PARAMETRI SEMINALI E TECNICHE DI PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA INTRODUZIONE L esame del liquido seminale rappresenta il cardine dell iter diagnostico relativo alla valutazione della fertilità maschile. Consente di valutare il potenziale riproduttivo dell uomo e l eventuale necessità di ricorrere a procedure di riproduzione medicalmente assistita (PMA). In quest ultimo caso, mediante l individuazione della corretta strategia da adottare (rapporti mirati, inseminazione intrauterina o FIVET/ICSI) e l utilizzo delle metodiche più adeguate di preparazione del liquido seminale, è stato possibile ottenere gravidanze anche in casi in cui, per impedimenti anatomici o funzionali del partner maschile o femminile, sarebbe stato improbabile, se non impossibile, concepire per via naturale. PARAMETRI SEMINALI CONVENZIONALI L esame seminale comprende la valutazione sia dei parametri macroscopici (liquefazione, odore, ph, viscosità, volume) che microscopici (conta, motilità e morfologia nemaspermiche ed eventuale presenza di agglutinazioni). Secondo il nuovo manuale WHO 2010 sull esame del liquido seminale (1), un campione viene classificato come oligozoospermico (concentrazione <15 M/ml), astenozoospermico (motilità progressiva <32%), teratozoospermico (forme tipiche <4%), normozoospermico (tutti i parametri nella norma), azoospermico (assenza di spermatozoi nell eiaculato). La presenza di agglutinazioni può essere indicativa della presenza di anticorpi antispermatozoo, sebbene sia necessario ricorrere a test più specifici (Mar test o immunobead test) per formulare una diagnosi di infertilità immunologica. Tuttavia, una agglutinazione massiva, falsando la valutazione della concentrazione e della motilità nemaspermiche, influisce negativamente sulla preparazione del campione seminale.
PREPARAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE IN LABORATORIO Lo scopo delle metodiche di selezione nemaspermica consiste nel mimare in vitro, quanto più possibile, le modificazioni che fisiologicamente lo spermatozoo subisce durante il transito nell apparato genitale femminile. Le vie genitali femminili, infatti, svolgono una funzione indispensabile nella preparazione dello spermatozoo all incontro con l ovocita, rendendolo capace di penetrare gli involucri esterni del gamete femminile. La prima fase di tale capacitazione si verifica al momento del contatto con il muco cervicale, il quale agisce da barriera selezionando negativamente gli spermatozoi che presentano alterate motilità e morfologia; il processo sarà poi completato durante il passaggio in utero e nelle tube, fino al raggiungimento del cumulo ooforo. Purtroppo le modificazioni cui lo spermatozoo va incontro durante il transito utero-tubarico sono solo parzialmente sostituibili con le attuali metodiche di capacitazione in vitro. Un postulato considerato irrinunciabile per migliorare le caratteristiche del campione in esame consiste nella necessità di eliminare il plasma seminale e le componenti cellulari non nemaspermiche (leucociti, cellule epiteliali etc ) in esso contenute al fine di ottenere un campione incontaminato. Inoltre, è fondamentale la scelta del terreno di coltura appropriato in cui risospendere il pool di spermatozoi durante il trattamento. Tutti i terreni di coltura utilizzati contengono come base comune una miscela di sali inorganici nota come soluzione salina bilanciata, la cui funzione consiste nel controllare il ph e la pressione osmotica, più un supplemento di carboidrati e aminoacidi che fornisce alle cellule un adeguato apporto energetico. La scelta dei componenti di un terreno di coltura condiziona, ovviamente, il risultato che ci si propone di ottenere. Infatti, tale scelta deve tenere conto delle modificazioni che verranno indotte negli spermatozoi una volta a contatto con il terreno in questione, in modo da sincronizzare al massimo la sua maturazione con i tempi biologici di maturazione dell ovocita. Le metodiche di preparazione seminale consentono dunque di: 1) separare gli spermatozoi dal plasma seminale concentrandoli in un piccolo volume di terreno di coltura; 2) selezionare gli spermatozoi dotati di migliore motilità e morfologia; 3) aumentare le capacità cinetiche degli
spermatozoi selezionati e conservarne la motilità nel tempo; 4) fornire un campione incontaminato. La scelta della metodica di selezione nemaspermica da utilizzare deve: a) essere la meno traumatica per la cellula nemaspermica; b) essere, sia in caso di normospermia che in caso di dispermia, la più utile a seconda delle caratteristiche del campione seminale da preparare. Tuttavia non è garantito che tali metodiche riescano a selezionare spermatozoi funzionali ed effettivamente dotati di capacità fecondante. Le tecniche più comunemente impiegate per la preparazione del liquido seminale sono la migrazione ascendente (swim-up) e la centrifugazione in gradiente discontinuo di densità, spesso precedute da un lavaggio preliminare del campione. Lo swim-up si basa sulla migrazione attiva degli spermatozoi dal plasma seminale in un terreno di coltura appropriato. Inizialmente descritto da Mahadevan e Baker nel 1984 (2), può essere effettuato da pellet (in seguito a diluizione e centrifugazione del campione), o da seme liquefatto (3). Quest'ultimo approccio è da preferire in quanto e stato riportato che lo swim-up da pellet può determinare la produzione di elevati livelli di radicali dell ossigeno (ROS) (4) che, attraverso la perossidazione lipidica, sembrano influire negativamente sulle funzioni spermatiche (5,6). La metodica di separazione per gradiente di densità permette una migliore selezione di spermatozoi di buona qualità, svolgendo allo stesso tempo una potente azione di filtro su tutte le altri componenti seminali (7) consentendo, in particolare, di ridurre la generazione di ROS derivanti da cellule contaminanti o da spermatozoi atipici (8). Inoltre, essendo più facile da standardizzare rispetto allo swim-up, fornisce dei risultati meno variabili. Questa tecnica sfrutta la centrifugazione di plasma seminale stratificato sopra dei gradienti di densità di silice colloidale, che separano le cellule a seconda della loro densità. Inoltre, gli spermatozoi mobili migrano attivamente attraverso il gradiente per formare un soffice pellet alla base del tubo da centrifugazione. Generalmente viene utilizzata una preparazione semplice a due gradienti discontinui di densità, tipicamente 40 % v/v e 80 % v/v.
