EFFETTO DEGLI ANTISETTICI E DEGI DISINFETTANTI Abbiamo già precedentemente visto che esistono numerose molecole, sia organiche che inorganiche, che vengono impiegate per controllare la crescita dei, sia nella disinfezione che nell antisepsi. Volendoli differenziare nella loro azione, si può dire che gli antisettici ostacolano lo sviluppo dei germi, prevenendo quindi la sepsi (putrefazione), come ad esempio nel caso di ferite; invece i disinfettanti uccidono i germi, agendo sovente come sterilizzanti e sono usati su oggetti inanimati. I principali requisiti che una sostanza deve possedere per essere definita un buon disinfettante o antisettico sono: elevata tossicità (a temperatura ambiente) verso i in genere e atossicità verso gli altri esseri viventi; elevata efficacia antimicrobica a bassa concentrazione; buona miscibilità in acqua. Molti sono i fattori che possono influire sull efficacia di un disinfettante o di un antisettico; tra questi ricordiamo: il tipo di germe da distruggere: le forme più resistenti sono le spore, i batteri capsulati, i batteri acido-resistenti, le cellule vecchie ; il tempo di esposizione: a contatto con la stessa sostanza non tutti i vengono distrutti nello stesso tempo; il ph; il tipo di materiale da trattare: l attività diminuisce se il disinfettante si combina o reagisce con il substrato; la concentrazione: l efficacia diminuisce con la diluizione; la temperatura: un aumento di temperatura incrementa l attività microbicida. Diversi sono i metodi per valutare l attività antibatterica dei disinfettanti e degli antisettici nei confronti di un determinato microrganismo; di seguito verrà descritto il metodo della diffusione.
Materiale occorrente terreno di coltura AGAR TRIPTONE SOIA (ATS) sterile liquefatto coltura di lavoro del microrganismo in esame in BTS 1 piastra Petri sterile in plastica 1 tampone di cotone sterile 1 pinza di metallo bunsen dischetti di carta da filtro sterili ANTISETTICI E DISINFETTANTI A DISPOSIZIONE: N Nome commerciale Principio/i attivo Classe di appartenenza del principio/i attivo 1 Amuchina (soluzione al 10%) Cloro attivo allo 0,11% 1a Amuchina spray 0,05% Cloro attivo allo 0,05% 3 Betadine soluzione Iodopovidone al 10% di iodio 3a Betadine sapone Iodopovidone al 10% di iodio Lauriletere Detergente sintetico 4 Alcool etilico denaturato Alcool etilico al 70% 5 Acqua ossigenata 6 Germozero spray 7 Amuchina gel Perossido di idrogeno al 3% o 10 volumi Oleil dimetil benzil ammonio cloruro 2-idrossidifenile Metilcloroisotiazolinone Alcool denaturato Alcool benzilico Perossidi Composti quaternari di ammonio Fenolo e derivati 8 Citrosil spray Benzalconio cloruro Composti quaternari di ammonio 8a Citrosil gel Benzalconio cloruro Composti quaternari di ammonio 9 Amuchina oggetti e superfici Benzalconio cloruro 50% 10 Neo-Mercurocromo 11 Milton compresse effervescenti 12 Tintura di iodio Eosina Cloroxilenolo Glicole propilenico Sodio dicloro-s-triazinatrione Iodio Potassio ioduro Composti quaternari di ammonio Coloranti organici Fenolo e derivati 13 Bialcol Benzoxonio cloruro Alcool isopropilico Composti quaternari di ammonio 14 Kastel Cloro attivo 15 Master-Aid 15a Master-Aid gel Clorexidina di gluconato all 1% Alcool denaturato Glicol propilenico e altro
Principio del metodo Esistono numerosi metodi per valutare l efficacia antibatterica degli agenti chimici; quello di seguito proposto è noto come metodo della diffusione su agar. La prova consiste nell allestire una piastra con ATS liquefatto e nell inoculare abbondantemente la superficie del terreno solidificato con il microrganismo in esame. Sopra ad esso si depositano successivamente alcuni dischetti di carta sterile impregnati dell agente chimico di cui si vuole testare l efficacia. Dopo il periodo di incubazione ciascun dischetto rilascerà per diffusione l agente chimico del quale è impregnato e le colonie batteriche cresceranno tutte ammassate su tutta la superficie dell agar