Le mutazioni 4. By NA. Lezione 13

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1 Le mutazioni 4 Lezione 13

2 MUTAZIONI DINAMICHE

3 MEMENTO La cosidetta patologia molecolare ha come fine quello di spiegare se e come un particolare allele sia collegabile ad un fenotipo clinico, quindi ci si domanda: la mutazione che effetto ha sulla quantita', qualita', funzione del prodotto? cosi' si tenta di spiegare perche' sia o meno patogenetica ormai vi saranno chiare le difficolta' che si incontrano e la portata della sfida per comprendere il funzionamento del genoma umano: le malattie genetiche sono il risultato di un complesso network di interazioni, ma costituiscono il fulcro per lo studio delle funzioni.

4 &Insorgenza tardiva

5 L Anticipazione alcuni fenotipi a trasmissione autosomica dominante diventano piu gravi nelle generazioni successive perche? & L M espansione di triplette: tipo di mutazione individuata nel 1990 Corea di Hunghinton, X fragile, Distrofia Miotonica premutazione : stato che aumenta il rischio di trasmettere il fenotipo patologico. Il rischio non e piu quantizzabile in termini probabilistici

6 Mutazione completa, range di mutazione Premutazione Normale Schema di mutazioni dinamiche GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG 52 GAA CTG GAA 6 7 CTG GAA CTG 5 UTR esone introne esone introne esone 3 UTR X-fragile Atassia di Friedrich CTG Distrofia miotonica 3000 Mutazione completa, range di mutazione Premutazione Normale Esone ORF Corea di Huntington Atassia spinocerebellare 1 CAG CAG CAG CAG CAG 36 CAG 35 CAG CAG CAG

7 Mutazioni dinamiche effetto fondatore Dal momento che le ripetizioni del range di normalità NON aumentano di numero dopo replicazione, da dove sono nati gli alleli instabili? EFFETTO FONDATORE: Eccezionalmente, in uno o pochi individui, si sono verificati degli errori nella trascrizione, producendo degli alleli con un numero di ripetizioni aumentato, che sono stati ereditati nelle successive generazioni, producendo un pool di alleli instabili presenti oggi nella popolazione Per molte delle mutazioni dinamiche l effetto fondatore è stato dimostrato Questo effetto fondatore si riconosce anche nell assenza o maggior frequenza di alcune di queste patologie in certe aree geografiche

8 Mutazioni dinamiche meccanismo dell instabilità Perché oltre una certa lunghezza compare il fenomeno dell instabilità? La presenza di un aumentato numero di ripetizioni provoca, nel DNA, la formazione di strutture alternative, assenti quando il numero di ripetizioni è nel range di normalità Queste strutture causano problemi sia nei processi di trascrizione ( slippage della polimerasi), sia probabilmente nei meccanismi di riparazione del DNA La conseguenza ultima è la tendenza all incremento numerico delle ripetizioni dopo replicazione (sia mitotica che meiotica!) Per lo stesso principio, sono possibili anche le contrazioni di ripetizioni la maggior parte delle patologie le espansioni sono favorite, ma per

9 Mutazioni dinamiche strutture alternative del DNA

10 Mutazioni dinamiche espansioni e contrazioni

11 Mutazioni dinamiche principi generali delle mutazioni dinamiche INSTABILITÀ MITOTICA: determina la presenza di espansioni di grandezze differenti all interno dello stesso tessuto e tra tessuti differenti. Produce dunque un mosaicismo tissutale INSTABILITÀ MEIOTICA: determina la trasmissione alle generazioni successive di una espansione di diversa ampiezza. E alla base del meccanismo dell anticipazione TRASMISSIONE PATERNA O MATERNA: in alcune patologie, si possono avere espansioni o contrazioni del numero di ripetizioni a seconda che l allele mutato sia trasmesso dal padre o dalla madre

12 Mutazioni dinamiche Localizzazione delle espansioni Perché un aumento nel numero di sequenze ripetute causa una patologia? Esistono differenti meccanismi molecolari alla base delle diverse patologie

13 Mutazioni dinamiche Classificazione molecolare Espansioni in porzioni codificanti (esoniche) del gene: Poliglutamine (Corea di Huntington, malattia di Kennedy, SCAs) Polialanine (Oloprosencefalia, sinpolidattilia, hand-footgenital syndrome) Espansioni in porzioni non codificanti del gene: Promotore (Epilessia progressiva mioclonica) 5 -UTR (Sindrome dell X-fragile, SCA12) Introne (Atassia di Friedrich, Distrofia miotonica di tipo 2) 3 -UTR (Distrofia miotonica di tipo 1, SCA8)

