07/04/2016. Genetica dei Procarioti - 6. Type IV T4S. scambio genico. rilascio di molecole effettrici (EFFETTORI) a cellule eucariotiche bersaglio

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1 A.A Dipartimento di Scienze della Vita CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6) Type IV T4S correlato all apparato della coniugazione che transloca DNA o substrati proteici attraverso la parete (spesso in relazione alla patogenesi) Genetica dei Procarioti - 6 Prof. Laura Marri ricevimento: previo appuntamento telefonico o I batteri usano il sistema di secrezione di tipo IV (T4S) per due motivi fondamentali: scambio genico rilascio di molecole effettrici (EFFETTORI) a cellule eucariotiche bersaglio 1

2 (a) a model for T-pilus assembly in Agrobacterium tumefaciens VirB4 VirB8 VirB5 VirB2 interaction sequence lead to the formation of VirB2 VirB5 complexes followed by T-pilus assembly (b) transmission electron microscopic image showing T-pili and flagella on A. tumefaciens. Ti è un esempio di plasmide batterico naturale Secretion pathway and structure of the T4S system 2

3 secondary amine derivatives formed by condensation of an amino acid, either with a ketoacid or a sugar Crown gall tumors galla del colletto Also, virulence plasmids from Salmonella, Shigella, Yersinia, Bacillus anthracis, E.coli, and others. 3

4 PLASMIDI MGEs: segmenti di DNA codificanti enzimi o altre proteine che consentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilità intracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare) Elementi genetici mobili (mobile genetic elements, MGEs) Bacterium releasing DNA with plasmids PLASMIDI nella maggior parte dei casi sono molecole di DNA circolari ( kb) ma anche lineari o integrati nel cromosoma batterico (episomi) dal

5 PLASMIDI In un gel di agarosio e bromuro di etidio le tre forme migrano a velocità diverse e possono essere distinte Le forme molecolari circolari superavvolte durante le manipolazioni sperimentali possono rilassarsi o linearizzarsi in seguito a rotture a singolo o a doppio filamento. plasmide superavvolto supercoiled plasmide circolare rilassato forma rilassata forma lineare forma superavvolta forma linerizzata ( tagliata con un enzima di restrizione in un sito unico) nick plasmide linearizzato Large-scale purification of plasmids by cesium chloride density gradient centrifugation old school method of purifying plasmid since the 1950s Three forms of plasmid DNA hrs during this time, the CsCl forms a gradient and the molecules migrate according to their density until they float at their individual isopycnic points (the point in the gradient that equals the buoyant density of the molecule). 5

6 Replicazione plasmidica Replicazione plasmidica La capacità di replicarsi autonomamente è conferita loro dalla presenza di una origine di replicazione, ori (oriv, ori vector ) host protein un plasmide deve contenere un origine per la replicazione del DNA P1 richiedono proteine plasmidiche e/o dell ospite batterico REPLICONI Plasmid replication circolo rotante replicazione (uni o bi-direzionale) 1. Plasmid replication requires host DNA replication machinery. 2. Most wild plasmids carry genes needed for transfer and copy number control. 3. All self replication plasmids have a oriv: origin of replication 4. Some plasmids carry and orit: origin of transfer. 5. There are 5 main incompatibility groups of plasmid replication. Not all plasmids can live with each other. 6. Agents that disrupt DNA replication destabilize or cure plasmids from cells. 6

7 Funzioni dell origine di replicazione NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE I plasmidi si replicano con due modalità diverse Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l origine di replicazione oriv controlla: Il numero di copie La specificità d ospite I gruppi di incompatibilità Alcuni, generalmente quelli di grandi dimensioni, si replicano in maniera coordinata con la replicazione del cromosoma batterico e si dicono sottoposti a controllo stringente In genere sono presenti in una o poche copie per batterio. NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE Altri, in genere di piccole dimensioni, si replicano in maniera indipendente dalla replicazione batterica e si dicono sottoposti a controllo rilassato Sono presenti in molte copie - fino a per batterio. Plasmidi ori N. di copie PUC e derivati ColE pacyc e derivati p15a psc101 e derivati Psc

