La saliva quale mezzo diagnostico di assunzione recente di cannabinoidi

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1 La saliva quale mezzo diagnostico di assunzione recente di cannabinoidi Nunziata Barbera 1, Vincenzo Piazza 1, Ferruccio Santangelo 1, Guido Romano 1 Riassunto Gli Autori propongono l utilizzo della saliva quale substrato diagnostico alternativo al sangue per identificare lo stato di intossicazione acuta da cannabinoidi. Lo studio è stato condotto su otto soggetti di sesso maschile, consumatori occasionali di Cannabis. I campioni di saliva, prelevati ad intervalli di tempo costanti dopo il fumo di uno spinello, sono stati esaminati mediante GC/MS. La presenza di cannabinoidi è stata rilevata sino a quattro ore dopo l assunzione. La metodica analitica utilizzata risulta di facile esecuzione e non invasiva, e potrebbe pertanto essere efficacemente adottata per l identificazione dei soggetti in stato di alterazione psicofisica conseguente all uso di derivati della Cannabis. Parole chiave: Cannabinoidi, Intossicazione acuta, Diagnosi, Saliva Abstract Saliva analysis as a tool for diagnosing the recent use of cannabinoids The Authors evaluate the reliability of saliva analysis as a practical alternative to blood analysis for identifying acute cannabinoid intoxication. The study was carried out on eight male volunteers who occasionally use Cannabis. Saliva samples were collected at regular intervals, after the volunteers had smoked a joint. Saliva analysis was performed using GC/MS. The results suggest that saliva samples could be used as a new effective diagnostic tool to detect THC, CBD and CBN up to four hours after smoking. Keywords: Cannabinoids, Acute intoxication, Diagnosis, Saliva Introduzione L accertamento dello stato di intossicazione acuta da sostanze stupefacenti e psicotrope costituisce ancor oggi, per quanti operanti nel settore tossicologico-forense, uno dei punti di maggiore difficoltà applicativa e procedurale. La valutazione dello stato di intossicazione acuta da stupefacenti si pone al centro di un complesso vuoto normativo che - di fatto - limita fortemente la sua concreta esecuzione. Allo stato attuale, infatti, l unico riferimento normativo in ordine all accertamento degli stati d abuso è rappresentato dal D.M. 12 luglio 1990, n.186, Regolamento concernente la determinazione delle procedure diagnostiche e medico-legali per accertare l uso abituale di sostanze stupefacenti o psicotrope. Tale regolamento, tuttavia, definisce le procedure diagnostiche e medico-legali finalizzate non tanto all accertamento degli stati di intossicazione acuta, quanto piuttosto all individuazione dei comportamenti abituali d abuso; da ciò discende, quindi, l oggettiva difficoltà diagnostico-procedurale sottesa alla valutazione delle intossicazioni attuali da stupefacenti. I cannabinoidi, in particolare, sono spesso implicati nella dinamica di sinistri stradali. Crouch e coll. (1), in uno studio condotto su 168 guidatori deceduti in seguito ad incidente stradale, segnalano che il 67% dei guidatori deceduti presentava a livello ematico una o più sostanze d abuso prevalentemente rappresentate da cannabinoidi e alcool. In un altro studio, effettuato su 600 guidatori deceduti in incidenti stradali, il 66% risultava positivo per stupefacenti e alcool, e di questi circa il 10% presentava livelli ematici di cannabinoidi superiori a 3 ng/ml (2). Lund e coll. (3), in uno studio riguardante 317 autotrasportatori, rilevarono la presenza di THC nel sangue e nelle urine del 16% 1 Dipartimento di Anatomia, Patologia Diagnostica, Medicina Legale, Igiene e Sanità Pubblica - Università degli Studi di Catania - via Santa Sofia 87 - comparto Catania - tel fax toxicologyct@hotmail.com 27