formando una patina uniforme tranne nella zona circostante il dischetto: se l agente chimico presenta un efficacia microbicida nei confronti della specie batterica in esame, si osserverà un alone di inibizione intorno al dischetto, ovvero una zona priva di crescita batterica; tanto maggiore è il diametro dell alone di inibizione, tanto maggiore sarà l efficacia della sua attività antibatterica nei confronti della specie batterica in esame. Procedimento Siglare la piastra con nome gruppo, ATS. Allestire con tecnica sterile la piastra con Agar Triptone Soia (ATS) sterile liquefatto a 45-50 C e lasciare solidificare. Con tecnica sterile, bagnare il tampone di cotone nella coltura di lavoro del microrganismo in esame, quindi distribuire uniformemente l inoculo su tutta la superficie del terreno; ripetere per diverse volte l inoculo distribuendolo uniformemente e perpendicolarmente sul precedente: si deve ottenere un abbondante ed uniforme crescita batterica. Lasciare asciugare la piastra con il coperchio aperto per qualche minuto vicino alla fiamma del bunsen, quindi richiuderla. Fra tutti gli antisettici e disinfettanti a disposizione sceglierne 5 aventi una diversa classe di appartenenza del principio attivo (trascriverli nella Tabella di raccolta dei risultati, utilizzando lo stesso numero di identificazione). Ripetere le seguenti operazioni con ciascuno dei 5 antisettici o disinfettanti scelti: Flambare la pinza di metallo sulla fiamma del bunsen e farla raffreddare all aria, quindi prelevare un dischetto di carta da filtro con la pinza sterile, immergerlo nel becher del primo antisettico o disinfettante in soluzione oppure spruzzare su di esso lo spray, quindi deporlo su carta assorbente per eliminare il liquido in eccesso. Con la pinza sterile, depositare il primo dischetto imbevuto al centro della piastra inoculata, premendo delicatamente con la pinza per farlo aderire bene al terreno senza però farlo affondare. Contrassegnare il fondo della piastra in corrispondenza del dischetto con il numero di identificazione dell antisettico o disinfettante. Gli altri quattro dischetti imbevuti vanno depositati intorno al primo ad almeno 1 cm dal bordo esterno della piastra. Lasciare a riposo la piastra chiusa per almeno 15 minuti, quindi rovesciarla e incubare per 2-3 giorni alla temperatura ottimale di crescita. Lettura dei risultati Misurare il diametro dell alone di inibizione intorno a ciascun dischetto, compreso il dischetto di carta, quindi classificare l efficacia dell agente chimico nei confronti del microrganismo in esame come di seguito indicato. Diametro dell alone di inibizione su ATS Da assente a 10 mm Da 11 mm a 15 mm Efficacia antibatterica dell agente chimico Scarsa Media > 15 mm Elevata
EFFETTO DEI CHEMIOTERAPICI Abbiamo già precedentemente visto che i chemioterapici sono quei farmaci che vengono utilizzati sull ospite (uomo o altri animali) per la cura delle infezioni. I crescono, infatti, oltre che su oggetti inanimati anche sopra o all interno di altri organismi ospiti; in tal caso la colonizzazione microbica può portare all insorgenza di malattie, di invalidità e persino alla morte. Si può senza dubbio affermare che la medicina moderna dipende in grande misura dai chemioterapici, agenti chimici utilizzati in clinica per il trattamento delle malattie. Il successo di un agente chemioterapico è senza dubbio da attribuire alla tossicità selettiva: esso deve infatti inibire o distruggere il microrganismo patogeno con il minor danno possibile per l ospite. Il grado di tossicità selettiva può essere espresso mediante: (1) la dose terapeutica, cioè la concentrazione di farmaco richiesto per il trattamento clinico di una particolare infezione; (2) la dose tossica, cioè la concentrazione del farmaco oltre la quale esso risulta troppo tossico per l ospite. L indice terapeutico è il rapporto tra la dose tossica e quella terapeutica: quanto più è elevato, tanto migliore, a parità di