14 Mutazioni dinamiche Sindrome dell X fragile Come si spiega il paradosso di Sherman? La sindrome dell X-fragile è stata la prima patologia da espansione di triplette riconosciuta (1991). Il gene responsabile è FMR1 che mappa sul cromosoma Xq27.3 La tripletta responsabile è, situata nella porzione 5 -UTR L espansione di questa tripletta è causa del 99% dei casi di FRAXA Valori normali: < 44 repeats Gray zone: repeats Premutazione : repeats Mutazione: > 200 repeats

15 Mutazioni dinamiche Sindrome dell X fragile Soluzione del paradosso di Sherman: Nel passaggio da una generazione all altra, soprattutto per trasmissione materna, il numero di triplette tende ad aumentare > normalmente, i maschi figli di portatrici avranno un numero di triplette più elevato rispetto alle madri Oltre le 200 ripetizioni: affetti Inferiore a 200 ripetizioni : clinicamente sani Se l aumento resta nell ambito della premutazione, i maschi che ricevono l allele premutato lo trasmetteranno mediamente invariato alle figlie Le loro figlie avranno quindi un numero maggiore di ripetizioni rispetto alle nonne >aumentato rischio di salto oltre le 200 ripetizioni = aumentato rischio di figli con ritardo mentale rispetto alle nonne (effetto di posizione nell albero genealogico) Oggi possiamo quantificare meglio il rischio di avere un figlio con ritardo mentale : Triplette inferiori a 55: rischio pari a 0 Triplette superiori a 100: rischio pari al 100% Valori intermedi: il rischio cresce esponenzialmente

16 Mutazioni dinamiche Sindrome dell Come nella distrofia miotonica, l espansione è localizzata in una porzione del gene non tradotta Diversamente da questa e una patologia da silenziamento genico perche X fragile Il gene e composto di 17 esoni ed e lungo 38 Kb.All interno del primo esone al 5 UTR e presente una serie di.nella popolazione questa regione e polimorfica: varia da 7 a 52 ripetizioni: l allele piu comune e quello di 30 (effetto fondatore). Quando il numero delle triplette supera 230 l intera regione viene ipermetilata aggiungendo un gruppo metilico a C su entrambe le eliche M il promotore del gene viene inattivato e FRM1 diviene silente e la cromatina non riesce a condensare correttamente

17 Mutazioni dinamiche Sindrome dell riassumendo X fragile *La tripletta si trova vicina al promotore del gene FMR1 in una zona ricca di CpG islands *Un espansione oltre i 200 repeats causa il richiamo di specifiche proteine che metilano le citosine del promotore del gene FMR1> MODIFICA EPIGENETICA *La proteina FMRP è importante nello sviluppo neuronale e dei dendriti. Se il gene è silenziato > APLOINSUFFICIENZA *Nei maschi, non si avrà alcun prodotto proteico (emizigoti) > affetti *Nelle femmine, il prodotto presente dipende da quale cromosoma X è inattivato > affette se è maggiormente inattivo il cromosoma X normale, altrimenti sane ( mosaicismo di metilazione ) *Ecco perché la frequenza delle femmine affette è minore

18 Mutazioni dinamiche Sindrome dell riassumendo X fragile Ridefininizione di mutazione patologica: è definita come full mutation, corrisponde all allele con oltre 200 triplette metilate Casi particolari (rari): Mosaicismo di lunghezza (normale/premutato; premutato/full mutato; normale/mutato) > fenotipo variabile Mosaicismo di metilazione > fenotipo variabile (alleli con > 200 triplette metilati e non metilati) 1% dei pazienti non presenta espansione di triplette : mutazioni puntiformi, delezione del gene Perché i maschi affetti non hanno figlie affette? I maschi con full mutation hanno solo premutazioni negli spermatozoi per la selezione degli spermatozoi durante lo sviluppo embrionale Di conseguenza, le figlie di maschi affetti saranno solo premutate e mai full mutate

19 Mutazioni dinamiche FMR1 related disorders FMR1 -related disorders * Il 20% delle donne con premutazione presenta Premature Ovarian Failure (POF, esaurimento follicolare precoce) *Circa il 20% degli uomini con premutazione presenta Fragile X ataxia/tremor Syndrome (FXTAS), mentre è rarissima tra le donne Il gene FMR1 presenta quindi ETEROGENEITÀ ALLELICA NON sono patologie da aploinsufficienza : sono probabilmente patologie RNA - mediate:gli alleli premutati non solo non sono silenziati, ma presentano anche un aumentata trascrizione, per compensare il difetto di traduzione degli alleli espansi? accumulo di RNA