8 8 H I H G C O P Y N U M B E R Sistema di ripartizione L O W C O P Y N U M B E R Sistema di ripartizione Bacterial plasmids encode partitioning (par) loci that ensure ordered plasmid segregation prior to cell division

9 Plasmid R1 was first isolated from Salmonella paratyphi Plasmid R1-encoded ParMRC plasmid segregation system. The parmrc operon. parc is composed of two blocks of five short repeats, which are interrupted by a 39 bp region containing the promoter for parm and parr (PMR). ParR, an adaptor protein, binds to parc and represses transcription. ParM forms short filaments in the presence of ATP, which either undergo catastrophic disassembly following ATP hydrolysis to ADP plus inorganic phosphate (Pi), or ParR, an adaptor protein, binds to parc and represses transcription. become capped by a ParR parc complex and undergo stable bipolar elongation. Plasmids ParR ParM 9

10 In vitro polymerization of cytoskeletal proteins of the MinD/ParA superfamily (A) Formation of MinD filament bundles in the presence of MinE, and ATP Actina-omologo (B) Formation of a ParA (ParM) filament bundle in the presence of ParB (ParR), and ATP Controllo del numero di copie I plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l inizio della replicazione plasmidica inibizione mediante RNA + proteina dell inizio della replicazione 10

11 Plasmidi Col: conferiscono un vantaggio al batterio portatore nei confronti di batteri della stessa specie o specie affini codificano per le batteriocine (scoperte da André Gratia nel 1925) capaci di permeabilizzare le membrane o degradare gli acidi nucleici La maggior parte dei vettori di clonaggio derivano dal plasmide ColE1 11

12 Controllo del numero di copie RNA II Rnasi H ori la replicazione è innescata da un primer (RNA II), trascritto da un promotore situato 550 bp a monte di oriv. Gli ibridi DNA:RNA formati dal filamento di DNA e dall RNA II nascente, costituiscono un substrato per la Rnasi H che taglia l ibrido e fornisce l OH al 3 per la replicazione del DNA. RNA II è controllato da RNA I, trascritto sul filamento opposto della stessa regione di DNA e, quindi, complementare a RNA II. RNA I-RNA II compete con l appaiamento tra RNA II e il filamento stampo, riducendo la frequenza di inizio della replicazione. Il prodotto del gene rop stabilizza il complesso RNA I-RNA II, riducendo ulteriormente la frequenza di inizio. P-II Replicazione del plasmide ColE1 RNA II is required for priming DNA synthesis at the origin. Positive regulation RNA II RNA polimerasi RNA II RNA I P-I origin RNA I ori rop RNA I (108 b) P-I & P-II: promotori RNA I è complementare a RNA II 12

13 Funzioni dell origine di replicazione Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l origine di replicazione oriv controlla: Il numero di copie Lo spettro d ospite I gruppi di incompatibilità SPETTRO D OSPITE Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di specie batteriche e si dicono a specificità d'ospite limitata : narrow host range Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche e si dicono a largo spettro d'ospite: broad host range, BHR I plasmidi BHR derivano questa loro proprietà dal possesso di funzioni per il riconoscimento dell' origine di replicazione, dipendono meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico Funzioni dell origine di replicazione Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l origine di replicazione oriv controlla: Il numero di copie La specificità d ospite I gruppi di incompatibilità 13

14 GRUPPI DI INCOMPATIBILITA Plasmidi con la stessa origine di replicazione sono incompatibili tra loro. Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni. Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi verrà perso. GRUPPI DI INCOMPATIBILITA INCOMPATIBILITA PLASMIDICA Plasmidi con la stessa origine di replicazione sono incompatibili tra loro. Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni. Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi verrà perso. Possono invece coesistere plasmidi con origine di replicazione diverse che appartengono a diversi gruppi di incompatibilità 14