La scelta della tecnica di preparazione seminale da adottare è dettata dalla natura del campione. Per esempio, secondo il nuovo manuale WHO 2010, lo swim-up da strato è spesso utilizzato quando il campione è considerato per lo più normale, mentre in caso di severa oligozoospermia, teratozoospermia o astenozoospermia, la separazione su gradiente di densità è preferibile in quanto è possibile recuperare un numero maggiore di spermatozoi motili (1). Gli spermatozoi prelevati dall'epididimo e dal tessuto testicolare richiedono una preparazione specifica. L'indicazione tipica per effettuare una aspirazione epididimale è l'azoospermia ostruttiva piuttosto che la disfunzione testicolare. In questo caso, un numero relativamente elevato di spermatozoi può essere ottenuto a fini terapeutici. Gli aspirati epididimali possono essere spesso ottenuti con una minima contaminazione da parte di eritrociti e altre cellule non germinali, rendendo l'isolamento e la selezione degli spermatozoi relativamente semplice. Se si riesce ad ottenere un elevato numero di spermatozoi, la separazione su gradiente di densità può essere un metodo di preparazione efficace; tuttavia, se la conta nemaspermica è bassa è consigliabile effettuare un semplice lavaggio (1). In entrambi i casi la metodica di inseminazione più indicata è la ICSI (IntraCytoplasmic Sperm Injection). Nel caso in cui l azoospermia sia di tipo secretorio, o non sia stato possibile rinvenire spermatozoi nell aspirato epididimale, viene effettuata una biopsia testicolare. Gli spermatozoi testicolari sono invariabilmente imprigionati nel tessuto e contaminati da un elevato numero di eritrociti e altri tipi cellulari. Di conseguenza, al fine di isolare una preparazione pressochè pulita di spermatozoi sono necessari degli step aggiuntivi, primo fra tutti la rottura enzimatica o meccanica dei tubuli seminiferi. Gli spermatozoi così ottenuti vengono preparati tramite semplice lavaggio e utilizzati per la tecnica ICSI, data la scarsità del numero e della percentuale di forme normalmente motili (1). In alcuni uomini, infine, il liquido seminale passa nella vescica al momento della eiaculazione, risultando in aspermia, o assenza apparente di eiaculato. Se non è possibile alcun trattamento farmacologico, o se questo non risulta efficace, gli spermatozoi possono essere recuperati direttamente dall'urina, come descritto nel Manuale WHO 2010. In questo caso, il campione di
urina viene centrifugato al fine di concentrare gli eventuali spermatozoi presenti e in seguito trattato utilizzando la separazione su gradiente di densità. L'alcalinizzazione dell'urina, per esempio per ingestione di bicarbonato di sodio, sembra aumentare la probabilità che gli spermatozoi qui eiaculati mantengano le loro caratteristiche cinetiche (9). TECNICHE DI PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA IUI L inseminazione intrauterina (IUI) è una tecnica di PMA di I livello il cui scopo consiste nell incrementare la densità dei gameti maschili nel sito dove avviene, in vivo, la fecondazione. A questo proposito, il liquido seminale, opportunamente preparato in laboratorio generalmente mediante swim-up o separazione su gradiente di densità, viene depositato nella cavità uterina per mezzo di un catetere sottile. In letteratura non sono ancora riportate chiare evidenze a supporto di una tecnica di preparazione seminale in particolare. Infatti, ad oggi mancano studi controllati randomizzati ben condotti che comparino l efficienza di un gradiente e/o di uno swim-up e/o di un semplice lavaggio e centrifugazione con riferimento ai risultati clinici. Sebbene alcuni studi, sulla base del confronto dei diversi parametri seminali, possano suggerire una preferenza per il trattamento del campione su gradiente di densità, non si possono ancora trarre salde conclusioni a riguardo (10). FIVET La FIVET è una tecnica di PMA di II livello in cui viene favorito l incontro in vitro tra i gameti femminili, prelevati mediante aspirazione transvaginale del liquido follicolare, e quelli maschili, ottenuti in seguito alla preparazione laboratoristica del campione seminale. Poiché ovocita e spermatozoi rimangono in contatto per un lungo periodo di tempo in vitro, è necessario che la preparazione seminale utilizzata sia il più possibile libera da contaminazioni. Di conseguenza, la