20 Mutazioni dinamiche Corea di Huntington meccanismi 1 Meccanismo patogenetico principale: tossicità da poliglutamine L eccesso di glutamine nella sequenza aminoacidica impedisce il giusto ripiegamento (folding) della proteina stessa La proteina viene degradata ma i frammenti con le poliglutamine si aggregano Si formano accumuli all interno dei nuclei dei neuroni con guadagno di funzione ed effetto citotossico? apoptosi e degenerazione neuronale Accanto a questo, ci sono altri meccanismi che contribuiscono a determinare il fenotipo (danno mitocondriale, alterazione della trascrizione di altri geni, alterazione del trasporto assonale)

21 Mutazioni dinamiche Corea di Huntington meccanismi 2

22 Mutazioni dinamiche Distrofia Miotonica 1 classificazione molecolare Gene responsabile: l espansione riguarda la tripletta da CTG e si trova nella regione 3 UTR del gene DMPK che mappa sul cromosoma 19q13.3 Classificazione molecolare: 5-36 repeats: alleli normali repeats: classe E repeats: classe E >4000 repeats: classe E3 La forma congenita si manifesta in genere per espansioni di classe E3, trasmesse per via materna. Le espansioni trasmesse dal padre tendono ad essere più stabili (presenza sia di espansioni, sia assenza di variazione, sia rare contrazioni )

23 Mutazioni dinamiche Distrofia Miotonica 1 - pedigree

24 Il gene DMPK Nei pazienti (CTG)n è espanso

25 M Distrofia miotonica questo non e sufficiente per dire che quel gene e il responsabile della malattia: bisogna individuare anche affetti con mutazioni puntiformi. M Nel caso di FMR1 ci sono affetti senza espansione con mutazioni puntiformi che impediscono l espressione. M si ritiene che il gene identificato sia il principale, ma non si e ancora compreso perche l espansione provochi la patologia. Forse altera l espressione dei geni adiacenti. Esistono modelli murini che sembrerebbero validare questa ipotesi. M Ma allora bisogna ritenere DM una sindrome da geni contigui

26 Mutazioni dinamiche Distrofia Miotonica 2 Miopatia miotonica prossimale (PROMM), simile e spesso indistinguibile a livello clinico dalla DM1 La sua frequenza non è chiara (1/ circa) Le differenze maggiori con la DM1 riguardano Presenza di una clinica globalmente più lieve Possibile presenza di crampi e algie, mai presenti nella DM1 Colpisce prima i muscoli prossimali Non è mai presente una forma congenita con ritardo mentale

27 Mutazioni dinamiche Distrofia Miotonica 2 La patologia è determinata da un espansione di un tetranucleotide CCTG, presente nel primo introne del gene ZNF9, che mappa in posizione 3q21.3 Alleli normali: repeats Alleli mutati: repeats (media: repeats) Nonostante il grandissimo numero di ripetizioni, non è possibile effettuare una correlazione genotipo -fenotipo La penetranza è completa e l espressività è variabile DM1 e DM2 sono un esempio di ETEROGENEITÀ GENETICA, mutazioni in geni differenti possono produrre lo stesso fenotipo cioè Entrambe le patologie sono dotate di grandissimo mosaicismo somatico

28 Mutazioni dinamiche Distrofia Miotonica Patologia ad RNA Perché una mutazione in una regione non codificante provoca una patologia? Patologia dell RNA

29 Mutazioni dinamiche Distrofia Miotonica Patogenesi Il gene DMPK è trascritto in mrna che deve essere traslocato dal nucleo al citoplasma per essere processato Se è presente l espansione, questa sarà trascritta in RNA (CUG). In seguito allo splicing dell mrna, il messaggero contenente la ripetizione CUG forma degli aggregati resistenti alla distruzione che rimangono intrappolati nel nucleo Questi aggregati interferiscono con altre proteine nucleari > funzione guadagno di In particolare, gli aggregati ( foci ) di RNA sequestrano una classe di proteine (MBNL1) e spiazzano una seconda famiglia di proteine (CELF). Questi due tipi di proteine sono necessari per un corretto assemblaggio dello spliceosoma L effetto finale è l alterazione dello splicing di altri geni, con conseguente alterazione funzionale di diversi pathways (effetto in trans )

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