15 Plasmidi coniugativi e non coniugativi MARCATORI SELEZIONABILI I plasmidi naturali a volte veicolano uno o più geni non essenziali capaci di conferire loro un vantaggio selettivo in alcune situazioni. Per essere coniugativo un plasmide deve possedere: Una specifica regione di riconoscimento chiamata Ori T (origine di trasferimento) I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus tra (trasferimento) Per es. possono codificare per tossine o resistenza agli antibiotici una delle funzioni tra: sintesi del pilo coniugativo 15

16 Plasmidi coniugativi e non coniugativi plasmidi privi di queste funzioni geniche non sono trasmissibili Plasmidi coniugativi e non coniugativi se un plasmide possiede un Ori T può essere trasferito per coniugazione utilizzando funzioni helper che forniscono, in trans, i prodotti genici mancanti Tuttavia... Distribution of conjugative, mobilizable, and nonconjugative plasmids according to plasmid size Schematic view of the genetic constitution of transmissible plasmids. MPF: mating pair formation T4CP: Type IV coupling proteins Smillie C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74: Smillie C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74:

17 Escherichia coli S17-1 λpir è in grado di mobilizzare plasmidi non coniugativi in batteri Gram-negativi grazie all integrazione stabile nel proprio cromosoma dei geni codificanti per le funzioni di trasferimento derivate dal plasmide RP4 che agiscono sulla sequenza orit presente sui plasmidi mobilizzabili Escherichia coli S17.1 λpir geni tra orit coniugazione plasmide Ricevente MGEs: segmenti di DNA codificanti enzimi o altre proteine che consentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilità intracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare) 17

18 1. Plasmid replication requires host DNA replication machinery. 2. Most wild plasmids carry genes needed for transfer and copy number control. Sistemi di cattura di MGE dagli ambienti naturali 3. All self replication plasmids have a oriv: origin of replication 4. Some plasmids carry and orit: origin of transfer. 5. Plasmid segregation is maintained by a par locus-a partition locus that ensures each daughter cells gets on plasmid. Not all plasmids have such sequences. 6. There are 5 main incompatibility groups of plasmid replication. Not all plasmids can live with each other. Metodo endogeno ricerca di plasmidi in batteri coltivabili 7. Agents that disrupt DNA replication destabilize or cure plasmids from cells. Sistemi di cattura di MGE dagli ambienti naturali Metodo esogeno sfrutta il potenziale di trasferimento degli MGE etc., etc., etc. 18

19 SISTEMI DI CATTURA DI MGE metodo esogeno metodo esogeno A comunità microbica donatrice di MGE A: INCROCI BIPARENTALI B: INCROCI TRIPARENTALI INCROCI BIPARENTALI marcatore selezionabile ceppo ricevente SISTEMI DI CATTURA DI MGE metodo esogeno B comunità microbica donatrice di MGE INCROCI TRIPARENTALI ceppo donatore con un plasmide mob + marcatore selezionabile ceppo ricevente 19

20 se un plasmide possiede un Ori T può essere trasferito per coniugazione utilizzando funzioni helper che forniscono, in trans, i prodotti genici mancanti I plasmide coniugativo?? III II plasmide mobilizzabile marcatore selezionabile ricevente Sistemi di cattura di MGE dagli ambienti naturali SISTEMI DI CATTURA DI MGE Metodo esogeno sfrutta il potenziale di trasferimento degli MGE PCR PCR metodo esogeno che individua sequenze specifiche di un MGE in DNA proveniente da comunità microbiche 20

21 Studying Plasmid Horizontal Transfer In Situ Various reporter genes have been used to examine HGT, including the luciferase genes luxab, the β-galactosidase gene lacz and genes encoding fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). Only fluorescence genes have been used for the in situ detection of HGT in natural environments, as no substrate has to be added to detect the product of the expressed reporter gene 21

22 LacI repressible promoter GFP Plasmide coniugativo gene reporter Horizontal gene transfer (HGT) in the phyllosphere I biofilms offrono una nicchia ideale per lo scambio di DNA extracromosomico (plasmidi) confocal scanning laser micrographs showing green fluorescent transconjugant cells in the interstices of epidermal cells (a) and inside a stoma (b) of a bean leaf. 22