 340:1974, 1999
Malattia di Huntington (HD) George Huntington (1872) descrive la malattia AD ad insorgenza tardiva caratterizzata da disabilità motoria progressiva e deterioramento mentale. Prevalenza 3-7:10.000 Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007
La localizzazione del gene di HD La figura mostra parte di una grande famiglia venezuelana che ha permesso di localizzare il gene sul cromosoma 4 nel 1983. Analisi di linkage con RFLP e il marcatore G8, situato a 3cM dal gene Gusella et al Science 225:1320,1984
La identificazione del gene IT15 N: 11-36 triplette HD: 40-121 triplette Gene IT15 (Important Transcript 15, in seguito chiamato Huntingtina, HTT) identificato nel 1993. Nel 1994 Uno studio mondiale della mutazione HD. La sensibilità e la specificità di misurare le ripetizioni CAG conclude che la lunghezza delle ripetizioni è un marcatore sensibile e specifico della ereditarietà della mutazione Kremer B et al, NEJM 1994
Amplificazione somatica del gene HTT 50 copie 20 copie S: DNA da sperma. L: DNA da linfociti. Si nota una particolare instabilità delle triplette ripetute nella meiosi maschile. Infatti si può avere insorgenza precoce della malattia trasmessa dal padre. L età di esordio è inversamente correlata alla lunghezza della espansione, anche nel tessuto cerebrale Nature Genet 387,1993
Possibile meccanismo patogenetico poliq Formazione di inclusioni nucleari neuronali di aggregati proteici non specifici tossici per i neuroni. La morte cellulare progressiva porta alla malattia a insorgenza tardiva.
Distrofia miotonica (DM) La figura mostra amimia e aspetto scavato del volto, ptosi, iposviluppo muscolo mandibola e sternomastoideo. DM o Malattia di Steinert (1909): ipotonia muscolare con miotonia (debolezza della contrazione muscolare e difficoltà rilassamento dopo contrazione), deperimento, anomalie della conduzione cardiaca ecc. La più frequente fra le distrofie muscolari a ereditarietà autosomica (1:8.000). Gene DMPK, distrofia miotonica protein chinasi. Espansione (CTG)n al 3 UTR
Numero di triplette DMPK ed età di esordio Triplette nella porzione 3 non tradotta del gene. Forme cliniche: C: congenita; G: giovanile; A: adulta; SC: subclinica (nessun segno clinico tranne elettromiogramma anomalo o altro). Genitore che trasmette: madre; padre; ignoto. La forma congenita è trasmessa solo per via materna. Vi è correlazione fra numero di triplette e gravità della malattia Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999
Anticipazione in DM In nero allele N (5-37 triplette); in rosso allele espanso (50-1.000 triplette). Anticipazione: l età di esordio diminuisce con il passare delle generazioni mentre aumenta la gravità delle manifestazioni cliniche Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999
Guadagno di funzione dell RNA in DM Espansione di sequenze non tradotte: CTG (DM1) o CCTG (DM2) AJHG 74:793, 2004
Patogenesi di malattie da espansione A: Inibizione trascrizionale (FXS), B: RNA tossico (DM), C: Proteina tossica (Poli-Gln) Strachan e Read, Genetica Molecolare Umana, Zanichelli 2012
MALATTIE DA DIFETTO DI RIPARAZIONE DEL DNA
Conseguenze dei danni del DNA ROS: specie reattive dell ossigeno; IR: radiazioni ionizzanti; ICL: legami crociati interfilamenti; DSB: rotture dei doppi filamenti; CPD: dimeri pirimidinici ciclobutanici; 6,4,-PP: 6,4 fotoprodotti Wolters S e Schumacher B 2013
Risposta al danno del DNA (DDR) : danno; a: tolleranza; b: riparazione Friedberg E, Nature 2003
Alcune malattie AR da difetto di riparazione del DNA Gruppi di complementazione 8* 1 17 1 *XP: 7 proteine NER (Es. gruppo D: DNA elicasi; gruppo E: DNA BP), più la DNA polimerasi eta per TLS
