10-1176-01 REAGENTI PER 96 RILEVAZIONI

Mercodia MPO ELISA Istruzioni per l uso 10-1176-01 REAGENTI PER 96 RILEVAZIONI Prodotto da Mercodia AB, Sylveniusgatan 8A, SE-754 50 Uppsala, Svezia

SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI USATI SULLE ETICHETTE = 96 Reagenti per 96 rilevazioni Data di scadenza Conservare tra 2 e 8ºC Lotto n. Per uso diagnostico in vitro Mercodia 2008, 2009, 2011

USO PREVISTO Mercodia MPO ELISA fornisce un metodo per la determinazione quantitativa di MPO nel plasma-edta. RELAZIONE La mieloperossidasi (MPO), una glicoproteina contenente ferro, è un complesso tetramerico con legami covalenti e un peso molecolare di 150kDa. È composto da due catene alfa glicosilate con PM 59-64 kda e due catene beta non glicosilate con PM 14 kda. La MPO si trova in abbondanza nei granuli azzurrofili primari dei neutrofili ed è presente nei monociti. In risposta a invasione microbica, la MPO è rilasciata dai granuli citoplasmatici dei neutrofili nel fagosoma e nello spazio extracellulare, catalizzando la conversione di perossido di idrogeno e ioni cloro (Cl - ) in acido ipocloroso, un potente agente ossidante. La mieloperossidasi è utilizzata normalmente come marcatore di infiammazioni delle vie aeree causate da asma o irritanti ambientali. Si ritiene che la MPO partecipi a diverse fasi dell'aterogenesi e abbia un ruolo potenziale nella promozione dell'aterosclerosi. L associazione tra livelli elevati di MPO nel siero e la malattia coronarica (CAD) supporta il ruolo importante della MPO come marcatore infiammatorio nella CAD, rendendo possibile l identificazione di pazienti a rischio di episodi cardiaci in assenza di necrosi del miocardio. PRINCIPIO DI PROCEDURA Mercodia MPO ELISA è un immunodosaggio enzimatico a due siti in fase solida. Si basa sulla tecnica del sandwich diretto nella quale due anticorpi monoclonali sono diretti contro determinanti antigenici separati sulla molecola MPO. Durante l incubazione, la MPO nel campione reagisce con anticorpi anti-mpo coniugati a pozzetti di microtitolazione. Dopo il lavaggio, sono aggiunti gli anticorpi anti-mpo coniugati a perossidasi e dopo la seconda incubazione e un semplice lavaggio che rimuove gli anticorpi marcati degli enzimi non legati, il legame coniugato è rilevato tramite reazione con la 3,3,5,5 -tetrametilbenzidina (TMB). La reazione è fermata mediante aggiunta di acido per dare un punto finale colorimetrico che è letto tramite spettrofotometria. PRECAUZIONI E AVVISI Per uso diagnosticoin vitro. In America del Nord: Solo per uso in ricerca. Non adatto all uso durante procedure diagnostiche. Non adatto all uso interno o esterno in umani o animali. I contenuti di questo kit e i suoi residui non devono essere ammessi al contatto con animali ruminanti o suini. La Soluzione Stop in questo kit contiene 0.5 M H 2 SO 4. Seguire le precauzioni di routine per la manipolazione di sostanze chimiche pericolose. Tutti i campioni dei pazienti devono essere manipolati come capaci di trasmettere infezioni. 3

MATERIALI RICHIESTI MA NON INCLUSI Pipette per 25, 50, 100, 200, 250 e 1000 μl (si raccomandano le pipette a ripetizione per l aggiunta della Soluzione enzyme conjugate 1X, Substrate TMB e Soluzione Stop) Beakers e cilindri per la preparazione di reagenti Acqua ridistillata Lettore di micropiastre (filtro da 450 nm) Agitatore di piastre (la velocità raccomandata è di 700-900 giri/minuto, movimento orbitale) Dispositivo di lavaggio per micropiastre 4