2 Boll. Farmacodip. e Alcoolis., XXV (1-2) 2002 dei campioni analizzati; il 3% di tali soggetti si presentava in stato di intossicazione acuta. Anche in Italia gli incidenti stradali costituiscono un grave problema sociale, rappresentando la prima causa di morte nella fascia d età compresa tra i 15 ed i 24 anni, e la quarta causa di morte nella popolazione in generale. Una ricerca epidemiologica condotta dalla Regione Veneto, dall Assessorato alla Sanità, dall Azienda Ospedaliera e dall Università di Padova, nell ambito di una Campagna di prevenzione degli incidenti stradali condotta a partire dal 1994, ha esaminato l incidenza del consumo di alcool, di droghe e di farmaci in diverse popolazioni di utenti della strada rilevando le frequenze medie di tali sostanze nei conducenti durante i fine settimana. Da tali accertamenti, effettuati su sangue e urine, è emerso che il 29,5% risultava intossicato da alcool e il 14% da stupefacenti, di questi ultimi il 70% era positivo per i cannabinoidi (4). Le difficoltà legate all accertamento dello stato di intossicazione acuta da stupefacenti sono principalmente connesse alla impossibilità di sottoporre i soggetti a prelievo ematico coatto perché ritenuto modalità di accertamento eccessivamente invadente la sfera dell integrità fisica e di autodeterminazione, e ciò in linea con l interpretazione giurisprudenziale corrente secondo cui i necessari accertamenti e rilievi sulla persona debbano essere eseguiti senza violare gli artt. 13 e 32 della Costituzione (5, 6). Per cui, se da una parte i disposti legislativi relativi all esecuzione di tale accertamento escludono la possibilità del ricorso a metodiche invasive, dall altra, l esame tossicologico su campione ematico costituisce - allo stato attuale - l unico metodo in grado di documentare l assunzione acuta, essendo invece la presenza di sostanze stupefacenti e/o dei loro metaboliti nelle urine o nei capelli indice di assunzione pregressa. Inoltre, sebbene la normativa vigente (art. 187 C.d.S.) preveda che l accertamento dello stato psicofisico possa essere effettuato in base alla sintomatologia presentata dal conducente, tale metodo sembra difficilmente applicabile ai derivati dei cannabinoidi in quanto quest ultimi non danno alcun rilievo semeiologicamente apprezzabile. Del tutto recentemente numerosi studi sperimentali hanno indagato la possibilità di effettuare indagini chimico-tossicologiche su campioni biologici alternativi a quello ematico. Di particolare interesse sono gli studi relativi all individuazione di sostanze stupefacenti su campioni di saliva (7). È stato visto infatti che la somministrazione di eroina (8, 9) e cocaina (9-13), per via intranasale, endovenosa o inalatoria, dà luogo a concentrazioni salivari rilevabili gascromatograficamente. Nel caso di eroina e cocaina, pare inoltre che la loro presenza a livello salivare sia dovuta a fenomeni di ridistribuzione; tale ipotesi è peraltro confermata dalla concomitante presenza dei loro metaboliti. Indipendentemente dalla via di somministrazione, infatti, in seguito ad assunzione di eroina è possibile evidenziare a livello salivare la monoacetilmorfina e la morfina, e nel caso della cocaina, anche la benzoilecgonina. Poiché la saliva rappresenta l ultrafiltrato dei fluidi interstiziali, nel caso di eroina e cocaina la ridistribuzione dal compartimento ematico verso le ghiandole salivari è possibile per le caratteristiche fisico-chimiche di tali molecole, e in particolare idrosolubilità e pka (8-13). Di contro, nel caso di altre sostanze stupefacenti, quali, ad esempio, i derivati della Cannabis, la loro elevata liposolubilità limita fortemente la loro cinetica nei mezzi acquosi. In tal senso sono stati effettuati numerosi studi sperimentali volti a verificare la possibilità di individuare i cannabinoidi a livello salivare. In uno studio condotto su 325 volontari dopo assunzione di cannabinoidi è stato rilevato che la concentrazione salivare di THC riflette quella presente a livello ematico, sebbene non consenta di operare una precisa correlazione (14). Sembra, inoltre, che in alcuni casi il THC è determinabile nella saliva per un periodo di tempo più lungo rispetto al sangue (15). I dati presenti