Types of Mutations Tested

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1 Types of Mutations Tested Disease Point mutations? Few recurrent mutations? Many unique mutations? Other mutations? Deletions & duplications? Whole gene? Some exons? Also with point mutations?

2 Esempi di malattie ereditarie monogeniche Sindrome dell X-fragile (sinonimi e acronimi: sindrome di Martin-Bell, sindrome FRAXA, sindrome FraX, FXS) Distrofia Muscolare di Duchenne/Becker (sinonimi e acronimi: DMD/BMD, Distrofinopatia severa) Fibrosi Cistica (sinonimi e acronimi: FC (italiano), CF (inglese), mucoviscidosi, malattia fibrocistica del pancreas)

3 Esempi di malattie ereditarie monogeniche Malattia X-fragile DMD/BMD Ereditarietà X-linked recessiva Variabilità allelica Molto bassa Esistenza di mutazioni prevalenti Si Dimensione mutazioni prevalenti Molto grande X-linked recessiva Molto alta Si Grande Tipo di mutazioni prevalenti Espansione di tripletta Delezioni di interi esoni FC Autosomica recessiva Molto alta Si Piccola Vari tipi

4 Malattia X-linked recessiva Il gene responsabile mappa sul cromosoma X I maschi, emizigoti per il cromosoma X sono più spesso affetti la femmina deve ricevere 2 cromosomi X con la mutazione per evidenziare la patologia questo evento è generalmente raro la probabilità un individuo maschile affetto e un individuo femminile portatore o affetto possano insieme generare prole è molto bassa. Le femmine portatrici sono in genere sane, anche se il fenotipo può essere influenzato dal femomeno dell inattivazione del cromosoma X

5 Inattivazione dell X (o effetto Lyon, dalla ricercatrice inglese Mary Lyon, che ipotizzò e lo studiò tale fenomeno negli anni 60 ) 1) Nelle cellule somatiche femminili solo un cromosoma X è trascrizionalmente attivo, mentre l altro è eterocromatico ed inattivo (corpo di Barr) 2) L'inattivazione avviene a livello embrionale quando la morula possiede un piccolo numero di cellule (circa al 16º giorno dopo la fecondazione) 3) Viene inattivato a caso uno dei due cromosomi X, secondo un processo indipendente da cellula a cellula 4) Alcune cellule inattiveranno il cromosoma X di derivazione paterna e altre quello di derivazione materna 5) Dopo che in una cellula un cromosoma X è stato inattivato, tutte le cellule, che discendono da quella, presentano inattivato lo stesso X 6) Ogni femmina di mammifero è quindi un mosaico di regioni tissutali in cui è attivo uno o l'altro cromosoma X

6 Patologie da mutazioni dinamiche

7 Con il termine di sequenza ripetuta (o ripetitiva) di DNA ci si può riferire a due grandi classi di sequenze ripetitive di DNA non codificante: Ripetizioni intersperse SINEs (Short INterspersed Elements) LINEs (Long INterspersed Elements) Ripetizioni in tandem Sequenze ripetute

8 Sequenze ripetute in tandem DNA con sequenze ripetute in tandem: compone circa il 3% dell intero genoma. Può essere classificato a seconda della lunghezza del tratto ripetuto e del numero di ripetizioni in 4 classi: DNA MEGASATELLITE DNA SATELLITE DNA MINISATELLITE DNA MICROSATELLITE (short tandem repeats)

9 Mutazioni dinamiche Espansioni di sequenze ripetute in tandem

10 Patologie da mutazioni dinamiche Malattia Repeat Malattia Repeat SBMA CAG DM1 CTG HD CAG FRDA GAA DRPLA CAG SCA8 CTG SCA1 CAG SCA12 CAG SCA2 CAG HDL2 CAG SCA3 CAG FRAXA CGG SCA6 CAG FRAXE CCG SCA7 CAG FRA11B CCG SCA17 CAG DM2 CCTG AIB-I CAG EPM1 CCCCGCCCCGCG HOXD13 GCG SCA10 AATCT OPMD GCG INS ACAGGGGTCTGGGG CBFA1 GCG h-ras 28 bp repeat ZIC2 GCG FSHD 3.3 Kb D4Z4 repeat HOXA13 GCG KCNN3 CAG FOXL2 GCG CTG18.1 CTG ARX GCG MAB21L1 CAG CJD 24 bp repeat FRAXF CGG COMP GAC FRAX10A, altri CCG, altri repeat