REAGENTI Ogni kit MPO ELISA contiene reagenti per 96 pozzetti, sufficienti per 42 campioni e una curva di calibrazione in duplicato. Per serie di analisi più ampie, usare reagenti provenienti da confezioni portanti identici numeri di lotto. La data di scadenza del kit completo è indicata sull'etichetta esterna. Si raccomanda di conservare a una temperatura di 2-8ºC. Coated Plate 1 piastra 96 pozzetti Pronto all uso Anticorpo monoclonale murino anti-mpo strisce da 8 pozzetti Per le strisce di microtitolazione non utilizzate, sigillare nuovamente la confezione con nastro adesivo e conservare a 2-8ºC e utilizzare entro 8 settimane. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 fiale 1000 μl Liofilizzato Codificato con colore giallo Aggiungere 1000 μl Concentrazione indicata sull etichetta della fiala di acqua ridistillata Conservazione dopo la ricostituzione: 2-8 C per 8 settimane. a fiala Per la conservazione di Calibrator ricostituiti per periodi superiori a 8 settimane, conservare a - 20 C. Calibrator 0 1 fiala 1000 μl Pronto all'uso Codificato con colore giallo Sample Buffer 1 fiala 12 ml Pronto all uso Codificato con colore giallo Assay Buffer 1 fiala 12 ml Pronto all uso Codificato con colore rosso Enzyme Conjugate 11X 1 fiala 1.3 ml Preparazione, Anticorpo monoclonale murino anti-mpo coniugato a perossidasi vedi sotto Enzyme Conjugate Buffer 1 fiala 13 ml Pronto all uso Codificato con colore blu. Wash Buffer 21X 1 bottiglia 50 ml Diluire con 1000 ml di acqua ridistillata per preparare la soluzione di Conservazione dopo la diluizione: 2-8 C per 8 settimane. wash buffer 1X. Substrate TMB 1 bottiglia 22 ml Pronto all uso Soluzione incolore Nota! Sensibile alla luce! Soluzione Stop 1 fiala 7 ml Pronto all uso 0.5 M H 2 SO 4 5

Preparazione della soluzione enzyme conjugate 1X Preparare la quantità necessaria della soluzione enzyme conjugate 1X con la diluizione dell Enzyme Conjugate 11X (1+10) nell Enzyme Conjugate Buffer o in base alla tabella sottostante. Mescolare lievemente. Quando si prepara la soluzione enzyme conjugate 1X per tutta la piastra, versare tutto l'enzyme Conjugate Buffer nella fiala dell Enzyme Conjugate 11X. Calibrator Campioni Enzyme Enzyme Numero di strisce Curva in duplicato Conjugate 11X Conjugate Buffer 12 strisce (una piastra) 1 42 1 fiala 1 fiala 8 strisce 1 26 700 μl 7.0 ml 6 strisce 1 18 500 μl 5.0 ml 4 strisce 1 10 350 μl 3.5 ml Conservazione dopo la diluizione: 2-8ºC per due settimane. RACCOLTA E MANIPOLAZIONE DEI CAMPIONI Una considerazione importante nelle condizioni di manipolazione preanalitica è la prevenzione di rilascio artificiale di MPO da neutrofili nei campioni, che può portare a falsi risultati incrementati. Questo è particolarmente importante in quanto l'mpo ha mostrato potenziale come marcatore per la malattia coronarica essendo stato riportato un collegamento tra l'incremento delle concentrazioni di MPO circolante e l'incremento del rischio di malattia coronarica, l'incremento del rischio in pazienti con sindrome coronarica acuta e utilità clinica nell'identificazione e prognosi di pazienti con arresto cardiaco. Concentrazioni di MPO più elevate nel plasma eparinato, plasma citrato e siero possono essere spiegate con un rilascio di MPO da neutrofili in vitro, e tale aumento è dipendente dal tempo a temperatura ambiente dopo il prelievo. Si consiglia l'uso di plasma-edta per la misurazione di MPO perché i valori non sono confusi da un rilascio ex vivo poco controllabile di MPO da neutrofili e può quindi riflettere con maggiore precisione la concentrazione di MPO in circolo. Plasma-EDTA Il plasma-edta è il tipo di campione consigliato per le rilevazioni di MPO. Prelevare il sangue mediante puntura endovenosa in provette contenenti EDTA come anticoagulante e separare la frazione del plasma. I campioni di sangue in plasma-edta possono essere conservati per 1 ora a temperatura ambiente prima di essere centrifugati a 1500g per 10 min. Il plasma separato è analizzato direttamente oppure conservato congelato fino all'analisi. Siero, plasma eparinato e plasma citrato Siero, plasma eparinato e plasma citrato possono essere usati nell'analisi. Il siero o la presenza di eparina o citrato anticoagulante non compromettono la misurazione dell'analita. Tuttavia, quando si valutano i risultati devono essere considerati possibili effetti della manipolazione preanalitica. 6

Conservazione I campioni di sangue in plasma-edta possono essere conservati per 1 ora a temperatura ambiente prima di essere centrifugati a 1500g per 10 min. Il plasma separato è analizzato direttamente oppure conservato congelato sotto i -20ºC fino all'analisi. DILUIZIONE DEI CAMPIONI Di norma, i campioni dovrebbero essere diluiti 1:5 (50 μl campione + 200 μl Sample Buffer) prima dell'analisi. 7

