TECNICHE CENTRIFUGATIVE

Transcript

1 TECNICHE CENTRIFUGATIVE

2 Le tecniche di separazione mediante centrifugazione sfruttano il comportamento delle particelle all interno di un campo centrifugo applicato

3 Lo scopo di tali metodiche e quello di esercitare sulle particelle una forza maggiore rispetto a quella esercitata dal campo gravitazionale terrestre, in modo tale da aumentare la loro velocita di sedimentazione

4 Grazie a tali metodiche, le particelle che differiscono per densita, forma o dimensione possono essere separate tra di loro, poiche sedimentano a velocita diverse. Ogni velocità risulta direttamente proporzionale al campo centrifugo applicato

5 PRINCIPI DI BASE DELLA SEDIMENTAZIONE La velocita di sedimentazione dipende dal campo centrifugo (G) applicato, che e diretto radialmente verso l esterno; esso e funzione della velocita angolare del rotore (, in radianti/sec) e della distanza della particella dall asse di rotazione (r, in cm), in base all equazione: G= 2 r

6 Essendo una rivoluzione del rotore pari a 2 radianti, la velocita angolare del rotore, in radianti al secondo, puo facilmente essere espressa in termini di rivoluzioni al minuto (rpm), ovvero: = 2 rpm/60

7 Il campo centrifugo (G) espresso in rpm diventa: G= 2 r 4 2 (rpm) 2 r/3600 ed e generalmente espresso in multipli del campo gravitazionale terrestre, cioe come rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo ed il peso della stessa in presenza della sola forza di gravita

8 Quindi, G e definito in termini di campo centrifugo relativo (RCF) o, piu comunemente, come numero di g (dove g è il campo gravitazionale terrestre, pari a 980 cm s -2 ): RCF= G/980 RCF= (1, ) rpm 2 r

9 NOMOGRAMMA Allineando due valori, ad es. il raggio del rotore e la forza centrifuga relativa si può leggere sulla terza colonna, direttamente come intercetta della retta, il valore in rpm cercato. due valori noti terzo valore ottenuto Raggio del rotore mm Forza Centrifuga Relativa RCF o x g Velocità di rotaz. per minuto rpm

10 Si deve tener presente che la velocita di sedimentazione di una particella dipende non solo dal campo centrifugo applicato, ma anche dalla sua massa, densita e forma, oltre che dalla densità e viscosita del solvente in cui avviene la sedimentazione

11 Nel corso della sedimentazione, inoltre, la particella e sottoposta ad una forza netta verso l esterno (F), che e data dall espressione: F=4/3 r p 3 ( p - m ) 2 r» 4/3 r p 3 =volume della sfera di raggio rp» p =densita della particella» m =densita del mezzo» r= distanza della particella dal centro di rotazione

12 Tuttavia, le particelle generano attrito quando migrano attraverso la soluzione; se si assume che la particella sia sferica e che si muova con velocita nota, allora la forza d attrito che si oppone al moto della particella e data dalla legge di Stokes: ƒ0 = 6 rp» ƒ 0 = coefficiente d attrito per una particella sferica» = coefficiente di viscosita del mezzo» = velocita di sedimentazione della particella

13 Una particella di volume e densita noti, in un mezzo a densita costante, sara percio accelerata in un campo centrifugo fino a quando la forza applicata sulla particella stessa sara uguale alla forza d attito, cioe quando: F = ƒ0 4/3 r p 3 ( p - m ) 2 r= 6 rp

14 In pratica, le due forze si eguagliano abbastanza rapidamente, con il risultato che la particella sedimenta a velocita costante; quindi, la velocita e data da: = dr/dt = 2/9 r p 2 ( p - m ) 2 r/

15 Integrando tale equazione, e possibile ricavare il tempo di sedimetazione di una particella sferica sottoposta ad un campo centrifugo, in funzione delle variabili implicate e della lunghezza del percorso compiuto dalla particella nella provetta da centrifuga: t = 9 /2 2 r p 2 ( p - m ) ln r b /r t» t =tempo di sedimentazione in secondi» r t =distanza radiale dall asse di rotazione al menisco del liquido» r b = distanza radiale dall asse di rotazione al fondo della provetta