11 Localizzazione delle espansioni Perché un aumento nel numero di sequenze ripetute causa una patologia? Esistono differenti meccanismi molecolari alla base delle diverse patologie EPM1: progressive myoclonic epilepsy 1; FXTAS: frax ass a tremore e atassia; FRDA atassia di Friedreich; BPES blefarofimosi, ptosi e epicanto inverso; CCD displasia cleidocraniale CCHS sindrome congenita centrale con ipoventilazione; HFG hand foot genital syndromehpe5 oloprosencefalia; ISSX sindrome XL infantile con spasmi MRGH ritardo mentale con deficienza isolata dell ormone della crescita OPMD distrofia muscolare oculofaringeale; SPD sinpolidattilia; HDL2 huntington type 2;

12 Mutazioni dinamiche Classificazione molecolare Espansioni in porzioni codificanti (esoniche) del gene: Poliglutamine (Corea di Huntington, malattia di Kennedy, SCAs) Polialanine (Oloprosencefalia, sinpolidattilia, hand-foot-genital syndrome) Espansioni in porzioni non codificanti del gene: Promotore (Epilessia progressiva mioclonica) 5 -UTR (Sindrome dell X-fragile, SCA12) Introne (Atassia di Friedrich, Distrofia miotonica di tipo 2) 3 -UTR (Distrofia miotonica di tipo 1, SCA8)

13 Espansione di sequenze trinucleotidiche ripetute in tandem Malattie da espansione di triplette

14 Mutazioni dinamiche Meccanismo dell instabilità Perché oltre una certa lunghezza compare il fenomeno dell instabilità? La presenza di un aumentato numero di ripetizioni provoca, nel DNA, la formazione di strutture alternative, assenti quando il numero di ripetizioni è nel range di normalità Queste strutture causano problemi sia nei processi di replicazione (slippage della polimerasi), sia probabilmente nei meccanismi di riparazione del DNA La conseguenza ultima è la tendenza all incremento numerico delle ripetizioni dopo replicazione (sia mitotica che meiotica!) Per lo stesso principio, sono possibili anche le contrazioni di ripetizioni, ma per la maggior parte delle patologie le espansioni sono favorite

15 Mutazioni dinamiche strutture alternative del DNA

16 Strutture atipiche formate da triplette ripetute

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18 Espansioni e contrazioni

19 Principi generali delle mutazioni dinamiche INSTABILITÀ MITOTICA: determina la presenza di espansioni di grandezze differenti all interno dello stesso tessuto e tra tessuti differenti. Produce dunque un mosaicismo tissutale INSTABILITÀ MEIOTICA: determina la trasmissione alle generazioni successive di una espansione di diversa ampiezza. E alla base del meccanismo dell anticipazione TRASMISSIONE PATERNA O MATERNA: in alcune patologie, si possono avere espansioni o contrazioni del numero di ripetizioni a seconda che l allele mutato sia trasmesso dal padre o dalla madre

20 Principi generali delle mutazioni dinamiche Anticipazione La severità della malattia aumenta da una generazione alla successiva La malattia esordisce prima da una generazione alla successiva È comune nelle malattie da espansioni di triplette (mutazioni dinamiche) 50 anni 30 anni 10 anni

21 Sindrome dell X-fragile

22 Sindrome dell X fragile o di Martin-Bell La più comune causa di ritardo mentale ereditario Seconda causa di ritardo mentale di natura genetica dopo la sindrome di Down. ( 4-8% dei ritardi mentali genetici) Tratto X-linked recessivo, penetranza variabile 1/4,000 maschi, 1/6,000 le femmine 1/200 le femmine portatrici, 1/800 i maschi premutati Vari sintomi tra cui caratteristiche somatiche, disturbi del comportamento, del linguaggio, deficit cognitivi Pandemica: non c è una popolazione con maggiore frequenza nè una con fenotipi più severi Il nome è dovuto, storicamente, all osservazione, nei cromosomi degli affetti, di un sito dalla morfologia anomala sul cromosoma X

23 Sito fragile del cromosoma X

24 X-fragile Aspetti clinici (nei maschi) Ritardo mentale moderato-severo Ritardo del linguaggio e psicomotorio Padiglioni auricolari grandi e sporgenti Volto allungato Personalità caratteristica (timidezza, ansietà, ADHD) Iperestensibilità delle articolazioni Macroorchidismo (in età post-puberale) Difetti valvolari cardiaci Nelle femmine, il fenotipo è meno grave, con un ritardo mentale lieve

25 X-fragile La sindrome dell X-fragile è stata la prima patologia da espansione di triplette riconosciuta (1991). Il gene responsabile è FMR1 che mappa sul cromosoma Xq27.3 La tripletta responsabile è CGG, situata nella porzione 5 -UTR L espansione di questa tripletta è causa del 95% dei casi di FRAXA Il restante 5% è dovuto a delezioni o mutazioni puntiformi nel gene FMR1

