Strumenti e Tecniche di studio in patologia
Gli strumenti della patologia: Microscopia Biologia molecolare Indagini biochimiche
Microscopia Ottica citopatologia ed istopatologia citochimica ed istochimica immunocito(isto isto)chimica immunofluorescenza Microscopia Elettronica A trasmissione A scansione
Campione citologico Persa la geografia spaziale dell organo / tessuto, i criteri diagnostici si basano quasi esclusivamente sulle caratteristiche delle cellule Caratteristiche morfologiche di nucleo e citoplasma forma colore dimensione Pattern di aggregazione cytopath.co.uk
Citologia esfoliativa cellule esfoliate spontaneamente si ritrovano in: Urine Espettorato Secrezioni Versamenti Liquor (liquido cerebrospinale) Citologia per esfoliazione provocata Cellule attivamente asportate dalla superficie cutanea, di una mucosa o di una lesione Citologia per aspirazione con ago sottile http://www.vetmed.wsu.edu/resources/techniques/images/fna_technique.jpg
Campione istologico Mantenuti siti, orientamento e rapporti delle componenti tessutali prelevate Anche nelle lesioni che si discostano molto dall anatomia dell organo da cui derivano, è mantenuta la geografia spaziale tra epitelio, stroma, vasi
Fissazione del campione Quantità di fissativo da utilizzare = rapporto 1:10
in caso di campioni di grandi dimensioni 1 Lesioni più rappresentative 2 Consentire un adeguata fissazione a a cuore
Attenzione!!!!! + Elevato n di pezzi Scarsa quantità di fissativo Ridotta fissazione
Inadeguata fissazione.alterazione della morfologia cellulare preparato istologico illeggibile!!!! Buona fissazione Scarsa fissazione
Attenzione!!!!! Tessuti ricchi di sangue (milza, lesioni emorragiche, ecc.) necessaria la sostituzione periodica del fissativo 1) Incompleta fissazione 2) Formazione di pigmenti formalinici
Fissazione Scopi: 1) Immobilizzazione dei costituenti cellulari e tissutali 2) Inattivazione enzimi autolisanti 3) Inattivazione batteri 4) Conferimento di stabilità strutturale ai costituenti chimici del protoplasma Fissazione completa dopo 24 ore
Requisiti dei fissativi Elevato potere di penetrazione Fissazione uniforme NO coartazione tissutale Preparazione dei pezzi per l inclusione in paraffina Compatibilità con numerose colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche
FISSAZIONE MEDIANTE. Agenti chimici Agenti fisici - congelamento - composti organici - composti inorganici - calore
Fissativi semplici Formaldeide - in commercio al 40% in soluzione acquosa (formalina) - si usa al 10% (90 volumi di acqua, 10 volumi di formalina), neutra e tamponata - assenza di neutralità: produzione di acido formico nella soluzione (riduzione dell effetto di fissazione!!!) Alto grado di penetrazione No eccessivo indurimento dei tessuti No dissoluzione dei lipidi Immersione per lungo tempo Formazione di legami a ponte tra residui di lisina NO modificazione importante della struttura proteica
Pericolosità dei fissativi Formaldeide: - Tossica - Infiammabile - Irritante
1) Fissazione 2) Disidratazione 3) Chiarificazione 4) Inclusione in paraffina 5) Taglio delle sezioni 6) Colorazione
50 % etanolo 70 % etanolo Disidratazione Tessuto fresco Fissazione in formalina 95 % etanolo 100 % etanolo xylolo paraffina
Inclusione in paraffina
Taglio delle sezioni sezione vetrino
Colorazione
Identificazione N rif. Istologico Tessuto od organo Specie animale Colorazione
Colorazioni cito-istochimiche - forniscono informazioni sul contenuto e sulla natura delle sostanze chimiche contenute nelle cellule (citochimica) o nei tessuti biologici (istochimica) Alcian - sfruttano la proprietà di alcuni reagenti di interagire con specifici composti chimici contenuti in cellule e tessuti formando dei prodotti colorati visibili al microscopi ottico - utilizzabili anche per rilevare la presenza di alcuni tipi di agenti biologici all interno dei tessuti (es. batteri, funghi, protozoi) Ziehl-Neelsen Grocott
Tecniche immunologiche Visualizzazione di una reazione antigene-anticorpo anticorpo mediante l utilizzo l di marcatori fluorocromi Complesso enzima + substrato cromogeno IMMUNOFLUORESCENZA IMMUNOISTOCHIMICA
PRINCIPIO DI BASE Immunofluorescenza Fluorocromi: fluoresceina, texas red, rodamina, ecc. DIRETTA INDIRETTA
Enzima Immunocito citochimicachimica substrato perossidasi 1) DAB (3,3- diaminobenzidina tetraidrocloruro) 2) AEC (3-amino-9- etilcarbazolo) 3) CN (4-cloro-1-naftol) Fosfatasi alcalina Immunoisto istochimica 1) Fast red 2) Fast blue BB Preparati citologici o sezioni istologiche sottoposte a reazioni immunocito(isto)chimiche portano alla formazione di un prodotto colorato che può essere analizzato al microscopio ottico DIRETTA INDIRETTA
Applicazioni dell immunoistochimica: ricerca di base diagnostica routinaria Esempi in campo diagnostico: - individuazione di antigeni di agenti patogeni nei tessuti - discriminazione tra neoplasie di diversa istogenesi - migliorare la caratterizzazione di neoplasie appartenenti ad uno stesso gruppo (es. linfomi) - identificare l origine di una metastasi di cui non si conosce il tumore primitivo (per es. marcatori tessuto specifici) Valutazione di marker prognostici/predittivi nei tessuti neoplastici
PCR - Polymerase Chain Reaction (Reazione a Catena della Polimerasi) tecnica in vitro per l amplificazione esponenziale di una sequenza di DNA disposta tra due regioni a sequenza nota l amplificazione richiede la presenza di primers, ossia oligoncleotidi a singola filamento complementari alle estremità della regione a sequenza nota Consente il reperimento di quantità anche minime di materiale genetico (DNA) presente nei campioni inviati RT (reverse transcription) PCR: variante della tecnica PCR che consente di amplificare una molecola di DNA partendo da un insieme di RNA totali estratti da un tipo cellulare http://www.gene-quantification.de/block.html
ESEMPI DI APPLICAZIONI DELLA PCR 1. Identificazione di agenti patogeni in campioni biologici umani o animali, o negli alimenti (virus e batteri ) 2. Identificazione di organismi geneticamente modificati (OGM) 3. Ricerca di farine di origine animale nei mangimi destinati all'alimentazione del bestiame 4. Analisi del DNA in medicina legale (es. test di paternità) 5. Diagnosi di malattie genetiche