16 La velocita di sedimentazione puo anche essere espressa in termini di velocita di sedimentazione per unita di campo centrifugo applicato, comunemente detta coefficiente di sedimentazione (s). Se il mezzo ha una composizione definita, la velocita di sedimentazione e proporzionale a 2 r, quindi l equazione si semplifica in: =s 2 r s= / 2 r

17 Gli studi di velocita di sedimentazione possono essere eseguiti impiegando svariati sistemi soluto-solvente; il valore misurato del coefficiente di sedimentazione, influenzato dalla temperatura, dalla densita e dalla viscosita della soluzione, viene spesso corretto nel valore che si otterrebbe in un mezzo la cui viscosita e densita fossero pari a quelle dell acqua a 20ºC, espresso come coefficiente di sedimentazione standard (S 20,w )

18 N.B.:I coefficienti di sedimentazione della maggior parte delle strutture biologiche sono molto piccoli e, per comodita, viene presa come unita di misura il valore di secondi, che viene definito come unita di Svedberg (S)

19 1 S (Svedberg) = sec

20 CENTRIFUGHE E LORO UTILIZZO Le centrifughe possono essere classificate in quattro categorie principali: piccole centrifughe da banco; centrifughe refrigerate a grande capacita ; centrifughe refrigerate ad alta velocita ; ultracentrifughe

21 PICCOLE CENTRIFUGHE DA BANCO» Sono le piu semplici e le meno costose» Impiegate solitamente per raccogliere piccole quantita di materiale che sedimenta rapidamente» Velocita max compresa tra rpm» Operano generalmente a temperatura ambiente

22 CENTRIFUGHE REFRIGERATE A GRANDE CAPACITA» Hanno una velocita max di 600 rpm» Sono dotate di camere del rotore refrigerate» Possono impiegare una varieta di rotori intercambiabili

23 CENTRIFUGHE REFRIGERATE AD ALTA VELOCITA» Velocita max di rpm» Rotori intercambiabili» Impiegate soprattutto nella raccolta di microrganismi,frammenti cellulari e organuli cellulari

24 ULTRACENTRIFUGHE» Preparative:» Velocita max di rpm;» Camera del rotore refrigerata, blindata e sottovuoto;» Sofisticato sistema di controllo della temperatura» Analitiche:» Velocita max di rpm;» Camera del rotore refrigerata, blindata e sottovuoto;» Dotate di un sistema ottico per l osservazione del materiale

25 Tipi di centrifughe Centrifughe da banco Ultracentrifughe centrifuga

26 Velocità di centrifugazione VELOCITA' BASSA MEDIA ALTA ULTRA Velocità (rpm) / Gravità (xg) / Capacità 9 litri 1 litro 3 litri 1.500/40 ml Raffreddamento no alcune tutte tutte Vuoto no no alcune tutte

27 SISTEMA DI ULTRACENTRIFUGA ANALITICA CON SISTEMA OTTICO DI SCHLIEREN

28 PRINCIPALI TIPI DI ROTORI» Rotori a bracci oscillanti;» Rotori ad angolo fisso;» Rotori per tubi ad alloggiamento verticale

29 ROTORI AD ANGOLO FISSO» Le provette sono poste in cavita scavate nel corpo del rotore e formano un angolo fisso tra 14 e 40º rispetto alla verticale

30 ROTORI Rotori ad angolo fisso - hanno gli alloggiamenti per i tubi disposti circolarmente attorno all asse di rotazione ad un certo angolo prefissato che varia in genere tra 20 e 40. Quando le particelle sono proiettate contro le pareti, scivolano verso il fondo con la formazione del pellet. Asse di rotazione # Coperchio del rotore (a tenuta d aria) Coperchio del tubo da centrifuga

31 ROTORE A BRACCI OSCILLANTI» Possiede bracci che durante l accelerazione del rotore si portano in posizione orizzontale, in modo tale che la provetta sia perpendicolare all asse di rotazione e parallela al campo centrifugo applicato

32 ROTORI Rotori oscillanti o ad angolo mobile - A riposo, i tubi rimangono in posizione orizzontale, ma quando il rotore inizia a girare, per effetto della accelerazione centrifuga, i tubi ruotano sui perni verso l esterno, disponendosi orizzontalmente. I rotori oscillanti consentono una formazione di bande di sedimento ben differenziate e di pellet più uniformi, ma hanno una maggiore delicatezza rispetto ai rotori ad angolo fisso.