condizioni, è l agente chemioterapico. Un farmaco che è in grado di alterare una certa funzione microbica assente nelle cellule eucariotiche animali, presenta spesso una tossicità selettiva elevata e un maggior indice terapeutico. Per esempio, la penicillina inibisce la sintesi del peptidoglicano della parete cellulare batterica e nel contempo presenta effetti minimi sulle cellule dell ospite, che sono prive di parete cellulare; da ciò si deduce che l indice terapeutico della penicillina è piuttosto elevato. Un chemioterapico può invece presentare un indice terapeutico molto basso se inibisce lo stesso processo tanto nel patogeno quanto nelle cellule ospiti, oppure se danneggia l ospite in qualche altro modo. Questi effetti indesiderati sull ospite, detti effetti collaterali, sono di vario genere e possono interessare quasi tutti gli organi. Dato che gli effetti collaterali possono risultare di particolare gravità, la somministrazione degli agenti chemioterapici deve avvenire con una particolare attenzione. Lo spettro d azione dei vari chemioterapici presenta notevoli variazioni; molti sono farmaci a spettro limitato, vale a dire che la loro efficacia è limitata a una ristretta varietà di patogeni, altri sono invece farmaci ad ampio spettro, i quali agiscono su numerose varietà di patogeni.
Materiale occorrente AGAR MÜLLER-HINTON (AMH) sterile liquefatto coltura di lavoro del microrganismo in esame in BTS 1 piastra Petri sterile in plastica 1 tampone di cotone sterile 1 pinza di metallo bunsen CHEMIOTERAPICI A DISPOSIZIONE IMPREGNATI SU DISCHETTI STERILI: Categoria terapeutica N Principio/i attivo Quantità sul dischetto 1 Amoxicillina 2 Ampicillina Antibiotico 3 Eritromicina 15 µg 4 Penicillina G 10 U.I. 5 Streptomicina Sulfamidico 6 Trimethoprim + Sulfametoxazolo 1,25 µg + 23,75 µg 7 Sulfonamidi composte 300 µg Principio del metodo Esistono numerosi metodi per valutare l efficacia antibatterica dei chemioterapici; quello di seguito proposto è noto come metodo della diffusione su agar o metodo di Kirby-Bauer, comunemente noto con il nome di antibiogramma. Il principio su cui si basa questa tecnica di dosaggio è simile a quello già visto in precedenza per gli antisettici e i disinfettanti. Quando un dischetto impregnato di chemioterapico viene collocato su agar precedentemente inoculato con il batterio in esame, assorbe una certa quantità di acqua dal terreno e l agente chemioterapico si diffonde nell agar in senso radiale centrifugo, producendo un gradiente di concentrazione del principio attivo. Quest ultimo si concentra in modo consistente in prossimità del dischetto e agisce sui, persino su quelli che presentano una sensibilità minima. Per distanze sempre maggiori dal dischetto, la concentrazione del chemioterapico diminuisce, così che solo i batteri più sensibili vengono interessati. Dopo il periodo di incubazione, intorno al dischetto impregnato di chemioterapico si forma un alone di inibizione, indice dell azione inibente sulla crescita batterica da parte del chemioterapico stesso: quanto più ampio è l alone di inibizione intorno al disco, tanto maggiore è la sensibilità del patogeno nei confronti del chemioterapico. L ampiezza dell alone dipende anche dalla concentrazione iniziale del chemioterapico, dalla sua solubilità e dal suo grado di diffusione in agar; per questi motivi l entità dell alone non può essere usata per confrontare due chemioterapici differenti. Procedimento Siglare la piastra con nome gruppo, AMH. Allestire con tecnica sterile la piastra con Agar Müller-Hinton (AMH) sterile liquefatto a 45-50 C e lasciare solidificare. Con tecnica sterile, bagnare il tampone di cotone nella coltura di lavoro del microrganismo in esame, quindi distribuire uniformemente l inoculo su tutta la superficie del terreno; ripetere per diverse volte l inoculo distribuendolo uniformemente e perpendicolarmente sul precedente: si deve ottenere un abbondante ed uniforme crescita batterica.