Test di complementazione Cellule di un paziente sono trasformate con DNA estratto da un altro paziente. Si esegue un test per determinare il deficit di riparazione del DNA. Si osserva un fenotipo mutato se le mutazioni sono nello stesso gene, oppure il ripristino del fenotipo normale se le mutazioni sono in un altro gene Strachan e Read, Genetica umana molecolare, UTET 2001
Xeroderma Pigmentosum (XP) RR Ca cute: 10.000 x in pazienti XP sotto a 20 anni di età! Friedberg E, DNA Repair, Freeman 1985
Difetto di riparazione in cellule XP c.normali irradiate c.xp irradiate Test UDS (sintesi non programmata di DNA): dopo irradiazione UV si nota che in cellule XP non c è sintesi riparativa. Difetto NER in XP. Difetto TLS in XPV, la forma variante di XP (mutazioni di Pol eta, responsabile della sintesi translesione di dimeri pirimidinici ciclobutanici)
Malattie del complesso dello XP-CS-TTD hanno difetto di riparazione e trascrizione 7 malattie del complesso XP-CS-TTD (rettangoli), tutte con ipersensibilità agli UV. Difetti in 11 geni (ovali) Complesso di trascrizione TFIIH che interagisce con componenti del sistema NER Kraemer KH, Nature Genetics 2004
Atassia Teleangiectasia (AT) Neurodegenerazione progressiva con estrema radiosensibilità e predisposizione al linfoma. La dilatazione anomala dei piccoli vasi sanguigni si osserva facilmente nella congiuntiva. Friedberg, DNA Repair, Freeman 1985
Difetto di riparazione in cellule AT Test crescita cellulare Test incorporazione H 3 T Gene ATM (AT-Mutated), sensore del danno al DNA. La inattivazione di questa proteina chinasi produce un difetto nella risposta alle rotture del DNA (DSBs) Friedberg E, DNA Repair, Freeman 1985
Anemia di Fanconi Pancitopenia, difetti scheletrici (aplasia radiale), iperpigmentazione, bassa statura, microftalmia e altri dismorfismi
Difetto di riparazione in cellule FA Test del diepossibutano (DEB): si nota instabilità genomica dovuta a un difetto di riparazione dei legami crociati
Sindrome di Bloom (BS) Bassa statura, sensibilità alla luce solare, immunodeficenza, instabilità cromosomica, predisposizione ai tumori. Gene BLM: DNA elicasi. Instabilità genomica con aumento della frequenza degli scambi fra cromatidi fratelli
Scambio di cromatidi fratelli (SCE) in cellule BS cromosomi arlecchino >5-10x in BS Friedberg E et al DNA repair and mutagenesis, ASM Press 2006
Difetti di riparazione in tumori e nell invecchiamento Hoeijmakers JHJ, DNA Damage, Aging and Cancer, NEJM 2009
Difetto di riparazione nella S. di Lynch (LS) o tumore ereditario del colon non poliposico (HNPCC) LS/HNPCC è la causa più comune di Ca ereditario del colon (CRC) Difetto MMR Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007
Instabilità dei microsatelliti (MSI,MIN) in LS Il tumore ha 1 nuovo allele per il marcatore BAT26 (doppie frecce), e 2 nuovi alleli per il marcatore D2S123 (triple frecce) Lynch HT e A de la Chapelle NEJM 2003
Riparazione del DNA e durata della vita Kornberg A, DNA Replication, Freeman 1980
Sindromi progeroidi e difetto di riparazione DNA elicasi La durata della vita è diminuita nelle sindromi progeroidi che si manifestano con invecchiamento precoce e insorgenza prematura di malattie solitamente associate con individui molto più anziani: S.Werner (osteoporosi, aterosclerosi, diabete, capelli bianchi), S.Cockayne (cataratta), Trico Tio Distrofia (osteoporosi, cataratta, capelli fragili), AT (immunodeficenza, capelli grigi). Durata media della vita: WS 50 anni, CS 12 anni, TTD 10 anni, AT 20 anni. Tutte malattie con difetto di riparazione