33 ROTORI PER TUBI AD ALLOGGIAMENTO VERTICALE» Rotore ad angolo fisso nullo, in cui le provette sono sempre allineate verticalmente al corpo del rotore

34 Tipi di rotori Rotore swing-out Rotore ad angolo fisso Rotore zonale

35 Metodi di separazione nell ultracentrifugazione preparativa

36 CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE» Il materiale che dev essere diviso nelle sue componenti viene separato in un certo numero di frazioni per centrifugazioni successive, aumentando gradualmente il campo centrifugo applicato» N.B. :Alla fine di ogni centrifugazione solo il pellet viene lavato, risospeso e ricentrifugato

37 Centrifugazione differenziale la centrifugazione di una sospensione di particelle per un tempo determinato provoca la formazione di un sedimento e di un sovranatante

38 Centrifugazione differenziale

39 » La centrifugazione differenziale e la tecnica piu usata per l isolamento degli organuli cellulari da omogenati di tessuto

40 CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA Metodo che viene usato quando e richiesta una separazione quantitativa di tutti i componenti di una miscela di particelle. Si utilizza una soluzione la cui densità aumenta in gradiente, ma la densita massima non deve superare quella delle particelle piu dense da separare. Tipi di gradiente: a) Continuo b) Discontinuo c) Una barriera di densità a gradino singolo per sedimentare selettivamente una particella

41 Separazione isopicnica su gradiente di densita» Centrifugazione isopicnica: dipende unicamente dalla densita idrostatica della particella

42 SEPARAZIONE ISOPICNICA SENZA GRADIENTE PREFORMATO» Il campione viene mescolato con il mezzo che costituisce il gradiente, anziche stratificarlo in un gradiente preformato

43 Centrifugazione isopicnica Si basa sulla formazione di un gradiente ripido (molte sostanze come il saccarosio o il Ficoll creano dei gradienti durante la centrifugazione). Si mescola il campione da separare con la sostanza appropriata e si centrifuga per il tempo necessario per la formazione dei gradienti. Le particelle sedimentano in funzione della loro densità (si posizionano dove la loro densità è uguale a quella del mezzo).

44 Campo centrifugo Gradiente di densità Centrifugazione zonale Si crea un gradiente poco ripido e le macromolecole si separeranno in funzione della massa ( quelle più grandi si muoveranno più velocemente) A Z Campione Particelle piccole Particelle medie Particelle grandi All inizio le particelle sono stratificate al di sopra del gradiente (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni, della loro densità e della densità del mezzo.

45 MATERIALI PER GRADIENTI DI USO COMUNE E LORO APPLICAZIONI

46 Isolamento e concentrazione di macromolecole La purificazione (e concentrazione) di macromolecole biologiche può essere effettuata mediante ultracentrifugazione in gradiente all equilibrio di densità di cloruro di cesio-bromuro di etidio. DNA circolare chiuso e superavvolto intercala una certa quantità di etidio limitata. In questo caso la molecola assume una forma più compatta, con il conseguente incremento della densità di galleggiamento. Molecole di DNA circolari rilassate e lineari sono invece in grado di intercalare una maggiore quantità di etidio che ne provoca un maggior srotolamento. Di conseguenza il DNA lineare sarà meno denso. Le due differenti forme di DNA possono essere separate mediante ultracentrifugazione in gradiente di densità di CsCl/EtBr, una tecnica di separazione che sfrutta le differenze di densità delle diverse molecole.