in letteratura riportano che il THC salivare è determinabile fino a 8 ore dopo l assunzione, e che il suo metabolita permane sino a 14 ore dopo (16). Le concentrazioni di THC rilevabili nella saliva rientrano in un range piuttosto ampio, compreso tra 5 e 330 ng/ml (14, 15, 17). Tuttavia non sono ben chiari i metodi mediante i quali vengono effettuati i prelievi dei campioni di saliva. È noto infatti che l assunzione di cannabinoidi è associata a secchezza delle fauci con produzione di scarsa quantità di saliva densa, rendendo poco agevole il prelievo dei campioni. Altrettanto poco indagata risulta essere l influenza esercitata dall assunzione di cibo e di bevande sulla determinazione dei cannabinoidi a livello salivare. Il presente studio è stato volto alla sperimentazione di un metodo rapido ed efficace per il prelievo della saliva, ed alla valutazione dell eventuale influenza dell assunzione di cibo e alcool sulle concentrazioni salivari di cannabinoidi, e segnatamente del cannabidiolo (CBD), del D 9 -tetraidrocannabinolo (D 9 -THC) e del cannabinolo (CBN). Materiali e metodi Gruppo sperimentale Lo studio è stato condotto su 8 volontari di sesso maschile, consumatori occasionali di cannabinoidi. I soggetti sono stati invitati a confezionare nove spinelli con uguale contenuto di miscela di tabacco e hashish, secondo le modalità usuali. Otto spinelli sono stati utilizzati dai componenti del gruppo (uno spinello per partecipante), mentre uno spinello è stato sottoposto ad analisi chimico-tossicologica al fine di rilevarne il contenuto di principio attivo. Il quantitativo medio di cannabinoidi presente nello spinello analizzato è risultato il seguente: THC 15,8 mg, CBD 9 mg, CBN 3,6 mg. Quattro soggetti (A-D) sono stati invitati a non consumare cibo, né bevande né a fumare sigarette per tutta la durata dell esperimento; mentre, al fine di verificare l effetto dell assunzione di alcool e cibo sulla concentrazione salivare di cannabinoidi, i soggetti E ed F sono stati invitati a consumare una bottiglia di birra subito dopo aver fumato lo 28 La saliva quale mezzo diagnostico di assunzione recente di cannabinoidi

3 spinello, ed i soggetti G ed H a consumare un pacchetto di cracker e bere due bicchieri di acqua dopo aver fumato lo spinello. Prelievo dei campioni di saliva Ogni soggetto è stato sottoposto a ripetuti prelievi di saliva dopo aver fumato lo spinello. I campioni di saliva sono stati raccolti mediante lavaggio della cavità buccale con 2 ml di una soluzione di acqua e alcool etilico al 5%. A tale scopo, ad ogni partecipante sono stati forniti dei flaconcini di vetro, muniti di tappo a vite, contenenti l esatta quantità di soluzione di lavaggio già preparata. I prelievi di saliva sono stati effettuati secondo i tempi riportati nel seguente protocollo: Soggetto A: 15 minuti, 1 ora, 2 ore, 3 ore, 4 ore; Soggetto B: 1 ora, 2 ore, 3 ore, 4 ore; Soggetto C: 2 ore, 3 ore, 4 ore; Soggetto D: 3 ore e 4 ore; Soggetto E: (dopo aver bevuto) 1 ora, 2 ore, 3 ore e 4 ore; Soggetto F: (dopo aver bevuto) 1 ora, 2 ore, 3 ore e 4 Soggetto G: (dopo aver mangiato) 1ora, 2 ore, 3 ore, 4 Soggetto H: (dopo aver mangiato) 1ora, 2 ore, 3 ore, 4 Ai tempi stabiliti come da protocollo, ogni partecipante ha effettuato il risciacquo della cavità buccale per 30 secondi; il campione è stato quindi emesso direttamente nello stesso flacone mediante apposito imbuto di vetro. Estrazione del campione Dopo aggiunta di metaqualone come standard interno (10 ng/ml), ogni campione è stato estratto con 2 ml di n- esano:etile acetato nel rapporto di 9:1. Dopo centrifugazione per 2 minuti a 3000 rpm, la fase organica è stata prelevata e lavata con 2 ml di acqua distillata. Dopo ulteriore centrifugazione per 1 minuto a 3000 rpm, la fase organica è stata prelevata ed evaporata in corrente di azoto. Il residuo secco è stato quindi ripreso con 20 ml di acetone. Analisi GC/MS L analisi è stata condotta iniettando 1 ml delle soluzioni acetoniche precedentemente