PROCEDURA DEL TEST Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente prima dell uso. Preparare una curva di calibrazione per ciascuna sessione analitica. 1. Ricostituire Calibrator 1-5 con 1000 µl di acqua ridistillata per ogni fiala. 2. Preparare la soluzione enzyme conjugate 1X, la soluzione wash buffer 1X e i campioni. 3. Preparare un numero sufficiente di pozzetti di micropiastre per alloggiare i Calibrators e campioni in duplicato. 4. Pipettare 25 µl di ogni Calibrator e campione negli appositi pozzetti. 5. Aggiungere 100 µl di Assay Buffer ad ogni pozzetto. 6. Incubare in un agitatore di piastre (700-900 rpm) per 1 ora a temperatura ambiente (18-25 C). 7. Lavare 6 volte con 700 μl di soluzione wash buffer 1X a pozzetto utilizzando un lavapiastre automatico con funzione lavaggio overflow, dopo il lavaggio finale invertire e colpire la piastra con decisione sulla carta assorbente. Nella procedura di lavaggio non utilizzare la funzione immersione. Oppure manualmente, Eliminare il volume di reazione capovolgendo la micropiastra su un lavabo. Aggiungere 350 μl di soluzione wash buffer 1X a ogni pozzetto. Eliminare la soluzione wash, picchiettare con decisione più volte contro carta assorbente per rimuovere l'eccesso di liquido. Ripetere 5 volte. Evitare immersioni prolungate durante la procedura di lavaggio. 8. Aggiungere 100 µl di soluzione enzyme conjugate 1X a ogni pozzetto. 9. Incubare in un agitatore di piastre (700-900 rpm) per 1 ora a temperatura ambiente (18-25 C). 10. Lavare come descritto sopra. 11. Aggiungere 200 µl di Substrate TMB a ogni pozzetto. 12. Incubare per 15 minuti a temperature ambiente (18-25ºC). 13. Aggiungere 50 µl di Soluzione Stop a ogni pozzetto. Mettere la piastra in un agitatore per circa 5 secondi per garantire la miscelazione 14. Leggere la densità ottica a 450 nm e calcolare i risultati. Effettuare la lettura entro 30 minuti. Nota! Per evitare qualsiasi contaminazione tra coniugato e substrato devono essere usate pipette distinte. 8

CONTROLLO DI QUALITÀ INTERNO I pool di siero interni con basse, intermedie e alte concentrazioni di MPO devono essere analizzati periodicamente come campioni, e i risultati tracciati di giorno in giorno. È buona norma di laboratorio registrare i seguenti dati per ciascuna analisi: numero di lotto del kit, date di ricostituzione dei componenti del kit, valori di DO per Calibrators e controlli. CALCOLO DEI RISULTATI Nota! Il Calibrator 0 (bianco) non deve essere utilizzato nel calcolo della curva di calibrazione. Calcolo computerizzato La concentrazione di MPO in campioni sconosciuti deve essere calcolata se possibile utilizzando la riduzione di dati computerizzata. Utilizzare le assorbanze ottenute in contrapposizione alle concentrazioni note di Calibrator 1-5 e l'analisi di regressione spline cubica per costruire la curva di calibrazione. Moltiplicare le concentrazioni di MPO calcolate per il fattore di diluizione (es. x5). Calcolo manuale 1. Tracciare i valori di assorbanza ottenuti per i Calibrators 1-5, contro la concentrazione di MPO su carta log-log e costruire una curva di calibrazione manualmente. 2. Leggere la concentrazione dei campioni dalla curva di calibrazione. 3. Moltiplicare le concentrazioni di MPO per il fattore di diluizione (es. x5). 9

Esempio di foglio di calcolo Pozzetti Identità A 450 Conc. μg/l** 1A-B Calibrator 0 0.066/0.062 2C-D Calibrator 1* 0.101/0.108 3E-F Calibrator 2* 0.195/0.193 4G-H Calibrator 3* 0.453/0.468 2A-B Calibrator 4* 1.479/1.422 2C-D Calibrator 5* 2.471/2.476 2E-F Campione 1 0.265/0.260 76 2G-H Campione 2 0.817/0.821 272 3A-B Campione 3 1.582/1.591 548 *Concentrazione indicata sull etichetta della fiala **Risultato moltiplicato per fattore di diluizione (x5) Curva di calibrazione La curva qui mostrata è una curva di calibrazione tipica. Non usare questa curva per determinare i risultati delle analisi reali. Concentrazione (μg/l) 10