tecnica di preparazione seminale da preferire sembra essere la separazione su gradiente di densità, eventualmente seguita da uno swim-up se i parametri seminali basali lo consentono. ICSI La ICSI è una tecnica di PMA di II livello in cui un singolo spermatozoo viene iniettato direttamente nel citoplasma di un ovocita Metafase II, rimosso delle cellule del cumulo. Il campione seminale può essere trattato con le metodiche precedentemente descritte o, nel caso di oligozoospermia severa/criptozoospermia/utilizzo di spermatozoi testicolari o epididimari, tramite un semplice lavaggio seguito da centrifugazione, al fine di concentrare in un piccolo volume gli spermatozoi presenti. Secondo quanto suggerito da De Vos et al. nel 1997 (11), la separazione su gradiente può essere omessa; infatti, la soluzione di PVP in cui vengono posizionati gli spermatozoi poco prima dell inseminazione svolge una funzione simile, in virtù della sua elevata densità. Nel caso della ICSI, al contrario di quanto accade per la tecnica FIVET classica, la scelta dello spermatozoo da inseminare dipende dall operatore, che quindi ricopre un importante ruolo di filtro. La selezione degli spermatozoi avviene normalmente al microscopio invertito all ingrandimento 400x. Tuttavia, recentemente è stato introdotto un nuovo sistema di selezione microscopica degli spermatozoi, mediante studio della morfologia della testa (MSOME: Motile Sperm Organellar Morphology Examination) ad un ingrandimento fino a 6600x. Con questa procedura si possono selezionare spermatozoi privi di anomalie nucleari, quali i vacuoli, da iniettare nell ovocita tramite IMSI (Intracytoplasmic Morphologically-selected Sperm Injection) (12-15). PROSPETTIVE FUTURE E CONCLUSIONI Le tecniche di preparazione del liquido seminale oggi a disposizione permettono di selezionare gli spermatozoi con migliori motilità e morfologia. E noto tuttavia che la relazione tra questi criteri convenzionali e la fertilità non è diretta. Per questo motivo negli ultimi anni sono stati sviluppati nuovi test funzionali che diano indicazioni addizionali sulla qualità dello spermatozoo. Le
metodiche più utilizzate consistono nella valutazione e quantificazione dei fenomeni apoptotici (per esempio il test dell Annessina V e il test del fluorocromo JC-1) e nello studio della frammentazione del DNA (per esempio il TUNEL test). Sulla corrente di questi recenti studi, sono state sviluppate nuove tecniche di separazione nemaspermica in grado di selezionare una popolazione di spermatozoi con una bassa percentuale di cellule apoptotiche e un basso livello di frammentazione del DNA. E stato descritto (16, 17) che già le tecniche convenzionali di preparazione seminale (swim-up e centrifugazione su gradiente) permettono di ottenere una sostanziale riduzione delle cellule apoptotiche, limitando il rischio di utilizzo di spermatozoi non funzionali nelle tecniche di PMA. Recentemente, inoltre, è stata sviluppata una nuova metodica di separazione (MACS: Magnetic Active Cell Sorting) basata sull utilizzo di biglie magnetiche in grado di legarsi all Annessina V esposta sulle cellule in apoptosi. Il MACS si è rilevato un metodo efficiente nella riduzione della percentuale di cellule apoptotiche e, quindi, dei livelli di frammentazione del DNA nei campioni così processati (18). Un altro metodo sviluppato al fine di ridurre il livello di frammentazione nella popolazione di spermatozoi selezionata è la glass-wool filtration (8,19,20), in cui il campione seminale viene filtrato attraverso delle fibre di vetro densamente impacchettate. Per concludere, attualmente esistono diverse tecniche in grado di selezionare gli spermatozoi ritenuti migliori, in termini di potenziale di fertilizzazione e successivo sviluppo embrionale, da utilizzare per le tecniche di PMA. La scelta della metodica deve essere personalizzata sulla base delle caratteristiche del campione seminale e la strategia di inseminazione prescelta. Sono inoltre disponibili nuove metodiche di preparazione seminale che tuttavia risultano ancora poco utilizzate nella pratica clinica e che necessitano di studi ulteriori e sistematici per valutarne la reale efficacia.
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