preparate in un gascromatografo Hewlett-Packard (HP), mod. 5890, collegato ad uno spettrometro di massa HP mod. 5989B e ad un computer HP Vectra XM2 alle seguenti condizioni operative: Colonna: Ultra2 (Crosslinked 5% PH ME Siloxane) 12 m x 0,2 mm i.d. x 0,33 mm film thickness; Temperatura colonna: isoterma a 70 C per 1 minuto, incremento di 50 C/min sino a 210 C, incremento di 3 C/min sino a 240 C, incremento di 30 C/min sino a 290 C; isoterma a 290 C per 2 minuti; Temperatura iniettore: 250 C; Temperatura interfaccia: 280 C; Temperatura sorgente: 250 C; Temperatura quadrupolo: 100 C; Gas vettore: elio 1 ml/min. Acquisizione dei dati L acquisizione dei dati è stata effettuata mediante Selected ion monitoring (SIM) utilizzando i seguenti rapporti massa/carica (m/z): CBD: m/z 231, 232, 246, 314; THC: m/z 299, 300, 314, 315; CBN: m/z 295, 296, 310; Metaqualone: m/z 235, 250. Curva di calibrazione La curva di calibrazione è stata realizzata mediante analisi di campioni di saliva di controllo, prelevati secondo le modalità sopra descritte, addizionati con quantità note di CBD, THC e CBN (5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml e 500ng/ml) e di standard interno (metaqualone 10 ng/ml), estratti ed analizzati secondo la metodica utilizzata per i campioni in esame Risultati I dati delle indagini eseguite in GC/MS relative alle concentrazioni salivari di CBD, THC e CBN (ng/ml) sono riportati nella tabella 1. Si ricorda che i soggetti A-D non hanno assunto né cibo, né bevande per tutta la durata dell esperimento mentre i soggetti E ed F hanno bevuto una bottiglia di birra, ed i soggetti G ed H hanno mangiato un pacchetto di cracker ed hanno bevuto due bicchieri d acqua dopo aver fumato lo spinello. Discussione Dalla nostra indagine sperimentale è emerso che in seguito ad assunzione di derivati della Cannabis per via inalatoria è possibile rilevare la presenza di cannabinoidi a livello salivare. Il presente lavoro ha inoltre dimostrato che nei soggetti che si sono astenuti da cibo e bevande, concentrazioni di CBD, THC e CBN sono ancora determinabili 4 ore dopo il fumo di uno spinello contenente circa 15 mg di THC. Anche nei soggetti che avevano assunto una bottiglia di birra subito dopo il fumo dello spinello è stato possibile rilevare la presenza di cannabinoidi, sebbene in concentrazioni lievemente più basse, in tutti e quattro i prelievi effettuati ad intervalli di un ora. Di particolare interesse è invece il dato relativo ai soggetti che avevano assunto cracker subito dopo aver fumato: contrariamente ai dati riportati in letteratura (14, 15, 17), infatti, la presenza di cannabinoidi è stata accertata solo nel primo prelievo salivare effettuato un ora dopo il fumo dello spinello. Le concentrazioni erano tuttavia molto basse e già alla seconda ora il test dava esito negativo. Tale risultato è indicativo del fatto che le concentrazioni di cannabinoidi rilevabili nella saliva non provengono da processi di ridistribuzione dal compartimento ematico verso quello salivare, quanto piuttosto da fenomeni di sequestro da parte della stessa cavità buccale durante il fumo dello spinello. Tale ipotesi è peraltro confermata da un altro studio sperimentale (17) in cui è stato dimostrato che la somministrazione endovenosa di cannabinoidi non determina la presen- La saliva quale mezzo diagnostico di assunzione recente di cannabinoidi 29

4 Boll. Farmacodip. e Alcoolis., XXV (1-2) 2002 za di THC nella saliva. L ipotesi che i cannabinoidi non siano in grado di attraversare il compartimento ematico per giungere alle ghiandole salivari troverebbe spiegazione nella natura fortemente lipofila del THC, che renderebbe particolarmente difficile la sua cinetica in mezzi acquosi. Altro punto di particolare interesse è rappresentato dalla tecnica utilizzata per il prelievo. Al fine di ovviare alla scarsa produzione di saliva, peraltro densa, che si verifica in seguito ad assunzione di Cannabis, è stata utilizzata una modalità di prelievo