26 X-fragile (CGG)n Untraslated Region (UTR) Coding Sequence (CDS) (CGG)n CpG island

27 X-fragile Il gene responsabile è FMR1 che mappa sul cromosoma Xq27.3 La tripletta responsabile è CGG, situata nella porzione 5 -UTR L espansione di questa tripletta è causa del 95% dei casi di FRAXA Valori normali: < 44 repeats Gray zone: repeats Premutazione : repeats Mutazione: > 200 repeats

28 Gene FMR1 CDS CDS promotore 1 EX UTR NORMALE INTRONE mrna FMRP CGG repeat promotore 1 EX UTR PREMUTATO INTRONE mrna FMRP CGG repeat mrna FMRP >200 CGG 1 INTRONE M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M 2) Metilazione Promotore 1) espansione CGG > 200 CGG Mutazione FRAXA

29 5 UTR del gene FMR1 E una patologia da silenziamento genico

30 La proteina FMR Proteina che lega l RNA Interviene nello sviluppo delle sinapsi tra cellule nervose del cervello comunicazioni cellula-cellula Regola la plasticità delle sinapsi (importante per la memoria e l apprendimento) plasticità delle sinapsi: cambiamenti e adattamenti delle sinapsi nel tempo in rapporto alle esperienze

31 La Proteina FMR Si lega ai poliribosomi in attiva traduzione Coinvolta nella regolazione del trasporto e nella traduzione degli mrna che regolano lo sviluppo e la plasticità delle sinapsi. La mancanza della proteina FMR altererebbe la traduzione di questi mrna Si stanno identificado i vari target per comprendere la patogenesi Si cerca di chiarire quindi il pathway che, se alterato, causa la sindrome Fragile X

32 X-fragile Ritardo mentale 85% dei maschi affetti hanno un ritardo moderato o grave 50% delle femmine affette hanno lieve ritardo, il 20% moderato o grave Nei maschi, non si avrà alcun prodotto proteico (emizigoti) affetti Nelle femmine, il prodotto presente dipende da quale cromosoma X è inattivato affette se è maggiormente inattivo il cromosoma X normale, altrimenti sane (mosaicismo di metilazione) Ecco perché la frequenza delle femmine affette è minore

33 X-fragile Nel passaggio da una generazione all altra, soprattutto per trasmissione materna, il numero di triplette tende ad aumentare normalmente, i figli maschi di portatrici avranno un numero di triplette più elevato rispetto alle madri Oltre le 200 ripetizioni: affetti Inferiore a 200 ripetizioni : clinicamente sani Se l aumento resta nell ambito della premutazione, i maschi che ricevono l allele premutato lo trasmetteranno mediamente invariato alle figlie Le loro figlie avranno quindi un numero maggiore di ripetizioni rispetto alle nonne aumentato rischio di salto oltre le 200 ripetizioni = aumentato rischio di figli con ritardo mentale rispetto alle nonne (effetto di posizione nell albero genealogico) rischio di avere un figlio con ritardo mentale: Triplette inferiori a 55: rischio pari a 0 Triplette superiori a 100: rischio pari al 100% Valori intermedi: il rischio cresce esponenzialmente

34 Defininizione di mutazione patologica: è definita come full mutation, corrisponde all allele con > 200 triplette metilate Casi particolari (rari): X-fragile Mosaicismo di lunghezza (normale/premutato; premutato/mutato; normale/mutato (questa categoria di pz sfugge alla diagnosi molecolare (falso negativo) se eseguita solo con PCR)) fenotipo variabile Mosaicismo di metilazione (alleli con > 200 triplette metilati e non metilati) fenotipo variabile 5% dei pazienti non presenta espansione di triplette mutazioni puntiformi, delezione del gene Espansione di triplette > 200 senza metilazione del promotore nessun ritardo mentale Espansione di triplette recentemente è stata associata a disturbi del movimento, nei maschi, e ad amenorrea precoce, nelle donne)

35 FMR1 related disorders Il 20% delle donne con premutazione presenta Premature Ovarian Failure (POF, esaurimento follicolare precoce) Circa il 20% degli uomini con premutazione presenta Fragile X ataxia/tremor Syndrome (FXTAS), mentre è rarissima tra le donne Il gene FMR1 presenta quindi ETEROGENEITÀ ALLELICA Sono probabilmente patologie RNA-mediate Gli alleli premutati non solo non sono silenziati, ma presentano anche un aumentata trascrizione, per compensare il difetto di traduzione degli alleli espansi accumulo di RNA

36 Indicazioni al test genetico Ritardo mentale, dello sviluppo o disturbi del linguaggio, comportamento e dell apprendimento di origine sconosciuta Autismo o comportamenti simili macrorchidismo Sguardo sfuggente e comportamento iperattivo

37 Diagnosi molecolare L analisi molecolare è effettuata mediante: PCR: è rapida ma non documenta chiaramente le mutazioni complete e le premutazioni, sebbene identifichi con più precisione le mutazioni piccole e medie (riesce ad amplificare premutazioni di 100 repeats al massimo ) Southern blot: è più oneroso e richiede più tempo, ma permette di diagnosticare con precisione le mutazioni complete e i mosaicismi Le due metodiche non sono alternative, ma complementari!