LIMITI DELLA PROCEDURA Come tutti i test diagnostici, una diagnosi clinica definitiva non deve essere basata sui risultati di un singolo test, ma dovrebbe essere effettuata dal medico in seguito alla valutazione di tutti i risultati clinici. I campioni lipemici, itterici o emolizzati non interferiscono con l analisi. VALORI PREVISTI La buona pratica prevede che ogni laboratorio stabilisca il proprio intervallo di valori previsti. CARATTERISTICHE DEL RENDIMENTO Limite di rilevabilità Il limite di rivelabilità è definito come la Capacità di Rivelazione in base alla ISO11843-1. La Capacità di Rivelazione deve essere considerata parte di un metodo di verifica, piuttosto che la concentrazione minima misurabile. Il limite di rivelabilità è inferiore alla concentrazione di Calibrator 1 determinata con la metodologia descritta in ISO1183-Parte 4. La concentrazione per campioni con assorbanza inferiore al Calibrator 1 non dovrebbero essere calcolati, bensì espressa come inferiore o uguale ( ) alla concentrazione indicata sulla fiala per il Calibrator 1. Effetto gancio I campioni con una concentrazione fino a 30 000 µg/l sono stati testati senza fornire risultati bassi falsi. Recupero Il recupero all aggiunta è 85 96% (media 89%). Il recupero alla diluizione è 97 108% (media 101%). Precisione Ogni campione è stato analizzato in 4 repliche in 33 momenti diversi. Campione Valore medio (µg/l) % durante l analisi Coefficiente di variazione % tra analisi % totale analisi 1 11.58 4.4 9.7 9.9 2 34.93 3.0 8.5 8.6 3 119.21 3.1 5.3 5.5 11

Specificità Sono state riscontrate le seguenti reazioni crociate: TPO 0.01% CRP 0.01% EPO 3.53% Lisozima 0.03% Elastasi 0.12% Antitripsina alfa 1 0.01% CALIBRAZIONE Il kit MPO ELISA è calibrato in base a una preparazione di MPO commerciale, validata, altamente purificata. La concentrazione di mieloperossidasi è espressa in μg/l. GARANZIA I dati sul rendimento presentati qui sono stati ottenuti usando le procedure indicate. Qualsiasi cambiamento o modifica nella procedura non raccomandata da Mercodia AB può avere effetti sui risultati, in tale caso Mercodia rinuncia a tutte le garanzie espresse, implicite o legali, inclusa la garanzia implicita di commerciabilità o idoneità per l uso. Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati, in tal caso, non saranno responsabili dei danni indiretti o consequenziali. 12

RIFERIMENTI Baldus S. et al. (2003) Myeloperoxidase Serum Levels Predict Risk in Patients With Acute Coronary Syndromes. Circulation 108:1440-1445 Brennan M-L. et al. (2003) Prognostic value of Myeloperoxidase in Patients with Chest Pain. The New England Journal of Medicine 349:1595-1604 Carr A C. et al. (2000) Oxidation of LDL by Myeloperoxidase and Reactive Nitrogen Species. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20:1716-1723 Hazen S L. et al. (1999) Formation of Nitric Oxide-Derived Oxidants by Myeloperoxidase in Monocytes. Circ. Res. 85:950-958 Nambi V. (2005) The Use of Myeloperoxidase As a Risk marker for Atherosclerosis. Current Atherosclerosis Reports 7:127-131 Zhang R. et al. (2001) Association between myeloperoxidase levels and risk of coronary artery disease. JAMA. 286:2136-2142 Klebanoff SJ. (2005) Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol 2005;77:598-625 Scheffer PG. et al. (2009) Myleoperoxidase concentrations in EDTA-plasma of healthy subjects are discordant with concentration in heparin-plasma and serum. Clin Biochem 42:149-1492 Shih J. et al. (2008) Effect of Collection Tube Type and Preanalytical Handling on Myleoperoxidase Concentrations. Clin Chem 54:6 1076-1079 Schindhelm RK. et al. (2009) Myeloperoxidase: a useful biomarker for cardiovascular disease risk stratification? Clin Chem 55:1462-1470 13

SOMMARIO DEL PROTOCOLLO Aggiungere Calibrators e campioni 25 μl Aggiungere Assay Buffer Incubare Lavare piastra con soluzione wash buffer 1X Aggiungere soluzione enzyme conjugate 1X Incubare Lavare piastra con soluzione wash buffer 1X Aggiungere Substrate TMB Incubare Aggiungere Soluzione Stop Misurare A 450 100 μl 1 ora a 18-25 C in agitatore di piastre 6 volte 100 μl 1 ora a 18-25 C in agitatore di piastre 6 volte 200 μl 15 minuti 50 μl Agitare per 5 secondi per garantire la miscelazione Valutare i risultati 31-3154 Versione 6.0