che prevede il risciacquo della cavità buccale con quantità prefissate di soluzione di acqua e alcool etilico al 5%. Tale tecnica, oltre a rendere agevole il prelievo, consente di asportare in maniera più accurata i cannabinoidi presenti nella cavità buccale. L impiego di tale miscela idro-alcoolica, in quantità prestabilita e costante, e con tempi di risciacquo definiti, rende il prelievo più preciso e accurato; inoltre il campione così prelevato può essere direttamente utilizzato per l estrazione dei cannabinoidi, eliminando la necessità di tecniche di deproteinizzazione, e fornendo risultati riproducibili. I risultati ottenuti dal presente studio, contrariamente a quanto sostenuto da Kintz e coll. (18) che reputano l utilizzo della saliva suscettibile di falsi positivi e falsi negativi, inducono a ritenere che i campioni di saliva possano essere validamente utilizzati quale substrato d indagine per l accertamento dell assunzione recente di cannabinoidi. Il riscontro di THC nella saliva infatti è strettamente correlato alla modalità stessa dell assunzione dato che la cavità buccale costituisce il percorso obbligato del fumo durante l aspirazione degli spinelli e ciò escluderebbe la possibilità di falsi positivi. In conclusione, il nostro studio consente di ipotizzare che i cannabinoidi presenti nella saliva derivino non tanto da processi di ridistribuzione dal sangue verso le ghiandole salivari, quanto piuttosto da fenomeni correlati al sequestro dei cannabinoidi presenti nel fumo da parte della stessa cavità buccale. Sebbene le concentrazioni di cannabinoidi nella saliva non siano in realtà correlabili a quelle presenti a livello ematico, tale test consente tuttavia di stabilire se il soggetto ha assunto di recente derivati della Cannabis. Il riscontro di quantità determinabili di cannabinoidi fino a 4 ore dopo l assunzione consente di indagare, inoltre, l arco di tempo durante il quale il THC esercita i suoi effetti, sebbene questi possano non essere più avvertiti soggettivamente. Bibliografia 1) Crouch DJ, Merritt MB, Gust S, Rollins D, Walsh J, Mouden J, Quinlan K, Beckel R. The prevalence of drugs and alcool in fatally injured truck drivers. J Forensic Sci 1993; 38: ) Mason A, McBay A. 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La legge non può in nessun caso violare i limiti imposti dal rispetto della persona umana. 7) Schramm W, Smith RH, Craig PA, Kidwell DA. Drugs of abuse in saliva: a review. J Anal Toxicol 1992; 16:1-7. 8) Goldberger DA, Darwin WD, Grant TM, Allen AC, Caplan YH, Cone EJ. Measurement of heroin and its metabolites by isotope-dilution electron-impact mass spectrometry. Clin Chem 1993; 34: ) Jenkins AJ, Oyler JM, Cone EJ. Comparison of heroin and cocaine concentrations in saliva with concentrations in blood and plasma. J Anal Toxicol 1995; 19: ) Inaba T, Stewart DJ, Kalow W. Metabolism of cocaine in man. Clin Pharmacol Ther 1978; 23: ) Thompson LK, Yousefnejad D, Kumor K, Sherer M, Cone EJ. Confirmation of cocaine in human saliva after intravenous use. J Anal Toxicol 1987; 11: ) Cone EJ, Kumor K, Thompson LK, Sherer M. Correlation of saliva cocaine levels with plasma levels and with pharmacologic effects after intravenous cocaine administration in human subjects. 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5 Tabella 1. Concentrazioni di THC, CBD e CBN (ng/ml) rilevate nella saliva degli otto soggetti, a diversi intervalli di tempo dopo il fumo di uno spinello contenente circa 15,8 mg di THC, 9 mg di CBD e 3,6 mg di CBN. I soggetti A-D si sono astenuti dal cibo, dalle bevande e dal fumo; i soggetti E ed F hanno bevuto una bottiglia di birra subito dopo aver fumato lo spinello; i soggetti G ed H hanno mangiato un pacchetto di cracker e bevuto due bicchieri di acqua dopo aver fumato lo spinello. 15 min CBD 481 THC 197 CBN 92 A B C D E F G H 1 ora CBD THC CBN ore CBD THC CBN ore CBD THC CBN ore CBD THC CBN La saliva quale mezzo diagnostico di assunzione recente di cannabinoidi 31