38 Fragile X Syndrome Molecular Diagnostics by PCR (CGG)n >200 Full mutation (inactive, hypermethylated) Premutation (not hypermethylated) Grey Zone 5 44 Normal CpG Forward Primer Reverse Primer

39 Fragile X Sizing in Males Normal Male 12 CGGs Premutation Male 89 CGGs

40 Fragile X Sizing in Females Normal Females 28/37 CGGs Premutation Female 28/78 CGGs

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42 Molecular Diagnostics by Southern Blot (2.4 Kb) EagI (CGG)n 2.8 Kb HindIII probe HindIII X NORMALE, NON METILATO EagI (CGG)n 2.8 < X < 3.4 Kb HindIII probe HindIII X PREMUTATO, NON METILATO EagI (CGG)n HindIII X > 5.8 Kb probe HindIII X MUTATO, METILATO Non metilato Metilato

43 Molecular Diagnostics by Southern Blot The positions of normal alleles are indicated by the yellow arrows while the positions of diagnostic alleles are indicated by the red arrows. EagI (CGG)n 2.8 < X < 3.4 Kb HindIII probe HindIII X PREMUTATO, NON METILATO EagI (CGG)n 2.8 Kb HindIII probe HindIII X NORMALE, NON METILATO Lane 1: Normal male 2.8 Kbp unmethylated HindIII/EagI fragment. Lane 2: Premutation male Slightly increased size 2.8 Kbp HindIII/EagI fragment due to slight increase in CGG repeat number.

44 Molecular Diagnostics by Southern Blot The positions of normal alleles are indicated by the yellow arrows while the positions of diagnostic alleles are indicated by the red arrows. EagI (CGG)n X > 5.8 Kb HindIII probe HindIII X MUTATO, METILATO Non metilato Metilato Lanes 3 and 4: Full mutation affected males Large increases in sizes of 2. 8 HindIII/EagI fragments due to large increase in CGG repeat number and complete methylation of this CGG repeat.

45 Molecular Diagnostics by Southern Blot The positions of normal alleles are indicated by the yellow arrows while the positions of diagnostic alleles are indicated by the red arrows. EagI (CGG)n 5.2 Kb HindIII HindIII probe X NORMALE, METILATO EagI (CGG)n 2.8 Kb HindIII probe HindIII X NORMALE, NON METILATO Non metilato Metilato Lane 5: Normal female 5.2 Kbp methylated (inactive X chromosome) and 2.8 Kbp unmethylated (active X chromosome) HindIII/EagI fragments.

46 Molecular Diagnostics by Southern Blot The positions of normal alleles are indicated by the yellow arrows while the positions of diagnostic alleles are indicated by the red arrows EagI (CGG)n 5.2 Kb HindIII HindIII probe X NORMALE, METILATO EagI (CGG)n 2.8 Kb HindIII probe HindIII X NORMALE, NON METILATO EagI (CGG)n 5.2 < X < 5.8 Kb HindIII probe HindIII X PREMUTATO, METILATO Lane 6: Premutation carrier female Slightly increased size 2.8 Kbp and 5.2 Kbp HindIII/EagI fragments due to slight increase in the FMR1 CGG repeat number carried by one X chromosome. Some methylated and some unmethylated. EagI (CGG)n 2.8 < X < 3.4 Kb HindIII probe HindIII X PREMUTATO, NON METILATO Non metilato Metilato

47 Molecular Diagnostics by Southern Blot The positions of normal alleles are indicated by the yellow arrows while the positions of diagnostic alleles are indicated by the red arrows. EagI (CGG)n X > 5.8 Kb HindIII probe HindIII X MUTATO, METILATO EagI (CGG)n 5.2 Kb HindIII HindIII probe X NORMALE, METILATO Lanes 7 and 8: Full mutation carrier females Large increases in sizes of 5.2 HindIII/EagI fragment due to large increase in CGG repeat number and partial methylation of this CGG repeat. Normal 2.8 Kbp HindIII/EagI fragment also present. About 50-80% of these individuals will show some degree of mental impairment. EagI (CGG)n 2.8 Kb HindIII probe HindIII X NORMALE, NON METILATO Non metilato Metilato

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49 Test prenatale Si consigliano villocentesi e/o amniocentesi All epoca dei villi, il DNA potrebbe non essere ancora metilato Si esegue anche l analisi indiretta