Lasciare asciugare la piastra con il coperchio aperto per qualche minuto vicino alla fiamma del bunsen, quindi richiuderla. Fra tutti i chemioterapici a disposizione scegliete 4 antibiotici e 1 sulfamidico aventi diversi principi attivi (trascrivete nella Tabella Dati a fine capitolo quelli scelti, utilizzando lo stesso numero di identificazione). Ripetere le seguenti operazioni con ciascuno dei 5 chemioterapici scelti: Flambare la pinza di metallo sulla fiamma del bunsen e farla raffreddare all aria, quindi prelevare il primo dischetto impregnato di chemioterapico e depositarlo al centro della piastra inoculata, premendo delicatamente con la pinza per farlo aderire bene al terreno senza però farlo affondare. Contrassegnare il fondo della piastra in corrispondenza del dischetto con il numero di contrassegno del chemioterapico. Gli altri quattro dischetti vanno depositati intorno al primo ad almeno 1 cm dal bordo esterno della piastra. Lasciare a riposo la piastra chiusa per almeno 15 minuti, quindi rovesciarla e incubare per 2-3 giorni alla temperatura ottimale di crescita. Lettura dei risultati Misurare il diametro dell alone di inibizione intorno a ciascun dischetto, compreso il dischetto di carta, quindi classificate il microrganismo in esame nei confronti del chemioterapico come di seguito indicato (Resistente, Intermedio, Sensibile). Categoria terapeutica N Principio/i attivo Quantità sul dischetto Microrganismo Diametro dell alone di inibizione Classificazione del microrganismo Resistente Intermedio Sensibile Antibiotico 1 Amoxicillina 2 Ampicillina 3 Eritromicina 15 µg con enterococchi negativi con stafilococchi positivi con enterococchi negativi con stafilococchi positivi 11 mm 12-13 mm 14 mm 20 mm 21-28 mm 29 mm 11 mm 12-13 mm 14 mm 20 mm 21-28 mm 29 mm 13 mm 14-17 mm 18 mm Sulfamidico 4 Penicillina G 10 U.I. con stafilococchi 20 mm 21-28 mm 29 mm 10 U.I. 5 Streptomicina 6 7 Trimethoprim + Sulfametoxazolo Sulfonamidi composte 1,25 µg + 23,75 µg 300 µg con altri 11 mm 12-21 mm 22 mm 11 mm 12-14 mm 15 mm 10 mm 11-15 mm 16 mm 10 mm 11-19 mm 20 mm
Alunni CEPPO BATTERICO IN ESAME Genere Data di consegna dei risultati Specie LE CONDIZIONI DI CRESCITA BATTERICA TEMPERATURA a 4 C a 20 C a 40 C a 60 C Temperatura ottimale di crescita Classificazione del microrganismo CONCENTRAZIONE DI OSSIGENO Tipo di crescita Classificazione del microrganismo AGAR NUTRIENTE (AN) AGAR TRIPTONE ESTRATTO DI LIEVITO (ATEL) EFFETTO DEGLI ANTISETTICI E DEI DISINFETTANTI N Nome commerciale Classe di appartenenza del principio/i attivo AGAR TRIPTONE SOIA (ATS) Diametro dell alone di inibizione (mm) Efficacia antibatterica EFFETTO DEI CHEMIOTERAPICI N Categoria terapeutica Principio/i attivo AGAR MÜLLER-HINTON (AMH) Diametro dell alone di Classificazione del inibizione microrganismo (mm)